真菌的固体发酵工艺研究

真菌的固体发酵工艺研究
真菌是最早被发现引起昆虫疾病的微生物，原因是它们可长出寄主体表，明显可见。

虫生真菌多从体壁侵入，自然扩散力强，对于防治刺吸口、钻蛀性以及在地下生活的害虫具有无可比拟的前景，再加上大多容易人工培养，这些优良性状使其应用始终引人注目。

目前,化学农药(如DBCP、呋喃丹等)仍是我国生产量最大、应用最广的杀虫剂。

20世纪60年代曾在山东建厂生产农药DBCP(二溴氯丙烷)来杀线虫,DBCP的生产使工人患男性不育症而停止生产,后来又曾一度从国外进口呋喃丹,呋喃丹因有毒已被禁用。

化学农药的生产和使用会造成农产品农药残留和自然环境污染,因此,开发对环境友好的生物菌剂势在必行,也必将成为未来的主导品种。

我国是农业大国,植物线虫病害愈来愈受到我国政府、企业和农户的重视,真菌剂是一种具有广阔应用前景的生物防治剂。

金龟子绿僵菌（Metarhizium anisopliae）是首先被研制成杀虫剂的微生物。

目前世界上已记载的虫生真菌约有100属，800种以上。

近20年来，真菌杀虫剂研究进展很快，迄今先后有50多种产品注册。

真菌在生物防治上虽然表现出巨大的潜力,市场前景广阔,但大规模生产技术的不成熟是限制其工业化的主要因素之一[11] ,本文利用真菌二级液体发酵,培养真菌液体菌种,再转接到固体培养基上,进行固体发酵。

真菌固体发酵工业化生产中试,以实验室真菌剂发酵成功数据为基础[12～16],进行优化固体发酵工艺,为工业化规模生产奠定了坚实的基础。

1真菌固体发酵一般工艺流程
1上罐后第一天清洗固体发酵设备，准备好一切用品；
2转固体发酵前一天开水浸泡大米一小时后用蒸饭车常压灭菌2小时（可同时结合50L高压蒸汽灭菌锅一起灭；同时对拌种场及设备进行进行消毒。

3转固体当天再用蒸饭车常压灭菌一次(早晨进行，以保证傍晚之前上盘)；同时对拌种场所同风，准备无菌水。

4以上步骤在发酵室进行，液体种子工程中心发酵后，桶装带至发酵室。

5期间通过空调调节室温，调节培养料温度；加湿器调节湿度（前三天保持95%-100%，之后控制在70-80%以利于产孢）。

2真菌剂生产培养基及仪器和生产设备
1生产原料
大米：250kg（以2%的产孢量估计）；植物油：2.5L（1%）；麸皮；豆饼粉
2生产设备
20L种子罐；发酵包；蒸饭车；50L高压蒸汽灭菌锅；拌种容器（鼎）；加湿器（或保鲜膜覆盖取代加湿器）;温度计；湿度计；无菌手套；一次性口罩。

3真菌固体发酵
3.1真菌液体菌种培养
目前国内真菌生物农药工业生产的菌种扩大培养一般都采用实验室和生产车间二级种子培养流程。

斜面菌种的培养是工业发酵工艺中的关键环节，操作必须在无菌室严格进行无菌操作。

每次使用无菌室前后须打扫干净并进行紫外或臭氧灭菌。

斜面菌种在一般在25℃左右的培养箱中培养4～14天，具体依菌种而定。

斜面菌种不宜传代过多，一般不超过三代，以防菌种退化。

有时也可使用平板培养基进行菌种培养。

其表面积大，产孢多，菌落生长和杂菌污染易观察，但无菌操作不如斜面培养基方便。

将固体培养基上培养出的孢子及菌丝转入三角瓶液体培养基中培养，通过往复振荡或旋转振荡增加通气，使菌体大量增殖的过程。

注意因菌种的不同而调节温度、培养基的组成和初始pH 值、培养时间以及摇床的速度。

SDY或SD是常用的培养基。

也可使用天然材料自行设计并经试验确定适于摇瓶培养和下一步种子罐培养的液体培养基。

种子罐的大小和需要逐级扩大培养的次数根据固体培养物的量而定。

例如，2500kg的固体培养基，按照14%的接种量计，需要350L 液体种子，因此需要一套5L-50L-500L 的三级种子罐系统。

种子罐级数越少，越有利于简化工艺和控制，并可减少由多次移种而造成的杂菌污染机会。

发酵过程中应注意观察，并将温度、pH 值和溶氧等发酵参数控制在有利于菌丝生长的最佳范围。

另外还要通过在培养基中加入各种植物油及其他化学消泡剂（如聚二醇、十八醇等高级醇类，聚氧丙烯甘油等聚醚类）或通过罐内的机械消泡装置来控制发酵过程中产生的泡沫，以防止泡沫“顶罐”而造成培养液逸出和杂菌污染。

