人类GSTP1基因最小启动子的克隆及其转录活性研究X

・论著・人类G STP1基因最小启动子的克隆及其转录
活性研究Ξ
蔡俐琼,王泽华ΞΞ
(华中科技大学同济医学院附属协和医院妇产科,武汉　430022)
【摘要】　目的:克隆编码谷胱甘肽S2转移酶P1(G STP1)基因的最小启动子并研究它
在上皮性卵巢癌细胞中的转录活性。

方法:以人类基因组为模板扩增人类G STP1基因的
最小启动子,将启动子分别插入到p GE M2T载体和荧光素酶报告基因p G L32enhancer载体
中。

将重组荧光素酶报告基因系统分别转染顺铂耐药AD6和顺铂敏感A2780细胞,比较
启动子在两种细胞中的活性;同时将转染后的AD6细胞用H2O2处理,观察细胞氧化还原
状态的变化对启动子活性的影响。

结果:报告基因活性测定结果表明,G STP1在耐药AD6
细胞中启动子表现出比在A2780细胞中强的活性,在AD6细胞中启动子活性经H2O2诱
导后增高。

结论:成功克隆了G STP1最小启动子,在AD6细胞中G STP1启动子的功能活
性较强,为下一步对多药耐药性卵巢癌进行靶向基因治疗提供了重要依据。

【关键词】　卵巢肿瘤;谷胱甘肽S2转移酶;启动子;荧光素酶报告基因
中图分类号:R737.31　文献标识码:A　文章编号:1004-7379(2003)06-0401-03
Cloning the minim al promoter of the hum an G STP1gene and research of its transcriptional
function.Cai Liqiong,Wang Zehua.Department o f Obstetrics and Gynecology,Union Hospital,
Tongji Medical College,Huazhong Univer sity o f Science and Technology,Wuhan430022
【Abstract】　Objective:T o clone the minimal prom oter of the glutathione S2trans ferase P1
(G STP1)gene and study its transcriptional activity of ovarian cancer cells.Methods:The minimal
prom oter of the human G STP1gene was am plified from human genomic DNA by PCR,and then it
was subcloned into p GE M2T and p G L32enhancer.The luciferase report system were used to trans fer
cisplatin2sensitive A2780and cisplatin2resistant AD6cells.The luciferase activities of the trans ferred
cells were com pared by luciferase activity assay.The trans fected cells were treated with H2O2to de2
termine the effect of cellular redox status to the activity of G STP1prom oter.R esults:The AD6cell
line presented a stronger G STP1prom oter activity than that in A2780cell line.And the activity of
G STP1minimal prom oter could be enhanced by treatment of H2O2.Conclusion:The minimal prom ot2
er of G STP1can be cloned success fully,and the activity of G STP1minimal prom oter in AD6cells will
be a im portant basis for the study of target gene therapy of cisplatin2resistant ovarian cancer.
【K ey w ords】　Ovarian neoplsmas;G lutathione S2trans ferase;Prom oter;Luciferase reporter
gene
谷胱甘肽S2转移酶(G lutathione S2trans ferases, G STs)是一个多功能同工酶家族,与解除细胞内毒性复合物的多种毒性作用有关。

研究表明,人类表达的G STs的同工酶中,P1类的高表达与肿瘤细胞对化疗药物抗性的产生和肿瘤患者的低生存率有关,在对化疗耐药的多种细胞株的研究中都发现G STP1 mRNA水平升高1。

本实验中,我们克隆出人类G STP1基因最小启动子,并研究了它在对顺铂敏感
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现代妇产科进展2003年11月第12卷第6期　Prog Obstet G ynecol,N ov.2003,V ol.12,N o.6
Ξ
ΞΞ通讯作者
国家自然科学基金资助项目(30070786)
和耐药卵巢癌细胞中的转录活性,为对顺铂耐药卵巢癌的基因治疗提供理论依据。

1　材料与方法
1.1　材料
1.1.1　细胞株　人类上皮性卵巢癌顺铂敏感细胞株A2780及由此诱导的卵巢癌顺铂耐药细胞株AD6由广西医科大学附属肿瘤医院李力教授惠赠。

1.1.2　主要试剂　p GE M2T载体、p G L32control、p G L32en2 hancer、T4连接酶、β2半乳糖苷酶分析试剂、荧光素酶分析试剂购自Promega公司;PC M V2β购自Clontech公司;ExT aq酶及K pnⅠ、HindⅢ内切酶购自T akara公司,DNA100bp Ladder购自华美公司;DNA片段回收试剂盒购自M BI公司;质粒小提试剂盒购自Omega公司;PCR引物由上海博亚公司合成。

