一种干酪乳杆菌及其培养基[发明专利]

(10)申请公布号 (43)申请公布日 2013.05.22C N 103114052 A (21)申请号 201210578740.4
(22)申请日 2012.12.28
CGMCC NO.3993 2010.07.02
C12N 1/20(2006.01)
C12R 1/245(2006.01)
(71)申请人哈尔滨美华生物技术股份有限公司
地址150018 黑龙江省哈尔滨市道里区上海
街8-8号
(72)发明人梁金钟
肖文娟
(54)发明名称
一种干酪乳杆菌及其培养基
(57)摘要
本发明公开一种干酪乳杆菌及其培养基，该
菌株保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通
微生物中心，登记入册编号为：CGMCC NO.3993，其
拉丁文命名为Lactobacillus casei L7-13，形态
学特征为：革兰氏阳性菌，不产芽孢，无鞭毛，不
运动，菌落粗糙，呈灰白色或微黄色。

本发明还公
开了该菌的16S 核糖体DNA(16S rDNA)全序列；
本菌种产乳酸速度快，产酸高；繁殖速度快，活力
高，抗逆性强；具有改善胃肠道的功能，能抑制有
害菌的定植；该菌种能产生胆盐水解酶，可以将
结合胆酸分解为游离胆酸，而游离胆酸则可以和
胆固醇形成复合物共同沉淀下来，因此，该菌种具
有降低胆固醇作用。

(83)生物保藏信息
(51)Int.Cl.
权利要求书1页 说明书6页
序列表1页 附图1页
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请
权利要求书1页 说明书6页序列表1页 附图1页(10)申请公布号CN 103114052 A
*CN103114052A*
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1.一种干酪乳杆菌(Lactobacillus casei L7-13)，该菌株保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，登记入册编号为：CGMCC NO.3993。

2.根据权利要求1所述的一种干酪乳杆菌(Lactobacillus casei L7-13)，其特征在于：所述的干酪乳杆菌形态学特征为：革兰氏阳性菌，不产芽孢，无鞭毛，不运动，菌落粗糙，呈灰白色或微黄色。

3.根据权利要求1所述的一种干酪乳杆菌(Lactobacillus casei L7-13)，其特征在于：所述的干酪乳杆菌的16S 核糖体DNA(16S rDNA)全序列为如序列表SEQ ID No.1。

4.根据权利要求1所述的一种干酪乳杆菌(Lactobacillus casei L7-13)的培养基，其特征在于，配方如下：溶剂为水，葡萄糖10.0-80.0g/L 、低聚果糖10.0-50.0g/L 、低聚木糖10.0-50.0g/L 、大豆蛋白胨10.0-30.0g/L 、酵母浸粉10.0-50.0g/L 、牛肉粉
5.0-30.0g/L 、磷酸氢二钾0.5-3.0g/L 、柠檬酸三钠0.5-3.0g/L 、柠檬酸铵0.1-3.0g/L 、MgSO 4·7H 2O 0.1-2.0g/L 、MnSO 4·4H 2O0.1-1.0g/L 、吐温80 0.1-20mL/L ；在pH4.5-
6.5、温度30-42℃条件下培养18-36小时，菌体生长良好。

权 利 要 求 书CN 103114052 A
一种干酪乳杆菌及其培养基 技术领域
[0001] 本发明提供的是一种干酪乳杆菌(Lactobacillus casei L7-13)及其培养基。

背景技术
[0002]
干酪乳杆菌(Lactobacillus casei L7-13)属于乳杆菌属(Lactobacillus)，是
革兰氏阳性菌，不产芽孢，无鞭毛，不运动；兼性厌氧，有时微好氧，在有氧时生长差，降低氧分压时生长较好；兼性异型发酵乳糖，不液化明胶，不还原硝酸盐，接触酶和氧化酶皆为阴性；最适生长温度为37℃，G+C 含量为45.6％～47.2％；菌体长短不一，两端呈方形，常成链；菌落粗糙，灰白色，有时呈微黄色，能发酵多种糖。