真菌农药使用的都是好气性真菌，它们在深层液体中培养只能利用溶解在水中的氧，因此如何保证发酵液中有较高的溶氧浓度（mg/L）是发酵成功的重要保证。

溶氧浓度是由通气量控制的，而通气量是由来自空压机的高压气流（气升式发酵罐）的速率或搅拌转速（搅拌式发酵罐）决定的。

在真菌发酵常用的温度24℃下，必须保证溶氧浓度不低于0.02 mol/m3,菌丝的呼吸才不会受到抑制。

3.2真菌固体发酵间处理
保证真菌菌种生长的环境无其它杂菌, 因此,在生产前对固体发酵间及准备间进行彻底灭菌,即甲醛薰蒸彻底灭菌。

3.3真菌固体发酵时用具及物品的消毒
为保证给真菌固体培养基接种时无杂菌侵入,真菌固体发酵过程用的铁钯子、量杯、纱布、无菌服、口罩、手套等用具及用品用牛皮纸包好,放到蒸汽消毒柜内进行常规消毒灭菌,温度125～128℃,蒸汽压力0.12～0.15MPa, 30min,降至室温,把无菌的用具及物品放到固体发酵间的准备间内备用。

将不锈钢方盘用清水冲洗干净,晾干,备用。

3.4 真菌固体发酵培养基消毒
将真菌固体发酵培养基陈大米0.5t,倒入塑料大桶内,向其注入清水,使大米完全浸没在清水中,浸泡4～8h,使大米完全吸饱水分,用铁罩沥控干水分平摊在清洁的方盘内,每盘装量为3～5kg、玉米粉0.25kg,约占方盘高度的1/3。

将装有真菌固体发酵培养基的方盘整齐地摆放在消毒车上,推送到消毒间的消毒柜内,关闭柜门。

采用常规消毒方式消毒灭菌,控制蒸汽压力0.12～0.15MPa,温度121～123℃,蒸煮30min,将消毒车推到固体发酵间的准备间内,用铁钯子将大米迅速打散降温到28℃,准备接
种。

3.5真菌固体发酵培养基接种
在真菌固体发酵间内,用1000mL 的无菌量杯接取真菌液体种子600～800mL,均匀地淋在方盘内的固体发酵培养基上,用铁钯或小铁铲进行混拌,使真菌液体种子与固体发酵培养基充分混合均匀,再用无菌的双层纱布盖上固体发酵培养基,将方盘摆放到发酵间的架子上,开始固体发酵。

3.6真菌固体发酵过程
固体发酵间内保持温度为28±1℃,发酵1～3d保持发酵间内的湿度为70%～80% ,从第
4d起,不必加湿,保持正常环境下的湿度(10%～40%) ,在发酵第3～4d时给固体发酵培养基上喷洒无菌的20%葡萄糖溶液一次,发酵7d,孢子成熟,固体培养基形成菌块,则固体发酵结束,真菌固体发酵过程菌落状态见表3。

把方盘运到孢子提取间中,保持室内干燥,菌块自然风干,准备提取孢子。

对固体发酵的全过程进行监控,观察每一时期孢子生长状况,6h记录一次,记录时间、温度、湿度、固体培养基上的菌落(真菌孢子)状态等,固体发酵过程中菌落生长各时段状态列于表3中,固体发酵过程均为无菌操作。

