促吸收剂癸酸钠对黄连素在大鼠肠道吸收的促进作用

促吸收剂癸酸钠对黄连素在大鼠肠道吸收的促进作用
杜函泽;吕晓艳;杜红伟;孟昭杰;陈晗;陈立;赵珩
【摘要】目的:探讨黄连素(Ber)在大鼠肠道的吸收动力学,阐明癸酸钠(SC)对Ber 在小肠段吸收的影响.方法:雄性Wistar大鼠建立在体肠段灌流模型,HPLC法测定不同浓度Ber(50、100和200 μmol·L-1)和Ber与质量浓度为0.2%SC合用在小肠的吸收情况;测定肠灌流液中乳酸脱氢酶(LDH)活性,观察SC对肠道黏膜细胞的损伤.结果:Ber浓度在50～200 μmol·L-1范围内Ber吸收呈浓度依赖性;吸收速率常数(Ka)组间差异无统计学意义(P>0.05);SC能显著提高Ber在小肠的吸收量
(P<0.05);SC对Ber吸收速率常数Ka无显著影响(P>0.05);Ber组、SC+Ber组肠循环液中LDH的含量与空白对照组比较差异无统计学意义(P>0.05).结论:Ber在小肠吸收较差,吸收机制为被动扩散,吸收过程为一级动力学过程;SC能显著促进Ber 在小肠的吸收,是一种安全、有效的促吸收剂.
【期刊名称】《吉林大学学报（医学版）》
【年(卷),期】2011(037)001
【总页数】6页(P35-40)
【关键词】癸酸钠;黄连素;大鼠,Wistar;小肠;吸收动力学
【作者】杜函泽;吕晓艳;杜红伟;孟昭杰;陈晗;陈立;赵珩
【作者单位】吉林大学白求恩医学院珠江医院眼科,吉林,长春,130021;吉林大学白求恩医学院珠江医院眼科,吉林,长春,130021;吉林大学第一医院干部病房,吉林,长春,130021;吉林大学白求恩医学院珠江医院眼科,吉林,长春,130021;南方医科大学
珠江医院眼科,广东,广州,510515;吉林大学白求恩医学院珠江医院眼科,吉林,长
春,130021;吉林大学第一医院干部病房,吉林,长春,130021
【正文语种】中文
【中图分类】R333.3
黄连素(berberine,Ber)是一种传统中药，长期以来作为一种广谱抗菌药治疗肠道
细菌感染性疾病应用于临床。

近年来研究[1-4]显示：Ber具有广泛药理作用，对
心律失常、高血压、糖尿病、高血脂等多种疾病均有很好的疗效，因此对Ber新
用途的开发有较大发展空间及市场潜力。

但Ber最根本的问题是其生物利用度很低，约为5%[5]，口服用药难以达到有效血药浓度，且用量过大胃肠道副作用明显，大大限制了其临床应用。

目前国内外学者多关注于Ber新药理作用的研究，其肠
道吸收动力学资料较为匮乏。

如何改善Ber在肠道的吸收，提高其生物利用度成
为目前亟待解决的问题。

癸酸钠(sodium caprate,SC)是一种低毒而有效的吸收促进剂，并已作为栓剂用于临床[6]，是唯一批准可以在商品中使用的脂肪酸盐类促
吸收剂[7]。

本实验应用肠吸收促进剂SC与Ber合用，通过在体肠道灌流实验，
较详细地观察Ber的肠道吸收情况及SC对Ber肠道吸收的促进作用，为指导探索和开发较易吸收的口服新型Ber制剂提供理论依据。

1 材料与方法
1.1 实验动物
健康雄性Wistar大鼠35只，雄性，体质量(250±30) g，由吉林大学实验动物中
心提供，合格证号：2003-0001。

1.2 主要药品、试剂及仪器
Ber原料药购自东北制药总厂，纯度>99.8%；Ber标准品为中国生物检定所产品；
SC购自Sigma公司。

酚红购自上海生工，乌拉坦购自中国医药集团上海试剂公司，乙腈(色谱级) 购自江苏汉邦科技有限公司，醋酸铵(色谱级) 购自江苏汉邦科技有限公司，其他试剂均为分析纯。

高效液相色谱仪(Agilent 1100 series)；紫外检测器(Waters)；N-2000双通道色谱工作站(Breeze)；HL-2恒流泵(保定兰格恒流泵有限公司)；紫外线分光光度计(上海精密科学仪器有限公司)；三用恒温水箱(江苏省
金坛市荣华仪器制造有限公司)。