干酪乳杆菌分布广泛，通常存在于人的口腔、肠道内含物和大便及阴道中，也常常出现在牛奶和干酪、乳制品、饲料、面团和垃圾中，罕见致病。

[0003] 干酪乳杆菌的生理功能
[0004] (1)发酵后营养作用干酪乳杆菌发酵后产生乳酸，可提高钙、磷、铁的利用率，促进铁和维生素D 的吸收。

乳糖分解产生的半乳糖，是构成脑神经系统中脑磷脂的成分，与婴儿出生后脑的迅速生长有密切关系。

众所周知，有人患有乳糖不耐症，若食用牛奶等鲜乳制品会引起腹泻，而发酵乳发酵消耗原奶中20％～40％的乳糖，当引用酸奶后，还有一部分乳糖酶在继续起作用，有利于肠的消化。

还有助于防止缺铁、缺钙引起的贫血症和软骨病。

结肠粘膜不能自己从血液中吸收营养，因此它的营养必须由肠道内的益生菌(多数是乳酸菌)产生。

Bengmark 等研究发现，胃肠道中的干酪乳杆菌能提供重要的营养、维生素和抗氧化剂，减少吸收食品中的有毒成分，防止食物腐败，根除病原体。

[0005] (2)改善胃肠道功能干酪乳杆菌通过自身及其代谢产物和其他细菌之间的相互作用，调整菌群之间的关系，维持和保证菌群最佳优势组合及这种组合的稳定。

胃肠道中各种微生物的种类、数量和定居部位是相对稳定的，它们相互协调，相互制约，共同形成一个平衡的微生态系统。

它们的数量取决于各自的活性，各种微生物都分泌特殊的物质抑制其他有害菌种的生长，乳酸菌正是其中的“佼佼者”。

有害菌会产生腐败代谢产物，如氨、硫化氢、吲哚等物质，这些有害物质会造成胃肠道功能异常，而优势的乳酸菌可以产生多种抗菌物质，抑制有害菌 的定植，这就是所谓的阻抗定位作用。

干酪乳杆菌在体内发酵糖类，产生大量的乙酸和乳酸，使肠道内pH 和E h 下降，肠道处于酸性环境，对于病原性细菌，如志贺氏菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌等有拮抗作用。

低pH 和E h 能维持正常生理功能，对肠炎、痢疾、急慢性腹泻、结肠炎等多种肠道疾病有良好的预防和治疗作用。

干酪乳杆菌在代谢过程中可以产生H 2O 2，抑制金黄色葡萄球菌的生长繁殖。

在肠道中，产H 2O 2的干酪乳酸菌同时在代谢过程中产生乳酸，增强了H 2O 2的杀菌作用，从而使乳酸菌成为肠道中的优势菌。

[0006] (3)抗肿瘤作用关于乳酸菌的抗肿瘤作用的报道是Bogdanov(1962)，他从保加利亚乳杆菌中分离出了3种具有抗癌活性的糖肽。

1978年，Kilara 和Shahani 报道，乳酸菌对抑制肿瘤细胞的增殖有一定效果，光岗知足也得到了类似的结果。

1980年Kato 等研究了干酪乳杆菌的抗肿瘤作用。

1990年，Macleod 等发现了干酪乳杆菌对抑制肝细胞肿瘤增
长的功效。

研究者们认为，乳酸菌的抗肿瘤活性是由于乳酸菌菌体本身及其代谢产物所致。

目前这一研究已从推测进入实验论证和机理阐明阶段。

虽然乳酸菌抑制肿瘤的真正机制目前并不十分清楚。

但可大致归纳出6项可能的作用机理，包括：①降解或者吸附致癌物；②改善肠道菌群，阻止肠内致癌物的形成；③增强宿主免疫系统；④产生抗突变物质；⑤改变肠道的生理生化环境；⑥影响宿主的生理机能。

[0007] (4)降低胆固醇作用胆固醇在人体内具有重要的生理作用，但血清中胆固醇含量过高容易诱发动脉硬化，从而导致一系列心血管疾病。

在一些人民生活富裕的国家，因血液中胆固醇含量过高引发的心血管疾病，已经成为威胁人类身心健康的最大杀手。

近年来国外的研究表明，乳酸菌具有较高的降低胆固醇作用，适量服用乳酸菌及乳酸菌发酵产品可以有效降低血液胆固醇含量，从而减少心血管疾病的发病概率。

1977年，美国调查发现经常饮用酸奶和相关发酵乳制品的人，其体内血清胆固醇含量也较低。

长期以来，人们对乳酸菌降低胆固醇作用及其机理进行了广泛而有效的研究。

尽管大量的体内和体外实验都证实了乳酸菌的降低胆固醇作用，但其作用机理至今尚未定论，通常认为是几种理论协同作用的结果。

①体外研究证明，在厌氧条件下，乳杆菌和双歧杆菌在含有胆盐的高胆固醇培养基生长时，能降低培养基中胆固醇含量，人们推测细菌细胞吸收了肠道中的胆固醇，可能会减少机体对胆固醇的吸收，从而导致体内血清中胆固醇含量也相应下降。

