第四讲 微生物与生物转化
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生物转化的四种方式
生物转化的四种方式
生物转化是指生物体内或外部环境中发生的物质的转化过程。
常见的生物转化方式有以下四种：
1. 新陈代谢：生物体通过代谢作用将摄取的营养物质转化为能量和生物体所需的物质。
新陈代谢包括有氧呼吸和无氧呼吸两种方式，有氧呼吸需要氧气参与，产生大量能量；无氧呼吸则在缺氧条件下进行，产生较少能量。
2. 发酵：发酵是一种无氧代谢过程，通过微生物的作用将有机物转化为其他有用的物质。
常见的发酵过程包括酒精发酵、乳酸发酵等，广泛应用于食品工业、制药工业等领域。
3. 光合作用：光合作用是植物和某些细菌利用光能将二氧化碳和水转化为有机物质的过程。
光合作用中，光能被光合色素吸收，并通过光合电子传递链转化为化学能，最终用于合成葡萄糖等有机物。
4. 生物降解：生物降解是指生物体内或外部环境中的有机物质被微生物、酶等生物体降解为无机物质的过程。
生物降解广泛存在于自然界中，有助于环境中有机物的循环利用。
例如，土壤中的微生物可以降解有机肥料中的有机物质，将其转化为植物可以吸收的无机养分。
生物转化的四种方式
生物转化的四种方式
生物转化是指生物体内发生的某种物质或能量的转化过程。
常见的生物转化方式包括：
1. 新陈代谢：指生物体内物质的代谢过程，包括有机物的合成和分解。
例如，葡萄糖通过糖酵解反应代谢为能量，同时合成二氧化碳和水。
2. 光合作用：指植物和一些微生物利用光能将二氧化碳和水转化为有机物和氧气的过程。
光合作用是地球上最重要的生物转化过程之一。
3. 发酵：指微生物在缺氧条件下将有机物转化为产生能量和其他物质的过程。
例如，酵母菌发酵葡萄糖生成乙醇。
4. 生物合成：指生物体内通过化学反应将简单物质合成为复杂物质的过程。
例如，植物通过光合作用将二氧化碳和水合成为葡萄糖。
微生物转化
微生物转化微生物转化，又称菌素变异，是一个复杂的遗传学过程，用于改变某一微生物的遗传特征，包括遗传变异、表型变异和发育变异等。
在一些特定的情况下，它可以改变生物的一些基本特性。
1996年，通过微生物转化，美国哈佛大学的基因科学家甘葛尔和他的团队利用细菌和真核细胞的基因重组技术，首次创造出了基因重组菌素。
微生物转化的基本原理是以某一特定的DNA序列为起点，运用化学、物理和/或生物学手段将另一DNA序列转化（改变）后再植入目标菌种，从而改变菌种的遗传特征。
如此，通过基因重组，可以使某个特定的微生物具有某种新的或非常特殊的性质，而且更加适应于环境的需求。
此外，它也可以将许多有用的基因植入微生物中，以获得新的功能，如抗菌性、催乳或抑制酶活性等。
微生物转化有助于改进相关领域的经典科研技术开发，它为微生物的基因工程和制药产业提供了新的思路。
例如，微生物转化可以用于产生新的药物，制作蛋白质和生物反应器等。
此外，微生物转化也可以应用在自然资源保护等领域，让受污染的环境得到净化，让植物和动物得到保护。
通过微生物转化，科学家可以以更加可控的方式改变和改善生物的基因特性，这样可以更好地控制和应用复杂的遗传学过程，更好地满足社会的需求。
近年来，由于生物技术的快速发展，微生物转化技术也日益成熟，已经开始被应用于实际生产中，从而发挥出巨大的用武之地，得到了广泛的应用。
