2019年基因组DNA变异的检测.ppt
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• Insertion and deletion (Indel)：碱基的插入和缺失
ECUSTቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ新教育
SNP的特点
• 就好像单词的变体或者中文中的通假字 • 在基因组中大量存在，已经报道了超过300
万个SNP，估计整个人类中存在1500万个 SNP • 一般为二等位性
– 转换(transition, 如A→G)高于颠换 (transversion, 如A→T)
ECUST创新教育
基因组差异的主要表现
• SNP (Single nucleotide polymorphism)：单核苷酸多 态性，基因组中数量最多的分子标记
• SSLP (Simple sequences length polymorphism)，简 单序列长度多态性，也称微卫星 (Microsatellite)
• 2)SNP研究联盟（The SNP Consortium,TSC）提供的数据库： /db/snp/mHp
• 3)人类基因组突变数据库（the Human Genome Variation,HGVbase） http://hgvbase.cgb.ki.se
ECUST创新教育
• 只有约3%DNA编码蛋白质 • 约3~4万个基因
ECUST创新教育
人体基因组核型图
ECUST创新教育
每个人的基因组一样吗？
• 随着测序技术的飞速发展，2007年基因组 测序开始进入了个体化时代。
– Waston – Venter (Diploid genome sequence) – 炎黄1号
人类疾病易感基因鉴定大赛
系列讲座内容： • 一、生物实验室规范与微量移液器操作
（俞建瑛 副教授） • 二、基因组DNA的提取和酶切
（李素霞 副教授） • 三、PCR原理与技术
（吴海珍 副教授） • 四、基因组DNA变异的检测
（欧阳立明 副教授）
ECUST创新教育
ECUST创新教育基地
人类疾病易感基因鉴定大赛 系列讲座之四
ecust创新教育?snpsinglenucleotidepolymorphism单核苷酸多态性基因组中数量最多的分子标记?sslpsimplesequenceslengthpolymorphism简单序列长度多态性也称微卫星microsatellite?insertionanddeletionindel碱基的插入和缺失ecust创新教育snp?就好像单词的变体或者中文中的通假字?在基因组中大量存在已经报道了超过300万个snp估计整个人类中存在1500万个snp?一般为二等位性转换transition如ag高于颠换transversion如at同一位点极少发生再次复制错误?30位于编码区70位于非编码区ecust创新教育dnaecust创新教育同源染色体姐妹染色单体等位位点一对同源染色体一对姐妹染色单体aa一对等位位点ecust创新教育同源染色体姐妹染色单体等位位点?同源染色体是指形态结构遗传组成基本相同的染色体
基因遗传病的病因。sickle cell anemia, hemoglobin 146 residue (GAG(Glu) GTG(Val) – 改变基因的表达
ECUST创新教育
SNP的演化过程
ECUST创新教育
如何检测SNP或突变
• 酶法：根据酶对DNA序列的识别特异性
– 限制性内切酶: RFLP – DNA 连接酶 – DNA聚合酶在合成时的校正功能：TaqMan®
ECUST创新教育
500bp 300bp 200bp 100bp
正常
PCR Genome
大赛实验流程（PCR-RFLP）
1) 个体基因组提取 2) PCR获得p53基 因第7外显子片段
3) 对PCR产物用 MspI酶切
4) 3%琼脂糖凝胶电泳检测1), 2), 3) 产物，分析肿瘤易感性
ECUST创新教育
• 构象分离法：电泳检测DNA的构象变化
– 单链构象多态性（SSCP） – 异源双链电泳迁移率变化 – dHPLC
• DNA杂交法：碱基变化对DNA互补配对杂交动力学的影响
– DASH, DNA chip, ASO斑点杂交等
• 直接测序法
– 焦磷酸测序（Pyrosequencing） – 单碱基延伸标签测序：(Single Base Extension, SBE tag)
• 都可以从基因组中找到答案！
ECUST创新教育
什么是基因组？
• 基因组（Genome）——生物体全部的遗传 物质；
– 原核生物的基因组 – 真核生物的基因组：细胞核；细胞器
• 生物体——对基因组信息复制、传递、解 码的复杂系统。
ECUST创新教育
人类基因组概况
• The Human Genome Project (HGP)是代 表性测序：24条染色体（22条常染色体 +X+Y）；3×109碱基
ECUST创新教育
p53基因的结构
P53基因位于人17号染色体短臂（17p13），有 11个外显子。粉红色区域所示部分不编码结构 蛋白，灰色区域为内含子内部的外显子，蓝色 为蛋白编码区。
ECUST创新教育
P53蛋白的结构
转录激 活区
核心结构区(DNA结合区)， 突变高发区，引起蛋白质
构象变化。
脯氨酸富含区，与 DNA损伤介导的细胞
实验大赛评分要点
基因组抽提
PCR
酶切
要点
每个环节操作得到的产物质量； 操作细节； 速度（合作）；
ECUST创新教育
最后的奖励考核
PPT报告
一等奖
ECUST创新教育
二等奖
三等奖
ECUST创新教育基地
丰厚奖品等你拿!