②体外实验证明，乳酸菌产生的胆盐水解酶可以将结合胆酸分解为游离胆酸，而游离胆酸则可以和胆固醇形成复合物共同沉淀下来。

这就是乳酸菌与胆固醇的共沉淀作用。

这种共沉淀作用可以使环境中的胆固醇含量降低。

[0008] (5)增强机体免疫作用致病微生物(病毒、病菌、支原体等)广泛存在于自然界中，并且不断产生新的变异体，不仅导致人体产生各种炎症，甚至引发肿瘤等恶性疾病。

现有疫苗和抗生素往往只能针对某些已知的致病微生物引起的疾病进行治疗，而对其变异体则无能为力。

因此，通过提高人体的免疫力来预防和治疗各种致病微生物引起的疾病，日益成为各国科学家关注的热点。

今年研究表明：乳杆菌可以作为特异性免疫调节因子，增强肠道非特异性免疫能力，促进巨噬细胞产生TNA-a和IL-6，激活淋巴细胞，增加血液中免疫球蛋白的含量，从而提高机体抵抗病原体的能力。

乳酸菌的细胞壁主要是由肽聚糖、多糖和磷壁酸组成。

已知肽聚糖对免疫反应具有促进作用。

对溶菌酶消化作用十分敏感的乳酸菌可能在肠道中释放肽聚糖，并在胃肠黏膜表面产生诱导免疫反应。

研究证明，用干酪乳杆菌的发酵液经加热杀死活菌后仍能增强免疫反应，说明乳酸菌发酵产物也能增强机体的免疫力。

乳酸菌发酵制品中，还有大量的短链多肽、游离氨基酸，不饱和脂肪酸，同时乳酸菌发酵液中的各种可溶态的微量元素也大大高于发酵前的培养基。

酪蛋白水解后产生一种活性六肽，它可以刺激巨噬细胞的吞噬作用，同时还能刺激T细胞和白细胞的增殖和成熟，从而提高机体的免疫力，抵抗病原菌的入侵。

[0009] (6)延缓机体衰老自从俄国作家梅切尼科夫的著作《长寿说》问世以来，乳酸菌能延长人的寿命已经有了很多证据。

梅切尼科夫的研究表明，保加利亚人的长寿证实因为他们喜欢喝酸奶，而酸奶是由乳酸菌发酵而成的。

人从婴幼儿、青少年、壮年直至老年，由于生理变化，肠道内的微生物数量、种群和优势菌群也不断发生变化。

人在出生时没有乳酸菌；青壮年时，乳酸菌数量成为优势菌，益生菌的数量达到顶峰；老年人体内的有害菌相对较多，益生菌数量相对较少。

老年人的身体器官和机能都出去衰退时期，而乳酸菌可使肠内
菌群平衡，加强乳酸菌等益生菌成为肠道内优势菌的地位。

日本光岗知足表明，长期饮用发酵乳，能够增加老年人的免疫力，促进心、肝等器官的功能，达到延年益寿的目的。

发明内容
[0010] 本发明的目的就提供一种干酪乳杆菌(Lactobacillus casei L7-13)及其培养基，用于发酵乳制品工业中。

[0011] 一种干酪乳杆菌(Lactobacillus casei L7-13)，该菌株保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院，保藏日期：2010年7月2日，登记入册编号为：CGMCC NO.3993。

[0012] 本发明还具有如下特征：
[0013] 1、所述的干酪乳杆菌形态学特征为：革兰氏阳性菌，不产芽孢，无鞭毛，不运动，菌落粗糙，呈灰白色或微黄色。

[0014] 2、所述的干酪乳杆菌的16S核糖体DNA(16S rDNA)全序列为如序列表SEQ IDNo.1。

[0015] 3、一种干酪乳杆菌(Lactobacillus casei L7-13)的培养基，配方如下：溶剂为水，葡萄糖10.0-80.0g/L、低聚果糖10.0-50.0g/L、低聚木糖10.0-50.0g/L、大豆蛋白胨10.0-30.0g/L、酵母浸粉10.0-50.0g/L、牛肉粉5.0-30.0g/L、磷酸氢二钾0.5-3.0g/
L、柠檬酸三钠0.5-3.0g/L、柠檬酸铵0.1-3.0g/L、MgSO
4·7H
2
O 0.1-2.0g/L、MnSO
4
·4H
2
O
0.1-1.0g/L、吐温80 0.1-20mL/L；在pH4.5-6.5、温度30-42℃条件下培养18-36小时，菌体生长良好。

