第二十五章微生物转化
合集下载
相关主题
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
甾体指的是固醇或皮质类激素，由于这类激素都含有相 同的结构，所以统称 为甾体类激素。甾体在临床上应用十 分广泛，解热镇痛，消炎杀菌等。
甾体合成技术的演进
➢ 1950年Kendall, Reichstein与Hench因发现类固醇的消炎作用而获得诺 贝尔奖。
➢ 1952年以化学方法以牛胆汁中的脱氧胆酸为原料合成肾上皮质激素， 反应共需31个步骤，产品售价每克$200；
孕酮
皮质激素
环氧化反应
A环芳构化
脱氢
甾体生物转化的原理和方法
甾体生物转化的原理不同于氨基酸，抗生素，蛋白质等的发酵。 而是利用微生物中特殊的酶对甾体的某一部位进行特定的化学反应获得 的产物。在这一过程中为获得较多的转化酶，我们需要确保菌体产酶的 最佳条件，诱导所需要的酶，抑制不需要的酶。
在菌体生长期结束后加入甾体底物，由于其不溶于但能溶于可 与水按一定比例混溶的有机溶剂，再加入培养液中转化。
➢ 1952年利用Peterson利用黑根霉产生的羟化酶将反应过程缩短为3个步 骤，产品售价每克$6；
➢ 1980年使用突变的分支杆菌分解植物油中的固醇以作为原料，产品价 格每克$0.46。
甾体生物转化的类型
➢ 羟化反应 ➢ 环氧化反应 ➢ 脱氢反应 ➢ A环芳构化 ➢ 还原反应 ➢ 水解反应
羟化反应
微生物转化的不同阶段
第一阶段：
菌体生长阶段，在该阶段中主要是供给菌体丰富的营 养，使其充分繁殖发育。（温度，pH，通气条件，培养及 成分。）
第二阶段：
微生物转化阶段，一般在生长阶段结束时加入底物溶 液，有些还需加入诱导剂。
常用的转化方法
分批培养转化法 利用酶进行生物转化 应用渗透细胞进行生物转化 应用孢子进行生物转化 应用固定化细胞进行生物转化 应用干燥细胞进行生物转化 静息细胞转化法
微生物转化的过程
微生物转化实验概要过程如下：
选择需要的菌株
培养成熟菌Hale Waihona Puke Baidu或孢子
选择合适的转化方式
转化培养或转化菌丝及孢子悬
浮液转化
转化液的分离提取 产品纯化
微生物转化的特点
由有活性中心都和特殊空间结构的酶作为催化剂； 酶催化作用的速度极快； 在常温常压和中性条件下进行高效转化反应，简化设备，降低成本； 生物转化的专一性，故底物不要求很纯（Ex. 粗淀粉） 转化过程容易调节（简单的用酸，碱，温度，离子调节） 转化过程产生杂质少，过程无毒，无臭，无味，可用于食品，医疗。 把含酶细胞或酶本身固定在载体上，可使转化过程连续化。 酶来源广泛。 可以实现化学反应无法做到的转化。
根据转化时微生物的状态可分为4种转化方式：
生长培养方式：在微生物培养的中后期加入底物，一边培养，一遍转化。 静态菌体悬浮方式：菌体充分生长后，离心得到的菌体悬浮在水或适当
的缓冲液中，再加入甾体进行转化。 混合培养方式：以A出发转化成B，需要两种以上的酶参与，单独转化费
时费力，所以常采用混合培养的方法，可以一步得到B 省略了中间过滤步骤。 固定化方式：一次制成的菌液反复用于转化是可行的，为了避免溶菌， 需要将其固定在水不溶载体上进行转化。
分析
转化过程中需要实时监测残余底物及生成产物的量及比例，以确 定转化终点。常用紫外分光光度法，HPLC等。
第四节 化的中 应用
新技术在微生物转
随着现代生物科学和生物技术的迅速发展， 以及一些分析测试技术的应用，微生物转 化也得到了进一步的发展。
基因工程技术、固定化细胞转化技术、双 水相转化技术、超声波技术、有机介质微 生物转化以及生物反应器等综合应用于微 生物转化反应体系，不仅可使转化的效率 成倍增长，而且还有可能使整个反应过程 连续、自动化。
同时，一些分析测试技术如核磁共振、质 谱等已经应用于微生物转化的在线检测。
一、基因工程技术在微生物转化
可以利用微生物来合成化学物质。
1864年巴斯德利用乙酸杆菌将乙醇氧化为乙酸。 工业化的里程碑是50年代美国普强药厂利用微生物黑根霉的羟化