1.3 酚红紫外分光光度分析方法的建立
1.3.1 酚红标准曲线的建立精密吸取酚红标准储备液(560 μmol·L-1)0.5、1.0、
1.5、
2.0、2.5和
3.0 mL于10 mL容量瓶中，得28、56、84、112、140和
168 μmol·L-1系列浓度酚红溶液，分别吸取0.5 mL，加入0.2 mol·L-1 NaOH
溶液5 mL显色，在波长557 nm处以0.2 mol·L-1 NaOH溶液为空白对照，测
定吸收度(A)值。

以A值为纵坐标,酚红浓度C为横坐标做线性回归，得标准曲线
方程：A=0.0058C-0.0092(r=0.9999)，曲线线性关系良好。

1.3.2 肠循环液中酚红含量的测定精密吸取大鼠在体肠循环液0.5 mL，加入0.2 mol·L-1氢氧化钠溶液5 mL。

按上述方法测定吸收度，计算酚红浓度。

1.4 Ber高效液相色谱分析方法的建立
1.4.1 色谱分析条件色谱柱：Zorbax Extend- C18；(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相：10 mmol·L-1醋酸铵(0.1%甲酸)∶乙腈=72∶28；用孔径为0.45 μm微
孔滤膜过滤器过滤后超声脱气；流速：1.2 mL·min-1；柱温：室温；检测波长：346 nm；进样量：20 μL。

分别取空白肠循环液、Ber标准品及样品，在上述色谱条件下测定，Ber的保留时间约为5 min。

样品的主峰保留时间与标准品对照液一致，PBS缓冲液对Ber的
测定无干扰。

色谱图见图1。

图1 肠循环液中Ber的HPLC色谱图Fig.1 HPLC chromatogram of Ber in the
circulating fluidA:Blank intestinal circulation solution;B:Standard sample
(0.1 mg·L-1) in PBS; C:Sample solution.
1.4.2 标准曲线和线性范围将Ber标准品(相对分子质量为371.82)用含酚红PBS
溶液配制成浓度分别为0.1、0.3、1、5、15、30和60 μg·mL-1系列溶液，在上述色谱条件下测定，以峰面积S对浓度C做线性回归，绘制标准曲线：S=
31.763C-1.4038(r=0.9996)，Ber在0.1～60.0 μg·mL-1范围内线性关系良好。

1.4.3 HPLC方法的精密度与准确度分别取0.3、5.0和30.0 μg·mL-1 3个浓度的Ber PBS溶液，每一浓度进行6样本分析，连续测定3 d，并与标准曲线同时进行测定，计算样品的浓度，与配制浓度对照，计算测定方法的准确度与精密度。

测得日内平均RSD分别为0.76%、0.62%和0.85%，日间RSD 分别为0.93%、0.87%和1.30%。

结果见表1。

表1 HPLC方法检测Ber精密度及回收率Tab.1 The precision and recovery rate of Ber in PBS using HPLC determination(n=6)Drug
Concentration(mg·L-1) Added Found RSD (η/%) Intra-day Inter-day RE(η/%) 0.30 0.30 0.76 0.93 -0.31Ber 5.00 5.00 0.62 0.87 0.22 30.00 29.76 0.85 1.30 -
0.53
1.4.4 肠循环液中Ber浓度的测定大鼠在体肠循环液样品经0.45 μm微孔滤膜过
滤后，精确吸取20 μL，按1.4.1色谱条件进样测定，代入标准曲线公式计算Ber 浓度。

