Th17细胞相关细胞因子与急性移植物抗宿主病关系的探讨

Th17细胞相关细胞因子与急性移植物抗宿主病关系的探讨凌艳英;周铭;王阿慧;江雪杰;李庆山
【摘要】Objective To explore the relationship of cytokones associated with Th17 cells in serum and acute graft-versus-host disease from patients with hematologic diseases who were undergone al-logeneic hematopoietic stem cell transplantation. Methods In this study,78 patients with haemato-logical diseases were undergone allogeneic hematopoietic stem cell transplantation. Th17 cell-associ-ated cytokines in serum were examined by enzyme linked immunosorbent assay(ELISA)from pa-tients with acute graft-versus-host disease(aGVHD)(n=12),without aGVHD(n=14),and patients with aGVHD who were effectively treated(n=10). Healthy volunteers (n=10) were severed as control. Results ①The serum cytokine levels(pg/mL)of patients with aGVHD(n=12)were signifi-cantly higher compared with healthy control group(n=10)and non-aGVHD
group(n=14)(P<0. 05). On contrary,The TGF-β1 level(pg/mL)(1 156. 61 ± 458. 04) was significantly lower than the healthy control group(2 978. 34 ± 1 647. 71)and non-aGVHD group(2 541. 62 ± 1 805. 16)(P<0. 05). IL-
22:non-aGVHD group was significantly higher than healthy control
group(22. 14±2. 49, 19. 18±1. 24)(P<0. 05);IL-21,IL-22,IL-23 were higher than healthy control group(P<0. 05), there was no statistical difference about other cytokines between healthy control group and non-aGVHD group(P>0. 05).②After treatment,the cytokine levels above in 10 cases of effective treatment decreased to considerable extent ,and there was
significant difference between before and after effective treatment(P <0. 05),but the IL-22 showed no significant difference between before and after effective treatment (P>0. 05). Conclusion Th17 cell-associated cytokines(IL-17, IL-23,IL-21,IFN-γ,TGF-β1)in serum are assocoated with pathogenesis,development and treat-ment efficacy of aGVHD,whereas acute GVHD is no relationship with IL-22 cencentration in serum.%目的：探讨异基因造血干细胞移植治疗血液系统疾病后，血清中Th17细胞相关的细胞因子与急性移植物抗宿主病的关系。

方法78例血液病患者进行异基因造血干细胞移植，对移植后发生急性移植物抗宿主病患者（n=12），未发生急性移植物抗宿主病患者（n=14），及健康对照组（n=10），以及发生急性移植抗宿主病患者（n=10）在有效治疗前后，采用酶联免疫吸附法检测血清中细胞因子IL-17、IL-23、IL-21、IFN-γ、TGF-β1、IL-22浓度。

结果①aGVHD者（n=12）血清中Th17细胞相关因子浓度（pg/mL）较正常对照组（n=10）和无aGVHD组（n=14）显著增高，差异有统计学意义（P<0.05）；而TGF-β1（1156.61±458.04）显著低于正常对照组（2978.34±1647.71）和无aGVHD组（2541.62±1805.16），差异有统计
学意义（P<0.05）。

IL-22：未发生aGVHD组高于健康对照组（22.14±2.49，19.18±1.24），差异有统计学意义（P<0.05）；除IL-21、IL-22和IL-23浓度高于健康对照组外（P<0.05），其余的细胞因子健康对照组和无急性aGVHD组差
异无统计学意义（P>0.05），aGVHD组血清IL-22浓度与无aGVHD和健康对
照组比较，差异无统计学意义（P>0.05）。