酶将黄体酮转化为11α-羟基黄体酮，即对甾体化合物的结构改造。 固定化细胞，基因重组等技术的发展，能将几种不同合成基因构
建到同一个工程菌中使得一次培养同时进行几步转化反应，使微 生物转化在天然药物修饰中发挥更重要的作用。
缩合反应
麻黄碱：利用微生物将苯甲醛和乙醛缩合成1-苯基-1-羟基丙酮，再与 甲胺缩合，用活性铅还原，得麻黄碱。
脱氢反应
可的松脱氢后苯环形成双键，具有较高的抗炎活性。
碳链氧化降解
该法是降解甾体物质侧链的重要反应。采用链霉菌转化阿魏酸制 备香草醛为例。
第三节 微生物转化在药物中应用
甾体微生物转化
影响甾体生物转化的因素
物理因素
搅拌：增加搅拌速度，可以增加溶氧使基质均匀，提高转化率。 通气：增加氧的溶解，促进菌体生长及生物转化。
培养基的组成
碳源：常用的有葡萄糖，蔗糖，麦芽糖，糊精。 氮源：（有机，无机 金属离子：增加对转化有益的离子，去除负向影响的离子。
产物的分析与分离方法
纯化
需要用适当的与水不溶的有机溶剂将甾体从转化液种提取出来。 常用的有氯仿，乙酸乙酯，二氯甲烷等。溶剂的用量需根据产物在转化 液于提取液中的分配系数而定。提取时防止乳化。浓缩后利用各种色谱 法得到较纯的甾体转化物。
第二节 生物转化反应类型
1 氧化反应 2 还原反应 3 缩合反应 4 脱氢反应 5 烷烃双端氧化 6 碳链氧化降解
氧化反应
最为常见的生物转化反应，在甾体药物合成上应用较多。 环氧化反应是生物转化中的一个重要类型，C=C经氧化可形成环氧化 合物，可生产磷霉素。
还原反应
许多醛类，无论式脂肪族，还是芳香族，饱和或不饱和，羟基或卤素 取代都能被微生物还原成醇。
第一节 微生物转化反应概述
生物转化
是指外来化合物在体内，细胞或酶的作用经过一系列化学变化形 成其衍生物或分解产物的过程，也成为代谢转化。
生物转化常利用生长中的菌体，休止的菌体，酶，固定化酶以及 固定化菌体作为母体进行药物的转化。主要的优点有反应的区域专一 性和立体专一性。
微生物转化的发展
早在2500年前的春秋战国时期，人们就已经知道制酱和醋。 在宋代，采用老的曲子进行接种酿酒。不过当时人们并没有认识到
甾体合成技术的演进
➢ 1950年Kendall, Reichstein与Hench因发现类固醇的消炎作用而获得诺 贝尔奖。
➢ 1952年以化学方法以牛胆汁中的脱氧胆酸为原料合成肾上皮质激素， 反应共需31个步骤，产品售价每克$200；
孕酮
皮质激素
环氧化反应
A环芳构化
脱氢
甾体生物转化的原理和方法
甾体生物转化的原理不同于氨基酸，抗生素，蛋白质等的发酵。 而是利用微生物中特殊的酶对甾体的某一部位进行特定的化学反应获得 的产物。在这一过程中为获得较多的转化酶，我们需要确保菌体产酶的 最佳条件，诱导所需要的酶，抑制不需要的酶。
在菌体生长期结束后加入甾体底物，由于其不溶于但能溶于可 与水按一定比例混溶的有机溶剂，再加入培养液中转化。
➢ 1952年利用Peterson利用黑根霉产生的羟化酶将反应过程缩短为3个步 骤，产品售价每克$6；
➢ 1980年使用突变的分支杆菌分解植物油中的固醇以作为原料，产品价 格每克$0.46。
甾体生物转化的类型
➢ 羟化反应 ➢ 环氧化反应 ➢ 脱氢反应 ➢ A环芳构化 ➢ 还原反应 ➢ 水解反应
羟化反应
微生物转化的不同阶段
第一阶段：
菌体生长阶段，在该阶段中主要是供给菌体丰富的营 养，使其充分繁殖发育。（温度，pH，通气条件，培养及 成分。）
第二阶段：
微生物转化阶段，一般在生长阶段结束时加入底物溶 液，有些还需加入诱导剂。
常用的转化方法
分批培养转化法 利用酶进行生物转化 应用渗透细胞进行生物转化 应用孢子进行生物转化 应用固定化细胞进行生物转化 应用干燥细胞进行生物转化 静息细胞转化法
微生物转化的过程
微生物转化实验概要过程如下：
选择需要的菌株
培养成熟菌Hale Waihona Puke Baidu或孢子
选择合适的转化方式
转化培养或转化菌丝及孢子悬
浮液转化