1.5 实验分组
35只大鼠随机分为7组(每组5只)：空白对照组、Ber低剂量组(50 μmol·L-1)、中剂量组(100 μmol·L-1)、高剂量组(200 μmol·L-1)，Ber低剂量加SC组(50
μmol·L-1+0.2%SC)、Ber中剂量加SC组(100 μmol·L-1+0.2%SC)、Ber高剂量加SC组(200 μmol·L-1+0.2%SC)。

1.6 在体肠循环实验
按参考文献[8]方法，大鼠禁食16 h后，腹腔注射20%乌拉坦溶液(5 mL·kg-1)麻醉、固定。

沿腹中线打开腹腔，结扎胆总管，在十二指肠上端和回肠下端各剪开一个小口，37℃生理盐水冲洗干净，两开口端插管并结扎，与恒流泵连接形成回路。

37℃恒温的PBS液以5 mL·min-1速度循环20 min，空气排净循环系统内PBS 液，用37℃恒温供试药液100 mL以5 mL·min-1的速度循环10 min，继之以1 mL·min-1的速度循环，计时开始。

供试液为含酚红56 μmol·L-1和Ber或Ber
加SC的PBS缓冲液。

于循环0、0.5、1.0、2.0、3.0和4.0 h取回流液1.5 mL，同时补充等量56 μmol·L-1酚红溶液。

测定各时间点回流液中酚红和Ber在肠循
环液中浓度。

药物在肠道吸收量及吸收速率常数(Ka)的计算：分别测定出样品中Ber和酚红的浓度后，由酚红浓度计算出供试液的体积(V)，根据每一时间点药物浓度(C)和供试液体积(V)计算出肠循环液中的剩余药量(X)，以ln X 对取样时间进行回归，所得方
程的斜率即为吸收速率常数Ka(h-1)。

由4 h剩余药量的变化值对零时间剩余药量的比求出4 h药物吸收百分率。

药物吸收百分率=(供试液总药量-剩余药量)/供试
液总药量×100%。

1.7 肠循环液中乳酸脱氢酶(LDH)含量测定
按照LDH试剂盒说明书操作，以绝对吸收度A值为纵坐标，LDH活力单位为横
坐标做线性回归，得标准曲线方程：A=0.0002C+0.0071(r=0.9997)，线性关系
良好。

在体肠循环实验取得的标本各20 μL，按照试剂盒说明书步骤操作，测得绝对A值，代入标准方程计算其样品中LDH活力。

1.8 统计学分析
采用SPSS 10.0统计学软件进行统计学分析。

Ka、LDH和 Ber肠道吸收量以±s
表示，各组间比较采用t检验。

2 结果
2.1 大鼠在体肠循环Ber吸收量
在50～200 μmol·L-1内Ber吸收呈浓度依赖性和时间依赖性，高、中、低3个
浓度4 h Ber吸收百分率分别为9.3%、10.0%和10.2%，表明Ber肠道吸收较差。

Ber高、中、低3个浓度小肠吸收量见表2。

以Ber在肠循环液中剩余药量的对数值对取样时间做线性回归，其斜率为吸收速率常数Ka，Ber高、中、低3个浓度
吸收速率常数Ka 依次为：0.034、0.036和0.045 h-1， Ka值基本保持不变，组间比较差异无统计学意义(P>0.05)，且r值均>0.9，表明Ber浓度对数的下降与
循环时间存在线性关系。

在该浓度范围内Ber的吸收动力学为一级吸收，吸收方
式为被动扩散。

见表3。

SC对Ber高、中、低3个剂量组均有明显的促吸收作用。

4 h时Ber吸收百分率
分别为18.5%、13.1%和20.1%。

其中以低剂量组(50 μmol·L-1)促吸收作用最为明显，2组各时间点的吸收量均差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。