[0016] 本菌种产乳酸速度快，产酸高；繁殖速度快，活力高，抗逆性强；具有改善胃肠道的功能，能抑制有害菌的定植；该菌种能产生胆盐水解酶，可以将结合胆酸分解为游离胆酸，而游离胆酸则可以和胆固醇形成复合物共同沉淀下来，因此，该菌种具有降低胆固醇作用。

附图说明
[0017] 图1为干酪乳杆菌(Lactobacillus casei L7-13)的光学显微镜照片；[0018] 图2为干酪乳杆菌(Lactobacillus casei L7-13)的电子显微镜照片。

具体实施方式
[0019] 下面举例对本发明作更详细的描述：
[0020] 实施例1
[0021] 本发明的目的在于提供一种干酪乳杆菌(Lactobacillus casei L7-13)的分离和培养方法，本发明的目的是这样实现的：本发明中所涉及的百分比均为重量百分比。

[0022] 1.首先从自然界中采集样品：将采样工具及各种采样容器进行灭菌，采样地点选择在乳品生产厂附近下水道的淤泥中，养牛挤奶场的土壤中，堆放的鲜储固态饲料内层中，进行多点采样。

[0023] 2.将采集的样品进行稀释：将采集的某种样品在无菌条件下混合均匀，称取20克样品，溶解于100mL无菌水中，其中装有80-100粒玻璃珠，用力摇动10分钟，静止一分钟，
用1mL 无菌吸管吸取1mL 上清液，移入9mL 无菌水试管中，彻底摇匀，然后再从这一稀释的样品中取出1mL 样品再移入9mL 无菌试管中，彻底摇匀，如此依次进行稀释，直至稀释到10-5。

[0024] 3.涂布分离：从上述稀释的样品中用0.1mL 无菌吸管分别取出0.1mL 样品，移入BCP 琼脂平板培养基中，用无菌三角刮棒，涂布均匀，每个稀释度做3个重复。

BCP 培养基配方(g/100mL)：葡萄糖0.5g 、乳糖0.5g 、酵母浸粉0.5g 、琼脂1.5～2.0g 、溴甲酚紫(5g/100mL)1.0mL 、自来水100mL ，pH 6.8～7.0。

[0025] 4.培养：将涂布的平板置于37℃培养箱中倒置培养24小时，观察挑菌。

[0026] 5.挑菌：将黄色菌落或培养基周围变为黄色的菌落挑入试管斜面中，挑取200个菌落，然后再进行二次分离纯化，最后得到纯培养，从上述200株菌种中选出两株黄色圈最大者，进行紫外线照射诱变。

[0027] 6.紫外线诱变初筛：将其中两株菌分别在MRS 培养基中进行培养12小时，取出离心，用无菌水洗涤两次，再用生理盐水稀释，用玻璃珠摇匀打碎，使细胞数达到107，在15W 紫外灯下，距离10cm 照射3分钟，红光下操作，然后涂布于上述琼脂平板上，避光培养36小时。

挑取黄色圈大的菌落，移入试管斜面中，挑取50株菌株。

[0028] 7.复筛：将50株菌种逐个进行培养产酸和凝乳性能测试，从其中筛选出2株性能最佳者，再进行诱变筛选，反复进行3次，最后得到一株最优良菌种L7-13。

[0029] 8.根据《伯杰氏鉴定细菌学手册》第9版，进行形态学、生理生化和16srDNA 菌种鉴定。

[0030] 菌落形态特征描述：在MRS 固体培养基上生长的单一菌落呈乳白色、圆形、边缘整齐、表面光滑、菌落中心突起，质地均匀。

[0031] 菌种个体形态特征：光学显微镜观察到，菌体呈细长的杆状，部分有不规则的弯曲、无芽孢、无运动性，革兰氏染色阳性。

通过电镜照片可看到，其菌体形态和光学显微镜下的形态基本一致。

(附光学显微镜和电子显微镜照片图1-2)
[0032] 生理生化实验结果：(表1) [0033]
[0034]
注：“+”表示指示特征为阳性；“-”表示指示特征为阴性。