Explore life, explore yourself!
– 同一位点极少发生再次复制错误
• 30%位于编码区，70%位于非编码区
ECUST创新教育
DNA的双链互补结构
ECUST创新教育
同源染色体、姐妹染色单体、等位位点
一对同源染色体 一 对 姐 妹 染 色 单 体
A, a：一对等位位点
ECUST创新教育
同源染色体、姐妹染色单体、等位位点
• 同源染色体：是指形态、结构、遗传组成基本相 同的染色体。对于同一个体来说，同源染色体对 在减数第一次分裂前期中彼此联会(配对)，并且 能够形成四分体，然后分裂到不同的生殖细胞的 一对染色体，一个来自母方，另一个来自父方。
– Fluorescent Dye Terminator; Fluorescence polarization; MS; MALDITOF
ECUST创新教育
RCR-RFLP检测SNP或突变
• 原理：由于碱基的变异可引起酶切位点的 消失或出现，从而使不同个体同一位置的 基因组片段（用PCR扩增获得）用同一限 制性内切酶酶切时，产生的DNA片段长度 有差异，即限制性片段长度多态性 （Restriction fragment length polymorphism, RFLP）。
ECUST创新教育
SNP的含义
• 同一个体或不同个体基因组中等位位点上 的单核苷酸碱基不同。
• 对于二倍体生物，等位位点上的SNP有杂 合、纯合之分！
• SNP与DNA突变：
– 都起源于DNA复制差错。 – SNP具有相对稳定性，一般来说在群体中出
现频率大于1%；而突变不具有稳定性，在群 体中存在的频率小于1%。
• Animation
ECUST创新教育
基于杂交的RFLP
• 提取基因组→酶切 →特异性探针DNA 杂交
• 注意等位位点上 SNP的杂合、纯合 在检测结果上的差 异！
• RFLP的特征可遗 传给子代并符合孟 德尔规律。
ECUST创新教育
基因组变异的数据库
• 1)NCBI的遗传变异数据库（dbSNP） /SNP/index.ht ml
ECUST创新教育
个体基因组差异中的秘密
• 为什么？
• 为什么每个人相貌、性格、智 力……都不一样？
• 为什么有的人容易得病，有的 人却对疾病的免疫能力特别高？
• 为什么在药物的使用过程中， 有的人一用就灵，有的人却不 灵，甚至中毒？
• 这些现象使人们认识到：必须 从不同个体基因组序列的多态 性上去阐明个体对疾病和药物 反应上的多态性，才能真正了 解与疾病特別是多基因疾病有 关的遗传机制，同时深入了解 人类起源、进化和迁徙过程中 的DNA序列变化。
突变频率（％） 56 50 44 44 44 41 37 24 30 45 25 22 22 13 12 45
突变热点（密码子） 157，248，273 175，245，248，273 273 273 248, 278 不确定 248 280 不确定 249 175, 248 175，248，273 248 248，273 175，248 不确定
基因组DNA变异的检测
Teacher: 欧阳立明 博士
生物工程学院·应用生物学系
2008.7 奉贤
Contents
1
个体基因组差异
2
PCR-RFLP检测技术
3
p53基因与肿瘤
4
本实验整体流程
ECUST创新教育
生命的核心奥秘
• 生命的奥秘？
– 多样性 – 发育的时空特异性 – 对环境的反应 – 遗传与变异
• 个体之间基因组的差异约在0.1~1%！ —— 2007年《Science》评出的十大科学进展 之首！
Levy S, Sutton G, Ng PC, Feuk L, Halpern AL, et al. (2007) The Diploid Genome Sequence of an Individual Human. PLoS Biology. 5(10): 2113-2144
p53基因与肿瘤
• p53 是一个抑癌基因，可诱导异常细胞进 入凋亡。
• 几乎所有的肿瘤和约50%的恶性肿瘤中都 发现了p53基因的突变或缺失。
• 突变的结果是90%导致翻译出的氨基酸发 生改变，10%是不能形成P53蛋白。
More details please refer to: .sg/index.php http://p53.free.fr/
ECUST创新教育
编码区的SNP
• 与疾病或药物反应个体差异关系密切，是制药企 业的金矿
• 四种后果：
– 同义Synonymous ： AAA (Lys)AAG (Lys)(silent mutation)
– 无义non-sense ：TGG (Trp) TGA (Stop) – 错义mis-sense ：AGU (Ser) ATU (Ile)。一些单
PCR扩增区域图解
Codon 248
