PCR类型测序模板注意事项

PCR类型测序模板注意事项
PCR类型测序模板注意事项
总反应体积建议为50uL或100uL，扩增结束后取3ul⽤1%左右的琼脂糖电泳检测，应为单⼀的条带。

3ul样品总量不低于
50ng(⾮常⼩的PCR产物可以酌情减⼩)，PCR 产物产量过低说明PCR扩增结果不是很理想，应改进条件重新扩增。

对于有杂带和扩增弥散的PCR产物，需经琼脂糖电泳将⽬的⽚段切下来并回收，建议将PCR产物作克隆后进⾏测序。

有杂带的和扩增弥散的PCR产物即使通过琼脂糖电泳纯化，测序仍有可能出现双峰等异常结果。

经上述检测合格的PCR产物，需经过琼脂糖电泳纯化去除未反应的引物，dNTP，引物⼆聚体等影响测序反应的组分。

有多种纯化⽅法可供选择，Promega，Qiagen和⽣⼯等公司都有相应的产品可供选择。

纯化后的PCR产物经电泳检测估计总量应不低于200ng/Kb(⾮常⼩的PCR产物可以酌情减⼩)。

与质粒模板相⽐，PCR产物彼此间差异很⼤，因此，每个PCR模板应尽可能提供相应的PCR退⽕温度和PCR产物的长度，以供测序时参考。

PCR模板⼀般不应短于200bp，过短的PCR产物应经克隆后进⾏测序。

纯化好的PCR产物应溶于双蒸⽔中，TE缓冲液会严重影响测序反应。

若让公司对PCR产物进⾏纯化，PCR产物需满⾜∶总量不低于1ug/kb，⽚段长度不低于200bp
各种PCR测序模板均应提供相应的测序引物，并尽可能提供引物的全序列，并将引物浓度准确稀释到5pmole/ul 。

引物浓度的换算关系∶
总ng数 = pmole x 分⼦量/1000
由于PCR产物测序相对较难，为使您能拿到⼀个好的结果，请尽量满⾜上述要求。

测序常见问题分析
序列中出现N值的常见原因：
通常有以下⼏种情况将造成测序结果中N值较多：
PCR产物直接进⾏测序，在PCR产物长度以后将⽆反应信号，机器将产⽣许多N 值。

通常我们很容易辨别PCR产物结束的位点，PCR产物测序⼀般末端的⼀个碱基为A（绿⾊峰），这是由于Taq酶能够在PCR反应的末端⾮特异性地加上⼀个A碱基，我们⽤T载体克隆PCR产物就是根据该原理的。