[0035] 糖醇发酵实验结果：配制培养基时预先加入1.6％的溴甲酚紫溶液，利用溴甲酚紫指示剂的变色范围pH5(黄)-pH7(紫)，判断菌种是否可以利用糖或醇。

若指示剂变黄，则产酸，为阳性；不变色则不产酸，为阴性，如表2。

[0036] 糖醇发酵实验结果(表2) [0037]
[0038]
注：“+”表示显示产酸；“-”表示不产酸；“±”表示微弱产酸
[0039] 经以上试验，初步确定该菌株为干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)，菌株编号为L7-13。

[0040] 9.然后将菌株L7-13送到中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行最后鉴定，鉴定结果如表3：
[0041] 中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心鉴定结果(表3) [0042]
项目
特性项目特性革兰氏染色
阳性核糖+细胞形状
杆状海藻糖+形成芽孢
-木糖-接触酶
-鼠李糖-氧化酶
-麦芽糖+空气中生长
+乳糖-45℃生长
+棉籽糖-15℃生长
+山梨醇+6.5％NaCl 生长
-蜜二糖-pH9.6生长
-半乳糖+pH4.5生长
+甘露醇+发酵葡萄糖酸钠产气
+阿拉伯糖+碳水化合物产酸
葡萄糖酸钠-葡萄糖
+蔗糖+甘露糖
+纤维二塘+松三糖
+七叶灵+果糖
+苦杏仁苷+水杨苷
+ [0043]
[0044] 通过形态学、生理生化试验和16srDNA 菌种鉴定，根据《伯杰氏鉴定细菌学手册》第9版，最后确定菌株L7-13为干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)，并定名为干酪乳杆菌L7-13(Lactobacillus casei L7-13)。

该菌株保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，登记入册编号为：CGMCC NO.3993。

[0045]
实施例2：
[0046] 培养方法实例一：干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)的培养：对干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)L7-13进行培养，培养基配方：溶剂为水，葡萄糖10.0g/L 、低聚果糖10.0g/L 、低聚木糖10.0g/L 、大豆蛋白胨10.0g/L 、酵母浸粉10.0g/L 、牛肉粉5.0g/L 、磷
酸氢二钾0.5g/L 、柠檬酸三钠0.5g/L 、柠檬酸铵0.1g/L 、MgSO 4·7H 2O 0.1g/L 、
MnSO 4·4H 2O 0.1g/L 、吐温80 0.1mL/L ；在pH4.5、温度30℃条件下培养36小，菌体生长良好。

4000rpm 以上离心收集菌体，得到湿菌泥，然后再经冷冻干燥制得冻干菌粉。

[0047] 实施例3：
[0048] 培养方法实例二：干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)的培养：对干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)L7-13进行培养，培养基配方：溶剂为水，葡萄糖45.0g/L、低聚果糖30.0g/L、低聚木糖30.0g/L、大豆蛋白胨20.0g/L、酵母浸粉30.0g/L、牛肉粉
20.0g/L、磷酸氢二钾2.0g/L、柠檬酸三钠2.0g/L、柠檬酸铵2.0g/L、MgSO
4·7H
2
1.0g/L、
MnSO
4·4H
2
0.5g/L、吐温80 10mL/L；在pH5.5、温度35℃条件下培养28小5000rpm离心
15min，收集菌体，得到湿菌泥，然后再经冷冻干燥制得冻干菌粉。

[0049] 培养方法实例三：干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)的培养：对干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)L7-13进行培养，培养基配方：溶剂为水，葡萄糖80.0g/L、低聚果糖50.0g/L、低聚木糖50.0g/L、大豆蛋白胨30.0g/L、酵母浸粉50.0g/L、牛肉粉30.0g/L、
磷酸氢二钾3.0g/L、柠檬酸三钠3.0g/L、柠檬酸铵3.0g/L、MgSO
4·7H
2
2.0g/L、MnSO
4
·4H
2
1.0g/L、吐温80 20mL/L；在pH6.5、温度42℃条件下培养18小时，菌体生长良好。

5000rpm 离心15min，收集菌体，得到湿菌泥，然后再经冷冻干燥制得冻干菌粉。

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[0001] 序 列 表CN 103114052 A
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图
1
图2说 明 书 附 图CN 103114052 A。