ECUST创新教育
↓MspI cCGG(Arg)→cTGG(Trp)
cCTG(Leu)
cCAG(Gln)
248位密码子的突变类型
ECUST创新教育
预期电泳结果
200bp
500bp 800bp
DNA Marker
M1 1 2 M2 3
Fig. 1 PCR-RFLP result of p53 gene M1: Marker 3 (200, 500, 800…)bp; 1: Genome DNA 2: PCR result of exon 7 fragment of p53 gene M2: 100bp ladder DNA Marker 3: Digestion result
• 姐妹染色单体：姐妹染色单体是由一个着丝点连 着的并行的两条染色单体，是在细胞分裂的间期 由同一条染色体经复制后形成的。
• 等位位点：个体或群体同源染色体上相同的位置。
ECUST创新教育
四分体
• 每个四分体都有2条染色体，2对姐妹染色 单体，4个DNA分子。
• 由于四分体时期同源染色体之间经常互相 缠绕，再分开时不一定能维持染色体原来 的形态和组成，有可能发生同源非姐妹染 色体之间的交叉互换，这是染色单体上， 也是不久之后染色体上基因重组的原因。
凋亡有关
核定位信号（NLS）， 高度保守
ECUST创新教育
p53的突变位点统计
ECUST创新教育
突变热点位于DNA结合区
ECUST创新教育
p53热点突变的类型
ECUST创新教育
人类肿瘤p53基因突变
肿瘤类型 肺癌 结肠癌 卵巢癌 胰腺癌 皮肤癌 胃癌 头颈部鳞癌 膀胱癌 前列腺癌 肝细胞癌 胶质瘤 乳腺癌 子宫内膜癌 甲状腺癌 白血病 ECUST创新教育 食管癌
ECUSTቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ新教育
SNP的特点
• 就好像单词的变体或者中文中的通假字 • 在基因组中大量存在，已经报道了超过300
万个SNP，估计整个人类中存在1500万个 SNP • 一般为二等位性
– 转换(transition, 如A→G)高于颠换 (transversion, 如A→T)
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基因组差异的主要表现
• SNP (Single nucleotide polymorphism)：单核苷酸多 态性，基因组中数量最多的分子标记
• SSLP (Simple sequences length polymorphism)，简 单序列长度多态性，也称微卫星 (Microsatellite)
• 2)SNP研究联盟（The SNP Consortium,TSC）提供的数据库： /db/snp/mHp
• 3)人类基因组突变数据库（the Human Genome Variation,HGVbase） http://hgvbase.cgb.ki.se
ECUST创新教育
• 只有约3%DNA编码蛋白质 • 约3~4万个基因
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人体基因组核型图
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每个人的基因组一样吗？
• 随着测序技术的飞速发展，2007年基因组 测序开始进入了个体化时代。
– Waston – Venter (Diploid genome sequence) – 炎黄1号
人类疾病易感基因鉴定大赛
系列讲座内容： • 一、生物实验室规范与微量移液器操作
（俞建瑛 副教授） • 二、基因组DNA的提取和酶切
（李素霞 副教授） • 三、PCR原理与技术
（吴海珍 副教授） • 四、基因组DNA变异的检测
（欧阳立明 副教授）
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ECUST创新教育基地
人类疾病易感基因鉴定大赛 系列讲座之四
ecust创新教育?snpsinglenucleotidepolymorphism单核苷酸多态性基因组中数量最多的分子标记?sslpsimplesequenceslengthpolymorphism简单序列长度多态性也称微卫星microsatellite?insertionanddeletionindel碱基的插入和缺失ecust创新教育snp?就好像单词的变体或者中文中的通假字?在基因组中大量存在已经报道了超过300万个snp估计整个人类中存在1500万个snp?一般为二等位性转换transition如ag高于颠换transversion如at同一位点极少发生再次复制错误?30位于编码区70位于非编码区ecust创新教育dnaecust创新教育同源染色体姐妹染色单体等位位点一对同源染色体一对姐妹染色单体aa一对等位位点ecust创新教育同源染色体姐妹染色单体等位位点?同源染色体是指形态结构遗传组成基本相同的染色体