在最后⼀个碱基A后，信号会迅速减弱。

因此我们要根据序列正确判断出PCR产物的末端序列，在此序列以外就不是我们所要的序列了。

在序列的起始端有时会有⼀些N值。

该种情况主要是有未去除的染料单体造成的⼲扰峰。

该⼲扰峰和正常序列峰重叠在⼀起，有时机器将⽆法正确判断出为何碱基。

有时，在序列的起始端的⼩⽚段容易丢失，导致起始区信号过低，机器有时也⽆法正确判读。

现在公司已采取了有效措施，序列起始区的信号已⼤为改善，有时⼏乎第⼀个碱基就可以正确读出，染料的⼲扰问题基本解决。

但是客户提供的PCR引物⽤于测序时，有时会产⽣引物⼆聚体，对测序的起始区造成⼲扰。

在序列的3’端容易产⽣N值。

⼀个测序反应⼀般可以读出900bp以上的碱基，但是，只有550bp以前的碱基是可靠的，理想条件下，多⾄700bp的碱基都是可以⽤的。

⼀般在650bp以后的序列，由于测序胶的分辩率问题，会有许多碱基分不开，就会产⽣N值，这种情况下产⽣的N值是⽆法避免的。

现在我们只承诺正常情况下每个测序反应⾄少读出500个碱基的有效序列。

测序模板本⾝含有杂和序列，该种情况主要发⽣在PCR产物直接测序上。

由于PCR 产物本⾝有突变或含有等位基因，就会造成在某些位置上有重叠峰，产⽣N值。

可以很容易判断该种情况，那就是整个测序信号都⾮常好，只有在个别位置有明显的重叠峰，视杂和度不同N值可能有多有少。

该种情况明显是客户的样品问题。

通过将PCR产物克隆后进⾏测序，可以解决该种情况的N值问题。

由于模板质量问题或测序不好，所得的序列结果较差，也会产⽣许多N值。

⼀般情况测序结果不好的，我们都会根据具体原因尽量加以解决。

有些实在⽆法解决的也就没有办法了。

针对有N值的情况，我们⼀定要根据具体情况具体分析。

很多情况下是客户⾃⼰的模板原因造成N值，在这种情况下我们没有
必要为客户承担测序失败的损失。

有许多情况下由于客户的原因造成的测序失败，我们⾄少要让客户知道是客户本⾝的原因⽽不是我们的技术问题。

我为什么找不到我的PCR引物？
以下⼏种情况，我们将⽆法找到做PCR时的引物序列：
⽤PCR引物作为测序引物进⾏测序时，所测序列是从引物3’末端后第⼀个碱基开始的，所以⾃然就找不到您的引物序列了。

有两种⽅法可以得到您的引物序列。

对于较短的PCR产物（<600bp），可以⽤另⼀端的引物进⾏测序，从另⼀端测序
可以⼀直测到序列的末端，就可以在序列的末端得到您的引物的反向互补序列。

对于较长的序列，⼀个测序反应测不到头，因此就只能将您的PCR产物⽚段克隆到适当的载体中，⽤载体上的通⽤引物进⾏测序。

由于载体上的通⽤引物与您的插⼊序列之间还有⼀段距离，因此就可以得到您的完整的引物序列。

由于在测序的起始端总会有⼀些碱基⽆法准确读出，因此，您如果想得到您的PCR产物的完整序列，最好克隆后进⾏测序。

PCR产物⽤T载体克隆后，由于克隆的⽅向是随机的，因此，当您在⼀条链上找不到您的引物序列时，试图在互补链上寻找您的引物序列。

当测序引物离您的插⼊⽚段很近时，有时可能也⽆法找到您的引物的全序列。

这主要是因为有时测序的起始端由于未去除的染料或引物⼆聚体的⼲扰，造成起始区的序列不好，可能⽆法找到您的引物完整序列。

有时，质粒做模板进⾏测序时，由于某些原因，质粒上没有插⼊外援⽚段，为空载体，所测的序列完全为载体序列，此时⾃然也找不到引物序列。

我的基因序列与标准序列为什么有差别？
⼀段基因序列经扩增后，克隆到载体中进⾏测序。

在两个层次上可能导致序列发⽣变化。

⾸先在PCR扩增过程中就可能产⽣错误。

将⽚段克隆到载体中也有可能发⽣突变。

其次，测序的准确率问题。

ABI公司承诺其仪器的测序精度在⼀定范围内可以达到98.5%以上。

由于仪器准确率的限制，在⼀个较长的序列中发⽣碱基序列错误是难以避免的。

在确认克隆⽆误的情况下，通过双向测序可以最⼤限度减少测序的错误。

您如果想得到您的最准确的序列，进⾏双向测序是很有必要的。

只进⾏简单的单向测序，我们⽆法保证所测序列的完全准确性，这是由仪器的精度决定的。

过短的PCR产物为什么不适于直接测序？
⾸先过短的PCR产物纯化困难，⼀般的PCR产物纯化试剂盒都要求PCR产物⽚段⼤于200bp，过短的PCR产物纯化和准确定量都⾮常困难。

因此我们要求⽤于测序的PCR产物⼀般不低于200bp长度。

其次，由于测序本⾝的限制，以⼀个100bp的PCR产物⽤于测序为例，去掉两个引物的序列⼤约40到50bp，再加上测序起始端的⼀些读不出的碱基，真正能够得到的有⽤序列不过30～40碱基。

