人类基因组学课件第二讲

新一代芯片技术 光纤微珠芯片
• Screening Unlabeled DNA Targets with Randomly Ordered Fiber-Optic Gene Arrays, Steemers, F.J., Ferguson, J.A., Walt, D.R., Nature Biotechnology,18, 91-94, 2000. • Techview: Molecular Biology. Bead-Based Fiber-Optic Arrays, Walt, D.R., Science, 287, 451-452, 2000 • Decoding Randomly Ordered DNA Arrays, Kevin L. Gunderson, Genome Research, 14: 870-877, 2004.
• 美国 美国NimbleGen公司：独特的光导合成化学结合无 公司： 公司 掩膜阵列合成技术（ 掩膜阵列合成技术（MAS）的原位合成技术。MAS ）的原位合成技术。 系统包括无掩膜的光发射机、 反应腔、 系统包括无掩膜的光发射机、 反应腔、DNA合成 合成 仪和电脑等， 仪和电脑等，系统的核心是一个数码微镜装置 (Digital Micromirror Device), 创造了“虚的掩膜” 创造了“虚的掩膜” 代替传统的物理掩膜。 这些“虚的掩膜” 代替传统的物理掩膜。 这些“虚的掩膜”能反射 紫外光的模式， 紫外光的模式，该模式通过选择性地在精确的位 置上切割紫外标记的保护基团来去保护新生寡核 苷酸，并使下一个碱基能加上去。 苷酸，并使下一个碱基能加上去。这种方法可以 合成长达60个碱基的寡核苷酸片段 个碱基的寡核苷酸片段， 合成长达 个碱基的寡核苷酸片段，一张芯片上 可以合成380,000个寡核苷酸。 个寡核苷酸。 可以合成 个寡核苷酸 • 该技术使用了数字光处理和快速、高产的光化学 该技术使用了数字光处理和快速、 技术，以极高的灵活性合成长寡核苷酸、 技术，以极高的灵活性合成长寡核苷酸、高密度 的DNA微阵列 微阵列
光纤微珠芯片---技术原理
1.微珠 微珠
– 3.1 um无孔无荧光 硅珠 – 每个微珠单独质控 •有效的反应表面积和体积比 有效的反应表面积和体积比 •低/无背景 低 无背景 •大小均一 大小均一
2. 寡聚核苷酸探针
23mer 50mer 探针
探针与微珠连接
5’ End 3’ End
每个微珠上连接100万左右相同的探针 万左右相同的探针 每个微珠上连接 万左右相同
4.芯片解码 芯片解码
Decoder Oligo Decode hyb 1 Decode hyb 2 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16
Decoder hybridization 1
Decoder h指数级解码
其他原位合成芯片类型
压电打印原位合成
装置： 装置：类似彩色喷墨打印机 技术：常规的固相合成方法，即将墨盒中的墨汁分别 技术：常规的固相合成方法， 用四种碱基合成试剂替代。 用四种碱基合成试剂替代。 合成原理：传统的核酸固相合成技术。 合成原理：传统的核酸固相合成技术。通过用机械手 臂直接将碱基合成试剂氨基磷酸脂点样到芯片适当的 位置上，循环下去就能合成预计的寡核苷酸。 位置上，循环下去就能合成预计的寡核苷酸。 优点：灵活性高，能合成任意寡核苷酸片段 优点：灵活性高， 应用的公司：美国Agilent 公司，60个碱基的寡核苷 应用的公司：美国Agilent 公司，60个碱基的寡核苷 酸芯片产品。 酸芯片产品。
接触式和非接触式 cDNA PCR 产物 Oligo
基因芯片点样法制备过程展示
• 点样法
光刻原位合成法
Affymetrix芯片介绍 芯片介绍
• 原位合成法制备DNA芯片的关键是高空间分 辨率的模板定位技术和固相合成化学技术 的精巧结合。 • 光刻原位合成法是将光平版印刷技术 (photolithographic approach)运用到DNA合成 化学中，利用固相化学、光敏保护基及光 刻技术得到位置确定、高度多样性的化合 物集合。
Synthesis of Ordered Oligonucleotide Arrays
•