1.2　方法
1.2.1　细胞培养　A2780和AD6细胞用含10%小牛血清RP MI1640培养液,在37℃、5%C O2培养箱内饱和湿度培养。

1.2.2　报告基因表达载体的构建
1.2.2.1　用常规方法从外周血中提取人类基因组DNA,用紫外分光光度计检测核酸浓度及纯度。

1.2.2.2　引物设计及PCR扩增G STP1启动子　根据
G eneBank(X08058)中人类G STP1基因图谱2设计引物G ST1和G ST2。

在上游引物的5′端加入K pnⅠ酶切位点和与T载体连接所需的碱基A;下游引物的5′端加入H indⅢ酶切位点。

引物序列为:G ST1:5′2AAAAAGG T ACCGG ACCCT CC AG AAG AG CGG2 3′;G ST2:5′2AAG CTT CG T ACT C ACTGG TGG CG AAG23′。

PCR采用50μl体系,反应循环为95℃,1min;57.5℃,1min;72℃,90s,共进行30个循环。

1.2.2.3　测序载体pG E M2G ST136的构建　回收136bp PCR产物,与pG E M2T载体连接,产物转化JM109感受态细胞后,提取质粒D N A,用K pnⅠ和H indⅢ酶切鉴定。

将鉴定正确的pG E M2 G ST136送上海博亚公司对扩增的启动子片段双向测序确定碱基序列。

1.2.2.4　报告基因载体p G ST136的构建　p GE M2G ST136酶切后得到带有K pnⅠ和HindⅢ粘性末端G STP1启动子片段,插入K pnⅠ和HindⅢ酶切的p G L32enhancer载体。

1.2.3　细胞瞬时转染分析
1.2.3.1　细胞转染　用LipofectAMI NE2000介导报告基因质粒转染A2780和AD6细胞。

考虑细胞状态和培养情况的差异,本实验进行3次转染,每次转染设3组平行对照,设立共转染对照组和实验组。

将细胞在六孔板上接种,细胞融合达到70%～90%时进行转染,对照组每孔用8μl脂质体将1μg p G L32control质粒和100ng PC M V2β质粒(校正细胞转染效率)分别共转染A2780和AD6细胞;实验组用8μl脂质体将1μg p G ST136重组质粒和100ng PC M V2β质粒分别共转染A2780和AD6细胞。

1.2.3.2　荧光素酶和β2半乳糖苷酶活性分析　细胞转染48h后裂解细胞,离心收集细胞裂解液上清。

发光计检测荧光素酶活性:将100μl荧光素酶分析液和20μl细胞裂解液上清混匀,测定25℃时瞬时表达的荧光素酶15s累积发射峰值。

紫外分光光度计测定β2半乳糖苷酶活性:用1×裂解缓冲液按2:1的比例稀释各细胞裂解液上清,在150μl稀释的细胞裂解液中加入等体积的2×分析缓冲液,37℃孵育30min直至出现淡黄色,加入1m ol/L碳酸钠中止反应,立即读取分光光度计420nm的吸光度值。

以β2半乳糖苷酶活性作为细胞转染效率校正标准,将测得的A2780和AD6细胞的荧光素酶活性用各转染细胞的β2半乳糖苷酶活性校正后获得荧光素酶的相对活性值;然后,将转染pG ST136的A2780和AD6细胞的荧光素酶相对活性值分别用转染pG L32control的各细胞相对荧光素酶活性进行标化得到绝对比值(将pG L32control活性作为绝对值设定为100%)。

1.2.4　细胞氧化还原状态的改变对G STP1启动子活性的作用　将共转染p G ST136和pC M V2β后的AD6细胞用浓度为10～200μm ol/L之间的H2O2分别处理16h。

我们进行3次转染,每次转染设3组平行对照。

根据上述方法裂解细胞后测定荧光素酶和β2半乳糖苷酶活性。

2　结　果
2.1　PCR扩增及其产物的电泳鉴定结果　由图1可见,预期的136bp大小G STP1启动子扩增产物条带清晰,无非特异性扩增现象。

　图1　PCR扩增产物、p GE M2G ST136和p G ST136K pnⅠ
+HindⅢ核酸内切酶分析
1.PCR产物136bp G STP1启动子;
2.p GE M2G ST136/K pn
　Ⅰ+HindⅢ(3kb and136bp);3.p G ST136/K pnⅠ+Hind
　Ⅲ(5kb+136bp);M.22log DNA Ladder
2.2　含G STP1启动子测序载体及报告基因载体的酶切鉴定结果　测序载体p GE M2G ST136和报告基因载体p G ST136酶切鉴定结果正确,见图1。

测序结果表明,克隆序列与文献2一致。

2.3　G STP1最小启动子在AD6和A2780细胞株中的活性差异　AD6细胞转染重组质粒p G ST136后测定的荧光素酶活性是转染带有S V40启动子的p G L32control质粒的9倍;而A2780转染p G ST136后仅是转染p G L32control质粒的1.5倍,见图2。

表明G STP1启动子在AD6细胞中启动荧光素酶基因转录的活性更高,与前期实验中与A2780相比AD6细胞表达较高水平的G STP1mRNA的结论一致,这也提示了G STP1的表达具有细胞特异性。