②10例有效治疗者，治疗后均有降低，治疗前后差异有统计学意义（P<0.05），而IL-22在有效治疗前后差异无统计学
意义（P>0.05）。

结论 Th17细胞相关的细胞因子与（IL-17、IL-23、IL-21、
IFN-γ、TGF-β1）与aGVHD的发生发展和疗效有关，而与IL-22无关。

【期刊名称】《江汉大学学报（自然科学版）》
【年(卷),期】2014(000)004
【总页数】6页(P63-68)
【关键词】移植物抗宿主病;急性;细胞因子;Th17细胞;调节性T细胞
【作者】凌艳英;周铭;王阿慧;江雪杰;李庆山
【作者单位】广州医科大学附属广州市第一人民医院检验科血液室;广州医科大学附属广州市第一人民医院血液科广东广州 510180;广州医科大学附属广州市第一人民医院检验科血液室;南方医科大学附属南方医院血液科广东广州 510515;广州医科大学附属广州市第一人民医院血液科广东广州 510180
【正文语种】中文
【中图分类】R593
急性移植物抗宿主病（acute graft-versus-host diseae，aGVHD）是异基因造血干细胞移植（allogeneic hematopoietic stem cell transplantation，Allo-HSCT）后的主要并发症，Allo-HSCT可望治愈肿瘤性或者非肿瘤性血液疾病，但是aGVHD可以引起移植患者早期死亡［1］。

以往研究aGVHD的病理生理过程主要集中在Th1和IFN-γ作用介导aGVHD的发生，然而最近的研究报道显示，抑制Th1分化或者中和IFN-γ反而导致更加严重的aGVHD［2-3］，因此，Th1介导的aGVHD理论面临着挑战，应该还存在一类不同于Th1细胞的其他新型的Th细胞在aGVHD中发挥重要作用。

虽然动物实验移植模型中经典的理论认为aGVHD是Th1细胞介导的，但是目前认为新型的产生特征性细胞因子IL-17A的T细胞亚群（Th17细胞）和调节性T细胞（Tregs）在aGVHD中发挥着重要作用。

研究发现肾、心实体器官移植，出现排斥与供体器官中Th1∕17细胞的富集有关，异源性抗原或者自身抗原产生的免疫反应的类型，与移植器官中Th17、Th1∕17
或者Th22产生的细胞因子有关［4］，而目前对于Allo-HSCT后Th1、Th17细
胞重建与移植排斥及aGVHD发生尚缺乏试验及临床研究。

因此Th1、Th2、Th17、Tregs间的精密平衡是移植后aGVHD的发生、严重程
度和特定组织损害的重要因子，故笔者拟探讨血清中Th17细胞相关细胞因子与aGVHD的关系。

1.1 患者一般资料
研究患者来自2010年1月至2013年10月住院的78例各类血液病患者，其中
男性45例，女性33例，中位年龄38（11～56）岁。

重型再生障碍性贫血（SAA）为初治或者免疫抑制治疗无效者，骨髓增生异常综合征（MDS）为RAEB-2化疗后达到完全缓解（CR），余为RAEBT-1型或者RCMD型初治者，
非何杰金氏淋巴瘤（NHL）或者多发性骨髓瘤（MM）为化疗达到部分缓解（PR）或者CR，慢性粒细胞白血病病—慢性期（CML-CP）和原发性骨髓纤维化为初治者，其余急性淋巴细胞白血病（ALL）和急性髓细胞白血病（AML）均为第一个缓解期（CR1），诊断及疗效标准见文献［5］。

HLA配型采用测序新技术PCR-SBT（sequencing based typing）或者PCR-SSP（sequence specific primer）方法，HLA-A、B、C、DR、DQ、DP位点高分辨配型。

诊断与造血干细胞来源
及配型情况见表1。

造血干细胞来源为单纯骨髓、单纯外周血或者骨髓联合外周血。

aGVHD：aGVHD的诊断及严重程度根据国际标准进行［6］。

1.2 治疗方法
预处理方案见表1。

1.2.1 aGVHD的预防同胞供者采用CSA联合短程MTX的方案：CSA（-3 d起）静脉滴注维持16h，3mg（∕kg·d），能够口服时改口服，移植后100 d内维持全
血血药浓度200～400 μg∕L。