4 h时SC 对不同浓度Ber累积吸收量均高于相应对照组。

SC对Ber吸收速率常数Ka无显
著影响，各组间差异均无统计学意义(P>0.05)。

见表3。

上述结果表明SC对Ber
肠道吸收的影响只是增加其吸收程度，对其吸收速度影响很小。

表2 各组Ber肠道吸收量Tab.2 The absorbed amount of Ber from the circulating fluid in various groups (n=5,±s，m/ng)Group Absorbed amount of Ber(t/min) 30 60 120 180 240Low Ber 173.3±12.8 146.4±41.6 211.1±57.3 246.6±55.1 272.7±50.0Low Ber+SC 343.7±27.6∗ 467.0±38.0∗∗
501.5±39.2∗ 503.6±24.5∗ 503.6±24.5∗ Middle Ber 372.8±72.1 540.5±98.2 571.9±96.1 592.6±49.6 654.1±86.1Middle Ber+SC 486.6±63.4 565.5±33.8 662.7±53.0 896.6±78.9△ 987.3±179.8△High Ber 756.9±166.4 965.9±155.6 1 275.5±257.4 1 680.6±128.11 798.2±261.8 High Ber+SC 1 493.3±367.2#
1833.7±330.2# 1 907.7±416.1 2 233.4±399. 5 2 333.1±279.3#* P<0.05,** P<0.01 compared with low Ber group;△ P<0.05 compared with middle Ber group;# P<0.05 compared with high Ber group.
表3 Ber在体小肠吸收速率和吸收率的检测结果Tab.3 The determination results of Ka and absorption rate of Ber in situ in small intestine of
rats(n=5)Group Ka(t/h)Absorption rate(η/%)Low Ber 0.034±0.0065 9.3Low Ber+SC 0.039±0.0054 18.5Middle Ber 0.036±0.0048 10.0Middle Ber+SC 0.040±0.0076 13.1High Ber 0.045±0.0095 10.2High Ber+SC 0.047±0.0064 20.1
2.2 肠循环液中LDH含量测定
随着肠道灌流时间的增加，各实验组肠循环液中LDH的含量也在不断增加，Ber 组、SC+Ber组肠循环液中LDH的含量与空白对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)，SC+Ber组与Ber组比较差异亦无统计学意义(P>0.05)，表明Ber、SC对肠道细胞无明显损伤作用。

见表4。

表4 大鼠肠循环液中LDH活性的测定Tab.4 The detection of LDH activity in the intestinal circulating fluid in rats(n=5,±s,λB/IU·L-1)Group LDH Pre 0 min 30 min 60 min 120 min 180 min 240 minBlank 67.6±12.0 301.5±23.0 1 194.5±61.0 1 576.6±239.0 2636.8±209.0 3 547.6±168.0 3 368.1±265.0Low Ber 25.5±10.0 65.7±16.0 1 206.7±130.0 2 047.0±225.0 2 568.9±401.0 3 535.4±209.0 2 900.5±160.0Low Ber+SC 228.6±25.0 600.0±66.0 1
942.9±228.0 2 276.2±366.0 3 780.9±320.0 4 428.0±279.0 3
247.6±304.0Middle Ber 355.9±44.0 782.6±78.0 1 680.3±160.0 2
232.8±230.0 2 714.7±162.0 3 246.6±502.0 4 448.5±498.0Middle Ber+SC 89.9±23.0 177.5±17.0 160.2±16.0 1 480.8±30.0 2 877.0±145.03
829.0±325.0 4 833.2±446.0High Ber 122.1±15.0 1 448.4±223.0 2
821.9±305.0 3 647.3±422.0 4 119.6±156.0 4 237.4±404.0 4
465.6±452.0High Ber+SC 74.9±9.0 76.0±12.0 888.9±66.0 2 438.1±256.0 5 355.6±452.0 5 304.8±801.0 5 209.5±701.0
3 讨论
Ber因其口服吸收差、大剂量口服导致便秘、静脉注射不良反应严重等缺点限制了其肠道外作用的发挥，因此改变剂型是获得较高血药浓度的方法之一。