转化液的分离提取 产品纯化
微生物转化的特点
由有活性中心都和特殊空间结构的酶作为催化剂； 酶催化作用的速度极快； 在常温常压和中性条件下进行高效转化反应，简化设备，降低成本； 生物转化的专一性，故底物不要求很纯（Ex. 粗淀粉） 转化过程容易调节（简单的用酸，碱，温度，离子调节） 转化过程产生杂质少，过程无毒，无臭，无味，可用于食品，医疗。 把含酶细胞或酶本身固定在载体上，可使转化过程连续化。 酶来源广泛。 可以实现化学反应无法做到的转化。
根据转化时微生物的状态可分为4种转化方式：
生长培养方式：在微生物培养的中后期加入底物，一边培养，一遍转化。 静态菌体悬浮方式：菌体充分生长后，离心得到的菌体悬浮在水或适当
的缓冲液中，再加入甾体进行转化。 混合培养方式：以A出发转化成B，需要两种以上的酶参与，单独转化费
时费力，所以常采用混合培养的方法，可以一步得到B 省略了中间过滤步骤。 固定化方式：一次制成的菌液反复用于转化是可行的，为了避免溶菌， 需要将其固定在水不溶载体上进行转化。
分析
转化过程中需要实时监测残余底物及生成产物的量及比例，以确 定转化终点。常用紫外分光光度法，HPLC等。
第四节 化的中 应用
新技术在微生物转
随着现代生物科学和生物技术的迅速发展， 以及一些分析测试技术的应用，微生物转 化也得到了进一步的发展。
基因工程技术、固定化细胞转化技术、双 水相转化技术、超声波技术、有机介质微 生物转化以及生物反应器等综合应用于微 生物转化反应体系，不仅可使转化的效率 成倍增长，而且还有可能使整个反应过程 连续、自动化。
同时，一些分析测试技术如核磁共振、质 谱等已经应用于微生物转化的在线检测。
一、基因工程技术在微生物转化
可以利用微生物来合成化学物质。
1864年巴斯德利用乙酸杆菌将乙醇氧化为乙酸。 工业化的里程碑是50年代美国普强药厂利用微生物黑根霉的羟化
酶将黄体酮转化为11α-羟基黄体酮，即对甾体化合物的结构改造。 固定化细胞，基因重组等技术的发展，能将几种不同合成基因构
建到同一个工程菌中使得一次培养同时进行几步转化反应，使微 生物转化在天然药物修饰中发挥更重要的作用。
缩合反应
麻黄碱：利用微生物将苯甲醛和乙醛缩合成1-苯基-1-羟基丙酮，再与 甲胺缩合，用活性铅还原，得麻黄碱。
脱氢反应
可的松脱氢后苯环形成双键，具有较高的抗炎活性。
碳链氧化降解
该法是降解甾体物质侧链的重要反应。采用链霉菌转化阿魏酸制 备香草醛为例。
第三节 微生物转化在药物中应用
甾体微生物转化
影响甾体生物转化的因素
物理因素
搅拌：增加搅拌速度，可以增加溶氧使基质均匀，提高转化率。 通气：增加氧的溶解，促进菌体生长及生物转化。
培养基的组成
碳源：常用的有葡萄糖，蔗糖，麦芽糖，糊精。 氮源：（有机，无机 金属离子：增加对转化有益的离子，去除负向影响的离子。
产物的分析与分离方法
纯化
需要用适当的与水不溶的有机溶剂将甾体从转化液种提取出来。 常用的有氯仿，乙酸乙酯，二氯甲烷等。溶剂的用量需根据产物在转化 液于提取液中的分配系数而定。提取时防止乳化。浓缩后利用各种色谱 法得到较纯的甾体转化物。
第二节 生物转化反应类型
1 氧化反应 2 还原反应 3 缩合反应 4 脱氢反应 5 烷烃双端氧化 6 碳链氧化降解
氧化反应
最为常见的生物转化反应，在甾体药物合成上应用较多。 环氧化反应是生物转化中的一个重要类型，C=C经氧化可形成环氧化 合物，可生产磷霉素。
还原反应
许多醛类，无论式脂肪族，还是芳香族，饱和或不饱和，羟基或卤素 取代都能被微生物还原成醇。
第一节 微生物转化反应概述
生物转化
是指外来化合物在体内，细胞或酶的作用经过一系列化学变化形 成其衍生物或分解产物的过程，也成为代谢转化。
生物转化常利用生长中的菌体，休止的菌体，酶，固定化酶以及 固定化菌体作为母体进行药物的转化。主要的优点有反应的区域专一 性和立体专一性。
微生物转化的发展
早在2500年前的春秋战国时期，人们就已经知道制酱和醋。 在宋代，采用老的曲子进行接种酿酒。不过当时人们并没有认识到