MTX采用经典短程的方案：15 mg∕m2（+1 d、+3 d、+6 d），10 mg∕m（2+11 d）。

血缘关系半相合及非血缘关系移植采用上述方案，或者加上酶酚酸酯（骁悉）（mycophenolate mofetil，MMF）0.5 g bid（-1 d～+30 d）。

1.2.2 植入证据的检测性染色体、ABO血型、微卫星法DNA指纹图，按照以往的检测方法，选取微卫星DNA位点，采用降落法PCR（TDPCR）扩增，80 g∕L聚丙烯酰胺凝胶电泳［7］和高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC），供受者性别不同者采用FISH方法检测骨髓XX∕XY 性染色体的比例。

1.2.3 ELISA法检测血清细胞因子抽取正常健康人及患者的外周血2mL，使用血清分离管，凝固至少30 min，然后1 000 g离心10 min。

分离血清层保存在-80℃冰箱，检测时避免反复冻融。

血清中细胞因子IL-17A、IFN-γ、TGF-β、IL-21、IL-23、IL-22试剂盒（购自美国Biolegend公司），操作按照说明书进行。

1.3 统计学方法
所有计量资料采用均值加减标准差（xˉ±s）表示，两组间均值比较，先进行方差齐性F检验，若方差齐，采用独立样本t检验，方差不齐，改用t′检验；自身对照均值比较，采用配对t检验；多组间均值的比较，采用单因素方差分析，若方差齐采用F检验进行总体均值比较、SNK法进行均值两两比较，方差不齐时采用Welch检验进行总体均值比较、Dunnett T3法进行均值两两比较。

均由
SPSS16.0进行统计分析，α=0.05。

采用ELISA法，对发生aGVHD患者的血清，进行了Th17细胞相关的细胞因子（IL-17、IL-23、IL-21、IFN-γ、TGF-β1、IL-22）检测，无aGVHD者和正常者作为对照组，结果发现（见表2，表3），除IL-22和IL-23无aGVHD组高于健
康对照组外（P＜0.01），其余细胞因子无aGVHD组与健康对照组比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）；aGVHD组IL-17、IL-23、IL-21、IFN-γ浓度均高于健康对照组（P＜0.01）和无aGVHD组（P＜0.05）；aGVHD组与健康对照组和无aGVHD组比较，血清TGF-β1水平则明显下降，差异有统计学意义（P＜
0.05）。

而IL-22在健康对照组、无aGVHD组和aGVHD组均呈低水平的分泌，虽然无aGVHD组的水平高于健康对照组，差异有统计学意义（P＜0.01），但是aGVHD组与健康对照组和无aGVHD组比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。

为进一步观察上述细胞因子和aGVHD的转归关系，笔者检查了10例aGVHD治疗有效者在治疗前后的细胞因子变化，结果发现（见表2，表3）：IL-17、IL-23、IL-21、IFN-γ细胞因子浓度有效治疗后显著下降，差异有统计学意义（P＜0.05）。

而TGF-β1明显回升，差异有统计学意义（P＜0.05），IL-22血清浓度，在有效
治疗前后均呈现低水平的分泌，治疗前后差异无统计学意义（P＞0.05）。

Th17细胞产生特征性的细胞因子：IL-17（IL-17A）、IL-17F、IL-21和IL-22，Th17细胞分化需要TGF-β和IL-6，维持Th17表型稳定需要IL-23、TNF和IL-
1β，然而Th17的扩增主要依赖于IL-21。

对于Th17在异基因造血干细胞移植时aGVHD发病中的作用，动物实验模型研究得出了不同的结论，一些资料认为
Th17起到保护作用，而一些资料则认为其在aGVHD的发病中起到致病作用［8-10］。

在人造血干细胞移植的回顾性研究中，也存在一些分歧，一些研究发现在
外周血或者发生aGVHD的组织中Th17细胞增加［11-12］，而另外的研究则发现在损害靶器官中是减少的［13］。