例如，为了提高食物的营养价值，微生物转化可以应用在食品加工中；为了提高蔬菜的产量和质量，微生物转化也可以应用于植物生物学中；为了提高动物的生活质量，微生物转化也可以应用在动物学研究中；为了改进环境条件，微生物转化也可以应用在环境保护领域等。
综上所述，微生物转化是一项重要的遗传工程，具有重要的意义和应用价值。
它可以改变微生物的遗传特征，改进物种的性状，改善食品的营养价值，改进动植物的生长发育等。
未来，微生物转化的应用将会影响着世界的生物领域，为科学研究和实际应用提供更多的可能性和新的方向和解决方案。
《生物转化》课件
生物转化的途径与类型
1
生物转化涉及多种途径和类型，如糖代谢、脂肪 代谢、蛋白质代谢等，这些途径和类型在生物体 内相互联系、相互协调。
2
生物转化的途径和类型可以根据不同的分类标准 进行划分，如根据反应类型、底物性质、酶的来 源等。
3
生物转化的途径和类型具有高度的灵活性和可塑 性，能够适应不同的生理需求和环境变化，促进 生物体的生存和繁衍。
加强生物转化的应用研究
将生物转化技术应用于制药、化工、环保等 领域，解决实际问题。
生物转化在可持续发展中的地位与作用
生物转化是实现可持续发展的 重要手段之一，能够将可再生 资源转化为有用的产品，减少
对化石资源的依赖。
生物转化技术可以生产可持续 的化学品和燃料，替代传统的 石化产品，降低碳排放。
生物转化技术可以应用于废弃 物资源化利用，减少环境污染
，促进循环经济发展。
生物转化技术可以应用于制药 行业，生产天然药物和手性化 合物，促进人类健康事业的发 展。
05
生物转化的实际应用案例
生物转化在制药行业的应用
生物转化在制药行业的应用广泛，主要用于生产手性药物、 复杂药物和天然产物的类似物。通过生物转化，可以实现对 药物分子的立体选择性修饰，提高药物的疗效和降低副作用 。
例如，将BT基因转入棉花中，可以培育出抗虫棉花品种，减少农药的使用量；将 抗草甘膦基因转入大豆中，可以培育出抗除草剂大豆品种，提高大豆的产量和品 质。
生物转化在能源领域的应用
生物转化在能源领域的应用主要包括生物燃料的开发和利用。通过微生物或酶的作用，可以将废弃物 或可再生资源转化为生物燃料，如乙醇、生物柴油等。
对环境压力。
生物转化可以产生一些对生物体有益的代谢产物，如 维生素、激素和抗生素等，这些产物对于维持生物体
微生物细胞转化的基本过程
微生物细胞转化是指受体细胞从外界直接吸收来自供体细胞的DNA片段，并与其染色体同源片段进行遗传物质的交换，从而使受体细胞获得新的遗传特性的过程。
转化过程主要包括以下几个步骤：
1. 制备培养系统：准备适合微生物生长和转化的培养基。
2. 加入底物：将需要转化的物质加入到培养基中。
3. 加入效应物：根据需要，加入适当的效应物来促进转化反应。
4. 保温反应：保持适当的温度和时间，让转化反应进行。
5. 监测反应过程：通过适当的方法监测转化反应的进度和效果。
6. 终止反应：当转化反应达到预期效果后，停止反应。
7. 产物分离：将转化生成的产物从培养基中分离出来。
微生物细胞转化是一个复杂的过程，需要根据具体情况进行适当的调整和优化。
在进行转化实验时，需要严格控制实验条件，以确保转化的成功率和产物的质量。
生物催化与生物转化优秀课件
2 富集培养
样品 富集培养
活的菌株
纯化菌株
分离 菌种
所需菌种Leabharlann 产品3 代谢产物的筛选
（1）筛选的要求；建立专一性的模型，操作简便，能进行 高通量筛选
（2）筛选方法
•抑制细菌细胞壁的合成：内酰胺酶抑制剂；以细胞壁模拟三 肽逆转糖肽抗生素，从而筛选新的抗生素