这么少的序列很难向客户收费。

上⾯是在最理想的条件下的假设，稍不顺利，测序就失败了。

因此，过短的PCR产物，只能克隆后进⾏测序。

⽤测序的⽅法检测点突变可靠吗？
有的客户想⽤测序的⽅法检测点突变体，我认为该⽅法可靠性不⾼。

主要有以下两个原因。

⾸先，我们并不清楚突变的序列与正常的序列的⽐例是多少。

测序反应的信号强度直接与模板的量有关，如果突变的模板所占的⽐例很少，将直接作为背景噪⾳了，很难检测出来。

只有当测序反应体系中正常的和突变的模板量⽐较接近时，才能较可靠地检测到突变体的存在。

其次，在同⼀位置，不同碱基的信号强渡⼀般是不⼀样的。

这样即使突变的模板所占的⽐较较⾼时，也不⼀定能准确检测到突变的存在。

另外，测序仪是
设计⽤来测序正常的碱基序列的，软件在对扫描的结果进⾏处理时，会尽量提⾼主峰⽽将背景信号尽量压低，以得到尽可能好的结果。

因此，当某处出现双峰时，测序仪⼀般会认为信号弱的峰为背景信号，在处理过程中，将弱的峰进⼀步压低，这样根部不⽴于突变体的检测。

因此认为，⽤测序的⽅法检测突变体的存在不是⼀个好的⽅法。

与测序引物有关的问题：
对于通⽤测序引物，只要正确使⽤，⼀般不会有太⼤问题，测序引物问题主要发⽣在客户⾃⼰提供的PCR引物上。

应该明确的⼀点是并不是所⽤的⽤于PCR的引物都可以⽤来作测序，以下⼏种PCR引物将是不适合⽤作测序引物的：
简并引物，
简并引物必然要在测序模板上有多个结合位点，直接影响测序结果。

随机引物，如RAPD引物，
随机引物⼀般都⽐较短，所⽤退⽕温度低，在测序反应的条件下，不能很好地与模板结合。

过长的引物，⼀般要求测序引物不⼤于24bp，最长不能超过30bp。

过长的引物在测序反应的较低的条件下容易在测序模板上有多个结合位点，导致测序结果背景增⾼。

另外，较长的引物纯度也将难以保证。

通常⽤于测序的引物纯度要在90%以上，引物纯度低时，测序反应的背景将明显增⼤，直接影响到测序结果。

有特殊标记的引物，
该情况主要指荧光标记的引物。

我们测序反应的四种碱基都是荧光标记的，这样，荧光标记的引物将产⽣⼲扰。

另外，其他⼀些有⼤的标记基团的引物也最好不要⽤于测序。

引物上⼤的标记基团将直接影响到DNA⽚段的迁移率，导致测序结果峰型不好或错误。

不纯的引物：
测序引物对纯度的要求很⾼，合成的引物中⾮全长的⽚段可以造成较强的背景。

以⼀个20bp的测序引物为例，直接脱盐纯化的话，纯度⾄多在70%左右，也就是说将有30%的引物将作为背景噪⾳，这必将严重影响测序结果。

⼀般经PAGE或OPC法纯化的引物基本能达到测序的要求。

造成测序反应模板量低主要有以下⼏种原因：
客户提供的PCR产物量太少，经纯化后不⾜以满⾜测序需要。

⼀些低拷贝的质粒按照常规⽅法提取，所得质粒很少，经浓缩后仍然很少。

客户提供的PCR产物或质粒的量很少是我们测序反应中经常遇到的⼀个问题。

为解决该
问题，我们在平时收客户模板的过程中需要注意如下事项：
质粒类型的测序模板尽量让客户提供菌液，不要直接提供质粒。

菌液我们可以控制模板提取的量和质量。

⽽且，所提供的质粒类型⼀般应为⾼拷贝的。

以下⼏种质粒是我们测序成功率⾮常⾼的，包括pGEM-T载体，pUC及其衍⽣载体等。

对于PCR类型的测序模板，未纯化的PCR产物要保证⾜够的量，⼀般我们要求客户提供50~100 uL的PCR扩增产物，并且要求PCR扩增的质量要⾼。

有杂带的PCR扩增产物我们尽量不要收。

对于纯化的PCR产物，要保证⾜够的量，通常要求客户对已纯化的PCR 产物⽤电泳进⾏检测。

⼀般来说，对于⼀个1kb长的纯化PCR产物进⾏测序，客户提供的PCR产物量不应低于200ng。

另外，⽤分光光度法进⾏的PCR产物定量是极不可靠的。

对于未纯化的PCR产物，提供的量应⾄少为已纯化的PCR 产物的量的2倍。

另外，PCR产物测序客户需提供相应的PCR扩增引物⽤于测序。

引物最好稀释成5 uM
的浓度，总体积不低于20 uL。

最后⼀点是，我们应该明确，并不是所有的测序样品都能测出满意的序列。

根据我们的统计并参考其他公司的情况，⼀般会有10%到15%的序列是难以测出的。

对于⼤部分未测出的序列，我们可以找到尽可能的原因，以建议客户下⼀步如何做。