为了减少剂型设计的盲目性，为剂型开发提供科学依据，Ber肠道吸收动力学的研究是必不可少的，但迄今有关Ber肠道吸收动力学报道较少。

因此本实验采用大鼠在体肠灌
流模型，探讨了Ber在肠道的吸收，为指导研制较易吸收的口服新型Ber制剂提
供理论依据。

本研究采用大鼠在体肠灌流实验方法，考察不同剂量Ber在小肠段的吸收量和吸
收速率。

原位模型保证了肠道神经以及内分泌输入的完好无损，同时也保证了血液及淋巴液的供应，提高了生物活性，因此能较真实地模拟人小肠对药物吸收的实际情况。

但小肠在吸收药物同时也会吸收水分，改变回流液的体积，从而影响测定药物吸收量的准确性。

因此本实验采用酚红校正循环液体积的变化。

酚红为大分子络合物，几乎不被小肠吸收，故可视其含量不变。

在样品中加入酚红可用来测定不同时间点循环液的体积，从而避免了因实验中肠道吸收水分所带来的误差。

本研究观察了大鼠在体肠灌流实验中高、中、低3个药物浓度在30、60、120、180和240 min 各时间点药物的吸收量，结果显示：随着供试液循环时间的延长，药物吸收总量逐渐增加，且吸收量随药物浓度的增加而增加，在50～200
μmol·L-1内3个浓度4 h Ber吸收百分率分别为9.3%、10.0%和10.2%，说明Ber肠道吸收较差。

这与Pan等[9]的报道相似。

Pan等采用在体肠灌流模型观察Ber的吸收特性，结果显示Ber很难从肠道被大鼠吸收，2.5 h之后仅有约5%的
Ber被肠道吸收。

此外，本实验以Ber在肠循环液中剩余药量的对数值对取样时间做线性回归，其斜率为吸收速率常数Ka，Ber各剂量组间Ka 值几乎保持不变，组间差异无统计学意义，表明Ber的吸收动力学为一级吸收，吸收方式为被动扩散。

大量毒性研究实验结果表明：SC是一个相对无毒的促吸收剂，已在瑞典、丹麦和
日本的氨苄西林(axlium ampicillin)栓剂中应用于临床[6]，其促吸收机制主要是与膜结合，使膜的结构紊乱，同时与细胞间紧密连接处的各种离子产生螯合作用，导致肌动蛋白微丝收缩而暂时打开上皮紧密连接，增加旁细胞转运[7]。

SC造成的肠细胞损伤具有可逆性，在停药后可迅速恢复，毒性较小。

SC的这种螯合作用造成
的肠细胞损伤具有可逆性，停药后可迅速恢复。

因此有望作为辅料而应用于口服制剂。

SC促进药物在肠道的吸收效果确切，已有报道证实：SC可显著提高胰岛素、LMWH等药物在肠道内的吸收水平。

加入SC的氨苄西林栓剂与单用相比，生物
利用度可增加2.6倍。

因此，为改善Ber的肠道吸收，本实验选用肠道吸收促进剂SC与Ber合用。

大鼠在体肠灌流实验表明：SC对Ber高、中、低3个剂量组均有明显的促吸收作用。

其中Ber低剂量加SC组与Ber低剂量组比较，在灌流30 min时吸收量已有显著增高，灌流240 min时合用组吸收量为Ber单用组的1.93倍，提示SC对Ber的吸收有良好的促进作用。

中、高剂量组在灌流240 min时SC也显示出显著的促吸收效果。

SC对Ber吸收速率常数Ka无显著影响，各组间差异均无统计学
意义,表明SC对Ber肠道吸收的影响只是增加其吸收程度，对其吸收速度影响很小。

LDH存在于人体各组织器官中，是机体能量代谢中的一种重要酶，LDH的改变直接影响到机体的能量代谢，当机体各组织器官病变时，其组织器官本身的LDH要发生改变，并且可引起血液中LDH改变。

肠循环液中存在LDH，提示有细胞损坏，因此测定肠循环液中LDH的含量，可以揭示肠上皮细胞发生的细微变化。

本实验
通过测定肠道循环液中LDH含量来评价SC对肠道黏膜的损伤作用。

随着肠道灌
流时间的增加，各实验组肠循环液中LDH的含量也在不断增加。

Ber各剂量组间、Ber加SC组与Ber组间差异均无统计学意义，提示Ber、SC对肠道细胞无明显损伤作用。

上述结果与目前报道[10-12]一致。

由于本研究给药时间较短，对于Ber
与SC合用的安全性评价还有待于更为详细的长期及急性毒性实验研究。

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