•抑制真菌的抗生素：根据真菌细胞壁合成筛选抑制剂
•环氧化反应
•C-C键的脱氢：多不饱和脂肪酸的生产
•碳链氧化降解：降解甾体物质侧链的一个重要反应，可用于制 备天然芳香物质。
•碳双键加水反应
（1）采用固定化的Aspergillus wentii中丁烯二酸酶催化反丁烯 二酸产生苹果酸，产量达237g/L, 转化率为82%。
（2）采用Rhizobium催化立体专一性加水反应生产治疗心脏病 药物L-肉碱，产量达300g/L, 转化率为95%
五 辛伐他汀的生物转化 •高浓度抑制产物形成 •营养 •养料
第四章 内酰胺抗生素母核的生物转化
1 6-APA的生成
大部分的半合成青霉素由6-APA合成，后者主要由酶法或化学法降解青霉 素而来。
化学法和酶法相比，酶法更具有优越性，使用的酶为青霉素酰化酶，又 称青霉素酰胺酶，按照优先水解青霉素的能力又分为：青霉素G酰化酶， 青霉素V酰化酶和氨苄青霉素酶。
生物催化与生物转化优秀课件
第一章 概论
一 微生物的多样性和微生物资源的开拓
1 微生物的生境： 指微生物在自然界中存在的场所，包括 土壤、水域、动物、植物、极端环境、特殊环境和大气
2 多样性的广度
人们在实验室所设计的培养基和培养条件还不能重复生境 中的条件
3 原核生物是未曾观察到的多数
微生物转化
5、应用固定化细胞进行生物转化
• 固定化细胞在适宜的转化条件下进行生物 转化能保持细胞相对活的状态，它的最大 优点是可以长期反复使用，有的能维持有 效催化达数月之久。 • 另外使用固定化细胞还使得产物提取简单， 便于自动化和大规模的工业化生产。 • 目前常用的固定化方法有聚丙烯酰胺聚合 法和卡拉胶包埋法。
应用于脱氢反应的主要是细菌
(2)羟基化反应
应用于羟基化反府的主要是放线菌
2、应用于水解反应
• 应用于水解反应的主要是细菌、酵母菌和霉菌
3、应用于还原反应
• 应用于还原反应的主要是酵母菌和霉菌。
4、应用于酰基化反应
• 应用于酰基化反应的主要是细菌
5、应用于降解反应
• 应用于降解反应的主要是细菌
2. 制备培养基 • 按微生物转化菌种的培养特征和转化反应 需要配制培养基；一般要求培养基的成分 能使菌丝生长丰满和富含需要的酶。
3 加转他底物 • 加底物时有两个同等重要的影响因素： 选择合适的菌种生长期加底物；选择加底 物的方法和方式。 4 添加刺激剂或抑制剂 • 添加抑制剂是抑制酶副反应或抑制其他 反应不良酶的生长；添加刺激剂是提高酶 活力和增加酶生长量。
第四节 微生物转化反应的特点
• 微生物转化反应，可以用静止地按洗涤 细胞进行研究．也可以用发酵方式进行转 化以及应用固定化细胞进行生产等。
它跟酶法转化和有机化学转化比较有以下 特点
•
1、反应条件温和、公害少、设备简单且反应速度 快 • ① 在微生物转化的反应中一般无需高压、强热 等比较苛刻的条件，只需在常温和pH为7左右的 环境下进行反应即可； • ② 原料除了普通的培养基和底物外没有其他化 学品，一般普遍认为公害比较少； • ③ 设备简单，反应条件比较温和，生产安全。 • ④ 微生物转化反应是酶催化的反应。在最合适 条件下，一秒内酶能催化底物转化成产物的分子 个数数量级是102～lO6
生物转化类型和机制
反应类型 羟化
辅酶类 型
金属
羟化
金属
环氧化
金属
杂原子氧化 黄素
Baeyer-
黄素
Villiger
羟化反应是一类重要的氧化反应