尽管在鼠模型中Th17细胞的作用得到了广
泛研究，但是在患者进行异基因造血干细胞移植后，Th17细胞相关的细胞因子表达在aGVHD中的作用仍然值得研究。

由于Th17细胞与Th1和Tregs的发育相互制约和相互转化［14-15］，在Th1
和Th17细胞共同促进aGVHD发生［16］，故本研究在进行Th17相关细胞因子
检测的同时，也对Th1和Tregs相关的细胞因子也进行了检测，包括：IL-17、
IL-21、IL-22、INF-γ和TGF-β1。

结果发现，IL-17、IL-21和IL-23在发生aGVHD时显著高于未发生aGVHD组和正常对照组；而其中治疗有效的患者在治疗缓解后，上述细胞因子则显著下降，表明IL-17、IL-21在aGVHD发病中发挥
作用，而IL-23在维持Th17功能中发挥作用，进一步促进了Th17在aGVHD中的致病作用。

动物研究发现中和或者阻断T细胞的IL-21信号通路减少了aGVHD 发生［17-18］，试验研究发现阻断IL-23信号通路，减轻了结肠aGVHD的发生，有效分离aGVHD和移植物抗白血病（graft-versus-leukemia，GVL）效应，IL-23可能作为治疗aGVHD的靶点［19-20］。

最近采用的Ustekinumab（结合于IL-12和IL-23的p40亚单位）能够成功治疗糖皮质激素耐药的aGVHD［21］，均有力支持本研究中细胞因子动态观察结果。

在笔者的研究中，血清中Th1细胞分泌的细胞因子IFN-γ在发生aGVHD组均较
无aGVHD组和正常对照组高，而有效治疗后则显著下降，表明了Th17和Th1
细胞在aGVHD的发病中协同作用，YuY等［22］发现基因修饰T-bet和RORγt 的小鼠Th1或者Th17细胞分化转录因子不能减轻aGVHD，同时敲除T-bet和RORγt基因则减轻了aGVHD的发病，进一步证明了Th1和Th17细胞的协同作
用［23］。

但是国内王静等［24］研究发现，aGVHD患者血浆标本中IFN-γ浓
度高于正常对照组和无aGVHD组，在aGVHD有效治疗后血浆中浓度有降低但
是差异无统计学意义，与本组结果不同，可能与本组为血清标本、aGVHD的严重程度可能不同、以及获取标本的时间可能有差异等有关。

在Th1和Th17细胞的失衡与aGVHD严重程度的关系研究中，Pan B等［16］
在小鼠的模型中发现外周血中Th1∕Th17细胞比值的增高，aGVHD的程度加重，可能与Th1细胞在aGVHD发病中占据主导地位有关［23］，但是目前无临床相
关报道。

因而将aGVHD归于Th1或者Th17都是过于简单化，aGVHD的发病是
Th1和Th17的协同作用，有待临床研究证实。

在造血干细胞移植后，T细胞免疫重建中存在同时产生IL-17和IFN-γ的Th1∕17细胞，“Th1∕17”表型细胞有向Th1分化的可塑性，有助于Th1反应，在aGVHD发病中Th1细胞是主要作用，Th17细胞是次要作用，不排除Th17促进aGVHD的发生，不体现在其数量上的扩增，而是通过向Th1细胞的分化。

本研究发现，与IL-17的变化趋势相反，无aGVHD者血清IL-22水平略高于健康对照组，差异有统计学意义，但是无aGVHD者和aGVHD患者血清水平差异无统计学意义，有效治疗前后差异无统计学意义，均呈低水平分泌，IL-22主要在Th1和Th17中表达，最近的一项研究显示IL-22可以保护肠道干细胞免受炎症介导的组织损伤，从而减轻aGVHD的发生［25］，在小鼠的移植研究中发现，IL-22基因敲除的供者T细胞移植减轻了aGVHD，保留了GVL效应［26］，但其在aGVHD发病中的作用有待进一步研究。

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