4真菌孢子提取
以孢子为目标的发酵应在产孢高峰后及时结束，将发酵物干燥后用于制剂。

1.干燥
以活孢子作为产品的真菌发酵物必须尽快干燥，否则不仅孢子活力会迅速下降，而且迅速发生的杂菌污染甚至有可能造成含孢量很高的产品成为废品。

然而，为了保持真菌的孢子的活力，对发酵物不能使用高温干燥；同时，真菌的孢子易随风飞散，干燥过程中也不能使用高速气流或者高速搅拌。

因此，干燥工艺和干燥设备的选择一直是真菌农药生产的薄弱环节。

少数生产单位甚至采用晒干的办法，使得活孢率会大幅下降。

冷冻干燥能较好地保持孢子活力，但成本较高，不适用于大量生产。

真空干燥避免了高温和气流问题，且要求的真空度不是很高；缺点是干燥速度较慢。

各种气流干燥器或旋转快速干燥机（也称旋转闪蒸干燥机）可用于干燥的前期，使初始含水量很大的湿发酵物迅速失水；但必须控制发酵物温度不超过40～45℃，否则会杀伤孢子。

后期可使用真空干燥设备，但也要控制温度不超过40～45℃。

干燥较充分的发酵物的含水量应在8%以下才能用于制剂，否则将影响各种剂型中孢子的生活力和剂型的货架期。

2.制剂
制剂前的发酵物俗称“原菌剂”。

原菌剂可以直接付诸使用，也可通各种收孢机将孢子提取出来进行制剂或直接投入使用。

图4-19 中左为我国常用的收孢机，加工起来成本较低，可大量处理原菌剂，但无正式产品，且效率稍低。

安徽农业大学省微生物防治重点实验室有一台英国CABI公司出产的MycoHarvester V 型收孢机，工作效率高，提取较纯。

制剂的目的是要将孢子或菌丝稀释和保护起来，并将各种剂型成分正确地组合起来，形成良好的理化性状。

由于真菌农药的活性成分是活孢子，因此制剂首先要考虑的是尽量保持孢子的活力不受各种剂型成分的影响。

尤其是在研制加有表面活性剂的悬乳剂和可湿性粉剂时，须对表面活性剂对孢子的影响做仔细的考察，因为它们多数都会降低孢子的活力。

其次要注意了解孢子的亲水性，虫霉及座壳孢的孢子是亲水的，而白僵菌和绿僵菌这类孢子却极其疏水，在水中会迅速漂浮起来，而且不易进入喷头，喷洒时不会均匀。

迄今已推出的剂型多为粉剂、油悬浮剂、颗粒剂等。

在林业上常将纯孢子粉不加制剂就直接超低量喷施，省去了制剂的工序，节省了储存的空间，但用量难以控制，易造成浪费，
且缺乏助剂保护的孢子粉失活较快。

5结果与分析
5.1温度对真菌固体发酵的影响
温度对真菌发酵影响很大,温度升高对真菌固体发酵有利,产孢子量增加,因固体发酵是放热过程,使固体发酵温度升高,很容易造成固体培养基内热超过31℃,发烧把菌落烧死,不利于产孢,见图2,发酵最佳温度是28.5℃,产孢子量最大。

5.2通气量对真菌固体发酵的影响
真菌是喜氧的,因此适量增加通气量有助于提高孢子生长速度,产孢子量随通气量的增加也随之增大,但在固体发酵间内通风量不易过大,过大生长速度快,内热加大,温度不易控制[13～16] 。

保证发酵间内正压风为0.05MPa,发酵间内架子上的方盘摆放不易过密,有利于通风散热。

5.3湿度对真菌固体发酵的影响
湿度对真菌固体发酵初期影响很大[14～20] ,固体发酵初期(1～3d)湿度越大产孢子量就越大,最佳湿度为70%～80% ,从第4d开始固体发酵培养基上的孢子已基本成熟,湿度就应当适当降低。

防止湿度太大,孢子发芽,降低孢子产量,固体发酵4～7d内最佳湿度应保持在10%～40%。

6结论
中试结果表明,真菌固体发酵最佳温度为28±1℃、通风量0.05MPa、湿度70%～80% (前3d)、湿度10%～40% (后4d) ,培养时间为7d。

在中试过程中,固体发酵易染菌,因此,保证真菌发酵全过程(菌种→液体发酵→固体发酵)无其它杂菌。

总之,通过10个批次真菌试验,获得10t真菌菌剂产品,各项指标均合格,中试成功,可以进一步推广进行工业化生产,真菌固体发酵的成功,为工业化大规模生产提供了可靠的参考依据。