基因遗传病的病因。sickle cell anemia, hemoglobin 146 residue (GAG(Glu) GTG(Val) – 改变基因的表达
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SNP的演化过程
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如何检测SNP或突变
• 酶法：根据酶对DNA序列的识别特异性
– 限制性内切酶: RFLP – DNA 连接酶 – DNA聚合酶在合成时的校正功能：TaqMan®
ECUST创新教育
500bp 300bp 200bp 100bp
正常
PCR Genome
大赛实验流程（PCR-RFLP）
1) 个体基因组提取 2) PCR获得p53基 因第7外显子片段
3) 对PCR产物用 MspI酶切
4) 3%琼脂糖凝胶电泳检测1), 2), 3) 产物，分析肿瘤易感性
ECUST创新教育
• 构象分离法：电泳检测DNA的构象变化
– 单链构象多态性（SSCP） – 异源双链电泳迁移率变化 – dHPLC
• DNA杂交法：碱基变化对DNA互补配对杂交动力学的影响
– DASH, DNA chip, ASO斑点杂交等
• 直接测序法
– 焦磷酸测序（Pyrosequencing） – 单碱基延伸标签测序：(Single Base Extension, SBE tag)
• 都可以从基因组中找到答案！
ECUST创新教育
什么是基因组？
• 基因组（Genome）——生物体全部的遗传 物质；
– 原核生物的基因组 – 真核生物的基因组：细胞核；细胞器
• 生物体——对基因组信息复制、传递、解 码的复杂系统。
ECUST创新教育
人类基因组概况
• The Human Genome Project (HGP)是代 表性测序：24条染色体（22条常染色体 +X+Y）；3×109碱基
ECUST创新教育
p53基因的结构
P53基因位于人17号染色体短臂（17p13），有 11个外显子。粉红色区域所示部分不编码结构 蛋白，灰色区域为内含子内部的外显子，蓝色 为蛋白编码区。
ECUST创新教育
P53蛋白的结构
转录激 活区
核心结构区(DNA结合区)， 突变高发区，引起蛋白质
构象变化。
脯氨酸富含区，与 DNA损伤介导的细胞
实验大赛评分要点
基因组抽提
PCR
酶切
要点
每个环节操作得到的产物质量； 操作细节； 速度（合作）；
ECUST创新教育
最后的奖励考核
PPT报告
一等奖
ECUST创新教育
二等奖
三等奖
ECUST创新教育基地
丰厚奖品等你拿!
Explore life, explore yourself!
– 同一位点极少发生再次复制错误
• 30%位于编码区，70%位于非编码区
ECUST创新教育
DNA的双链互补结构
ECUST创新教育
同源染色体、姐妹染色单体、等位位点
一对同源染色体 一 对 姐 妹 染 色 单 体
A, a：一对等位位点
ECUST创新教育
同源染色体、姐妹染色单体、等位位点
• 同源染色体：是指形态、结构、遗传组成基本相 同的染色体。对于同一个体来说，同源染色体对 在减数第一次分裂前期中彼此联会(配对)，并且 能够形成四分体，然后分裂到不同的生殖细胞的 一对染色体，一个来自母方，另一个来自父方。
– Fluorescent Dye Terminator; Fluorescence polarization; MS; MALDITOF
ECUST创新教育
RCR-RFLP检测SNP或突变
• 原理：由于碱基的变异可引起酶切位点的 消失或出现，从而使不同个体同一位置的 基因组片段（用PCR扩增获得）用同一限 制性内切酶酶切时，产生的DNA片段长度 有差异，即限制性片段长度多态性 （Restriction fragment length polymorphism, RFLP）。
ECUST创新教育
SNP的含义
• 同一个体或不同个体基因组中等位位点上 的单核苷酸碱基不同。
• 对于二倍体生物，等位位点上的SNP有杂 合、纯合之分！
• SNP与DNA突变：
– 都起源于DNA复制差错。 – SNP具有相对稳定性，一般来说在群体中出
现频率大于1%；而突变不具有稳定性，在群 体中存在的频率小于1%。
• Animation
ECUST创新教育
基于杂交的RFLP
• 提取基因组→酶切 →特异性探针DNA 杂交
• 注意等位位点上 SNP的杂合、纯合 在检测结果上的差 异！
• RFLP的特征可遗 传给子代并符合孟 德尔规律。