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　图2　G STP1最小启动子在AD6和A2780细胞株中的活　性比较。

每一细胞株分别用p G L32control 或p G ST136与
　PC M V 2β共转染。

结果用p G L32control 测定结果标化得
　到,以3次转染实验的均值±标准差表示。

2.4　H 2O 2对G STP1启动子功能的影响　转染p G ST 136的AD6细胞用不同浓度的H 2O 2处理后,荧光素酶活性增至1.5～
3.5倍,见图3。

我们还发现,
在H 2O 2浓度低于100μm ol/L 时,转基因AD6细胞测
定的荧光素酶活性随着H 2O 2浓度的增加而升高;当
H 2O 2浓度增至200μm ol/L 时,荧光素酶活性没有再
升高。

推测可能是H 2O 2的细胞毒性随着浓度的升高而增加,100μm ol/L 为较适合的作用浓度。

　图3　AD6细胞共转染p G ST136和pC M V 2β后在其培养
　基中加入H 2O 2至终浓度分别为10～200μm ol/L ,培养16h 后测定荧光素酶活性。

实验结果以3次实验测定的均值
　±标准差表示
3　讨　论
研究表明,G STP1与细胞癌变及癌细胞对化疗药物的抗性相关,其原理是化疗药物在谷胱甘肽S 2转移酶(G ST )的催化下与谷胱甘肽(G SH )结合而被解毒,而且G ST 本身可与亲脂性药物结合,促进外排而降低药物的细胞毒作用,从而产生耐药3。

在很多人类肿瘤的耐药性产生过程中都伴随G STP1的过度表达,而在相应的正常增殖细胞或成熟细胞中该基因活性却很低,组织中无该蛋白表达或表达
很少4,因此,我们选择顺铂耐药关键基因G STP1
表达调控元件进行研究,希望能构建专一性杀伤耐药肿瘤细胞的载体系统。

G STP1启动子中相对转录起始位点-80到-8这一段序列包含5个调控子,1个T AT A 盒(-31～-27)、2个SP 21(G C 盒)位点(-46～-41、-57～-51)、1个AP 21位点(-69～-63)、1个抗氧化剂反应元件(ARE )(-70～-61),还包括1个沉默子NF κB 5,它们是启动报告基因表达的必需片段。

我们利用PCR 技术克隆出的人G STP1启动子序列包含了这些片段,经测序分析与文献报道完全一致。

本实验中,我们采用荧光素酶报告系统测定G STP1启动子功能,荧光素酶报告系统比传统的氯霉素乙酰转移酶报告系统灵敏度高100～1000倍,得到的结果更为精确。

实验结果表明,G STP1启动子的功能与细胞中G STP1的表达相关,在表达高水平G STP1mRNA 的AD6细胞中,136bp 的启动子就足以诱导较强的荧光素酶报告基因表达。

此外,我们还发现在AD6细胞中,H 2O 2能够诱导G STP1启动子转录活性增加。

研究表明,氧化反
应调节物H 2O 2可能是通过作用于NF 2κB 和AP 21位
点促进了G STP1启动子的活性,H 2O 2有与胰岛素及其相关生长因子相似的促生长作用6。

参　考　文　献
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　Satoh T ,Nishida M ,Tsunoda H ,et al.Expression of glu 2tathione S 2trans ferase pi (G ST 2pi )in human malignant ovari 2an tum orsJ .Eur J Obstet G ynecol Reprod Biol ,2001,96:20222082　M orrow CS ,C owan K H ,G oldsmith ME.S tructure of the glu 2tathione S 2trans ferase 2pi geneJ .G ene ,1989,75:32113
　H our T C ,Chen J ,Huang CY,et al.Characterization of chem ore 2sistance mechanisms in a series of cis platin 2resistant transitional carcin oma cell linesJ .Anticancer Res ,2000,20:3221232254
　Brussel J P ,S teenbrugge G J ,R omijn JC ,et al.Chem osensitivity of prostate cancer cell lines and expression of multidrug resis 2tance 2related proteinsJ .Eur J Cancer ,1999,35:66426715
　Borde 2Chiche P ,Diedericha M ,M orceau F ,et al.Regulation of transcription of the glutathione S 2trans ferase P1gene by methylation of the minimal prom oter in human leukemia cells J .Biochem Pharmacol ,2001,61:60526126
　C owell LG,Dix on K H.The structure of the human glutathione S 2trans ferase pi geneJ .Biochem J ,1988,255:79283
(收稿日期　2003206225)
第一作者简介:蔡俐琼(1976-),女,华中科技大学同济医学
院附属协和医院妇产科住院医师,医学硕士。

主要研究方向:妇科肿瘤。

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04现代妇产科进展2003年11月第12卷第6期　Prog Obstet G ynecol ,N ov.2003,V ol.12,N o.6。