合成所用的单体分子一端按传统固相合成方法活化，另一端受光敏保护基的保护， 合成所用的单体分子一端按传统固相合成方法活化，另一端受光敏保护基的保护，所 以发生偶联的部位反应后仍旧带有光敏保护基团。因此， 以发生偶联的部位反应后仍旧带有光敏保护基团。因此，每次通过控制蔽光膜的图案 (透光与不透光 决定哪些区域应被活化，以及所用单体的种类和反应次序就可以实现 透光与不透光)决定哪些区域应被活化 透光与不透光 决定哪些区域应被活化， 在待定位点合成大量预定序列寡聚体的目的。 在待定位点合成大量预定序列寡聚体的目的。
探针问题
• 光导原位合成法需要预选设计、制造一系列蔽光 光导原位合成法需要预选设计、 掩膜，造价较高；制造过程中采用光脱保护方式， 掩膜，造价较高；制造过程中采用光脱保护方式， 掩膜孔径较小时会发生光衍射现象， 掩膜孔径较小时会发生光衍射现象，制约了探针 密度的进一步提高，而且光脱保护不彻底 光脱保护不彻底， 密度的进一步提高，而且光脱保护不彻底，每步 产率只有92-94%，因此这种方法只能合成 产率只有 ，因此这种方法只能合成30nt左 左 右的寡核苷酸探针， 右的寡核苷酸探针，同时探针区域由于存在大量 不成功的合成片段，造成杂交背景较高， 不成功的合成片段，造成杂交背景较高，不适于 定量检测。 定量检测。 • 更新慢，而旧的数据库中有的序列有错误 更新慢，
Single IllumiCode Strategy
XY = total number of codes
X = total number of colors or states Y = total number of hybridization stages Example: 38 = 6,561 48= 65,536 24 mer ICode
• 接下来的合成步骤里，别的掩膜被加在石 接下来的合成步骤里， 英片表面， 英片表面，发生新的一轮去保护和核苷酸 偶联。 偶联。这些步骤不断重复直至合成全长的 探针，通常是25个核苷酸 个核苷酸。 探针，通常是 个核苷酸。
• 虽然合成过程效率是非常高的，但是仍然 虽然合成过程效率是非常高的， 有少数活化的分子未能和新的核苷酸发生 偶联。 偶联。为了避免这些漏掉一个核苷酸的 DNA分子成为探针，用一步加帽步骤截断 分子成为探针， 分子成为探针 它们。 它们。
Process of Synthesis
Completed Array
The image represents the completed array In actuality, each probe would be 25 base pairs long The amount of steps (or rounds of the two steps) that occurs to build a chip varies, but is usually around one hundred
•高杂交特异性 高杂交特异性 •全长序列探针 全长序列探针 •定制灵活 定制灵活 •100%质量检控 质量检控QC 质量检控
3.芯片的组装 芯片的组装
•将微珠池内微珠倒入蚀刻光纤，微珠无序自组装 进入小孔，每根光纤上带一个微珠 •每种微珠大约有 ~30 个重复
•消除系统随机误差 消除系统随机误差 •高重复性 高重复性 •微珠之间间距均一 微珠之间间距均一
基因芯片的制备
• 点样法 • 原位合成法AFFY • 光纤微珠Illumina
点样法
玻片——基片 基片——芯片 玻片 基片 芯片 基片制备
点样
基片+DNA: 基因芯片的二大组成要素 基片
合成后点样
按常规方法制备cDNA（或寡核苷酸）探针 库，然后通过特殊的针头和微喷头, 分别把 不同的探针溶液，逐点分配在玻璃、尼龙 或者其它固相基底表面上不同位点,并通过 物理和化学的结合使探针被固定于芯片的 相应位点。