ECUST创新教育
基因组变异的数据库
• 1)NCBI的遗传变异数据库（dbSNP） /SNP/index.ht ml
ECUST创新教育
个体基因组差异中的秘密
• 为什么？
• 为什么每个人相貌、性格、智 力……都不一样？
• 为什么有的人容易得病，有的 人却对疾病的免疫能力特别高？
• 为什么在药物的使用过程中， 有的人一用就灵，有的人却不 灵，甚至中毒？
• 这些现象使人们认识到：必须 从不同个体基因组序列的多态 性上去阐明个体对疾病和药物 反应上的多态性，才能真正了 解与疾病特別是多基因疾病有 关的遗传机制，同时深入了解 人类起源、进化和迁徙过程中 的DNA序列变化。
突变频率（％） 56 50 44 44 44 41 37 24 30 45 25 22 22 13 12 45
突变热点（密码子） 157，248，273 175，245，248，273 273 273 248, 278 不确定 248 280 不确定 249 175, 248 175，248，273 248 248，273 175，248 不确定
基因组DNA变异的检测
Teacher: 欧阳立明 博士
生物工程学院·应用生物学系
2008.7 奉贤
Contents
1
个体基因组差异
2
PCR-RFLP检测技术
3
p53基因与肿瘤
4
本实验整体流程
ECUST创新教育
生命的核心奥秘
• 生命的奥秘？
– 多样性 – 发育的时空特异性 – 对环境的反应 – 遗传与变异
• 个体之间基因组的差异约在0.1~1%！ —— 2007年《Science》评出的十大科学进展 之首！
Levy S, Sutton G, Ng PC, Feuk L, Halpern AL, et al. (2007) The Diploid Genome Sequence of an Individual Human. PLoS Biology. 5(10): 2113-2144
p53基因与肿瘤
• p53 是一个抑癌基因，可诱导异常细胞进 入凋亡。
• 几乎所有的肿瘤和约50%的恶性肿瘤中都 发现了p53基因的突变或缺失。
• 突变的结果是90%导致翻译出的氨基酸发 生改变，10%是不能形成P53蛋白。
More details please refer to: .sg/index.php http://p53.free.fr/
ECUST创新教育
编码区的SNP
• 与疾病或药物反应个体差异关系密切，是制药企 业的金矿
• 四种后果：
– 同义Synonymous ： AAA (Lys)AAG (Lys)(silent mutation)
– 无义non-sense ：TGG (Trp) TGA (Stop) – 错义mis-sense ：AGU (Ser) ATU (Ile)。一些单
PCR扩增区域图解
Codon 248
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↓MspI cCGG(Arg)→cTGG(Trp)
cCTG(Leu)
cCAG(Gln)
248位密码子的突变类型
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预期电泳结果
200bp
500bp 800bp
DNA Marker
M1 1 2 M2 3
Fig. 1 PCR-RFLP result of p53 gene M1: Marker 3 (200, 500, 800…)bp; 1: Genome DNA 2: PCR result of exon 7 fragment of p53 gene M2: 100bp ladder DNA Marker 3: Digestion result
• 姐妹染色单体：姐妹染色单体是由一个着丝点连 着的并行的两条染色单体，是在细胞分裂的间期 由同一条染色体经复制后形成的。
• 等位位点：个体或群体同源染色体上相同的位置。
ECUST创新教育
四分体
• 每个四分体都有2条染色体，2对姐妹染色 单体，4个DNA分子。
• 由于四分体时期同源染色体之间经常互相 缠绕，再分开时不一定能维持染色体原来 的形态和组成，有可能发生同源非姐妹染 色体之间的交叉互换，这是染色单体上， 也是不久之后染色体上基因重组的原因。
凋亡有关
核定位信号（NLS）， 高度保守
ECUST创新教育
p53的突变位点统计
ECUST创新教育
突变热点位于DNA结合区
ECUST创新教育
p53热点突变的类型
ECUST创新教育
人类肿瘤p53基因突变
肿瘤类型 肺癌 结肠癌 卵巢癌 胰腺癌 皮肤癌 胃癌 头颈部鳞癌 膀胱癌 前列腺癌 肝细胞癌 胶质瘤 乳腺癌 子宫内膜癌 甲状腺癌 白血病 ECUST创新教育 食管癌