rnaseq并不是每个外显子都能准确预测很多生物体内基因编码区通常被少量或者是短的区域分割开所以这些外显子是比较容易通过序列分析而找到的哺乳动物基因通常外显子很短并被很长的内含子分割开所以寻找编码序列相对困难由可变剪接造成的人在蛋白质组的复杂性上比其它生物高出很多在研究疾病机理和找出治疗方法上带来极大不便目前并没有一个复杂而准确描述人类编码序列的图谱存在如想要了解在各种组织中是否哪个组织会有外显子表达量特别高哪种外显子被表达的情况为解决这个问题外显子芯片应运而来源于基因组序列主要参照基因外显子簇相关联的外显子以及转录簇的序列目前对于基因的可变剪接所造成的各种外显子了解并不十分清楚因此需要在已知的exon基础增加一些预测的外显子序列以确保筛选时的精确把每个exoncdnas和ests当作一个探针选择区平均每个探针选择区psrprobeselectionregion的长度为145bp在每个选择区设计4个以上的探exonjunctionarrayexonjunctionmicroarrayworksalternativesplicinggivengenecreatesdifferentexonexonjuntion
当合成过程全部完成之后， 当合成过程全部完成之后， 石英片去除保护基团， 石英片去除保护基团，切割 成小块， 成小块，每一块即为一张芯 片。 每张芯片被装在一个塑料舱 便于贮存和操作， 中，便于贮存和操作，同时 也提供了在扫描仪中精确、 也提供了在扫描仪中精确、 重复定位芯片的装置。 重复定位芯片的装置。样品 室深1mm，可以容纳 室深 ，可以容纳200μL 杂交液体。 杂交液体。
• 美国 美国Combimatrix公司：原位合成DNA芯片技术， 公司：原位合成 芯片技术， 公司 芯片技术 将半导体技术改良并用于生物芯片的制备。 将半导体技术改良并用于生物芯片的制备。集成 电路含有微电极的阵列， 电路含有微电极的阵列，通过芯片上植入的逻辑 电路进行寻址，每个电极直径94微米 微米。 电路进行寻址，每个电极直径 微米。电极放在 特殊设计的流体腔中， 特殊设计的流体腔中，每个微电极按照数字指令 选择性地按照电化学反应产生相应的化学物质， 选择性地按照电化学反应产生相应的化学物质， 这些化学物质促进了生物大分子如DNA寡核苷酸 这些化学物质促进了生物大分子如 寡核苷酸 的原位合成， 的原位合成，合成发生在包埋在芯片外的多孔反 应层上，在电脑的控制下， 应层上，在电脑的控制下，CombiMatrix芯片可 芯片可 在不同的微电极上平行合成上千个不同的探针分 效率很高。 子，效率很高。 • 该平台具有很高的灵活性，能够根据客户要求快 该平台具有很高的灵活性， 速地进行探针设计和合成DNA微阵列 速地进行探针设计和合成 微阵列
Affymetrix芯片介绍 芯片介绍
• GeneChip以边长12.7cm(5英寸)的正方形石 英片为材料进行生产。 • 石英片是天然羟基化的基质，表面均匀的 羟基化具有结合其它化合物的良好特性。
• 硅烷化石英片：硅烷膜为探针合成提供了 硅烷化石英片： 密度均匀的羟基； 密度均匀的羟基；附着在硅烷膜上的连接 分子则提供了可以在空间上被光激活的表 面。 • 硅烷分子间的距离决定了探针的固定密度， 硅烷分子间的距离决定了探针的固定密度， 可以在边长1.28cm正方形的面积上固定大 可以在边长 正方形的面积上固定大 个探针位点(feature)，每一个位 于500,000个探针位点 个探针位点 ， 点上容纳了数百万个相同的DNA分子。 分子。 点上容纳了数百万个相同的 分子
The GeneChip® Substrate
Depending on the final size of the chip, they can manufacture 49 chips per wafer or 400 chips per wafer – the smaller the chip size, the more they can produce from each wafer（晶片） （晶片）
Affymetrix 原位合成
• 优点 – 序列可精确控制 – 生产快速 – 高密度（可达40万点 高密度（可达 万点 万点/1.6平方厘米） 平方厘米） 平方厘米 – 共价交联固定 • 缺点 – 设备昂贵 – 片段短（25mer)，适合再测序 片段短（ ， – 合成过程中大量不完全片断残留在基片上 – 设计工作量大（合成大量蔽光膜），芯片更新慢 设计工作量大（合成大量蔽光膜），芯片更新慢 ），
寡核苷酸探针由 23-25个碱基的address序列（在解码过 程中使用）和一段50个碱基的基因特异性探针组成。每 个address和探针序列的组合都经过严格的生物信息学 筛选，以消除可能存在的交叉杂交。
2. 寡聚核苷酸探针
• 每种(微珠+探针)单独合成 并 QC • 不同种微珠混合在一起形 成 微珠池 (1624 － 24,000+种微珠)