▪ 碳氢化合物中非活泼的C—H键的羟化是一 种非常有用的生物转化反应，传统的有机 化学合成方法几乎不能进行这样直接的羟 化反应。但很多微生物能够直接进行烷烃 和芳香烃的羟化反应，其中工业化应用最 为广泛的是甾体的羟化反应。
微生物(酶)转化是有机化学反应 中的一个特殊的分支
▪ 微生物转化的本质是某种微生物将一种物 质（底物）转化成为另一种物质（产物） 的过程，这一过程是由某种微生物产生的 一种或几种特殊的胞外或胞内酶作为生物 催化剂进行的一种或几种化学反应，简言 之，即为一种利用微生物酶或微生物本身 的合成技术。
微生物(酶)转化是有机化学反应 中的一个特殊的分支
环氧化反应
▪ 手性环氧化合物是一种重要的手性合成前体， 可与多种亲核试剂反应产生重要的中间体。
▪ 单加氧酶催化的烯烃环氧化反应可用于制备小 分子环氧化合物，其中有些产物是传统的化学 方法所不能制备的。
▪ 另外，由单加氧酶催化的硫醚的氧化反应也是 非常重要的，已经发现了很多能够催化这类反 应的微生物。
生物转化类型和机制
第一节 生物转化的定义与研究内容
▪ 生物转化的含义更强调的是： ▪ 用微生物或酶来进行药物合成（或其他有
机合成）过程中的某一步或几步反应，而 那些直接来源于微生物的代谢产物是微生 物进行“从头到尾”的合成过程。
在许多国外文献中经常能够看到的 描述这种技术的名词有：
▪ microbial transformation; ▪ microbial conversion; ▪ Biotransformation ▪ Bioconversion ▪ Biocatalysis ▪ enzymation等。
(推荐)《微生物转化》PPT课件
甾体指的是固醇或皮质类激素，由于这类激素都含有相 同的结构，所以统称 为甾体类激素。甾体在临床上应用十 分广泛，解热镇痛，消炎杀菌等。
甾体合成技术的演进
➢ 1950年Kendall, Reichstein与Hench因发现类固醇的消炎作用而获得诺 贝尔奖。
➢ 1952年以化学方法以牛胆汁中的脱氧胆酸为原料合成肾上皮质激素， 反应共需31个步骤，产品售价每克$200；
影响甾体生物转化的因素
物理因素
搅拌：增加搅拌速度，可以增加溶氧使基质均匀，提高转化率。 通气：增加氧的溶解，促进菌体生长及生物转化。
培养基的组成
碳源：常用的有葡萄糖，蔗糖，麦芽糖，糊精。 氮源：（有机，无机 金属离子：增加对转化有益的离子，去除负向影响的离子。
产物的分析与分离方法
纯化
需要用适当的与水不溶的有机溶剂将甾体从转化液种提取出来。 常用的有氯仿，乙酸乙酯，二氯甲烷等。溶剂的用量需根据产物在转化 液于提取液中的分配系数而定。提取时防止乳化。浓缩后利用各种色谱 法得到较纯的甾体转化物。
常用的转化方法
分批培养转化法 利用酶进行生物转化 应用渗透细胞进行生物转化 应用孢子进行生物转化 应用固定化细胞进行生物转化 应用干燥细胞进行生物转化 静息细胞转化法
微生物转化的过程
微生物转化实验概要过程如下：
选择需要的菌株
培养成熟菌丝或孢子
选择合适的转化方式
转化培养或转化菌丝及孢子悬
建到同一个工程菌中使得一次培养同时进行几步转化反应，使微 生物转化在天然药物修饰中发挥更重要的作用。
微生物转化的不同阶段
第一阶段：
菌体生长阶段，在该阶段中主要是供给菌体丰富的营 养，使其充分繁殖发育。（温度，pH，通气条件，培养及 成分。）
甾体合成技术的演进
➢ 1950年Kendall, Reichstein与Hench因发现类固醇的消炎作用而获得诺 贝尔奖。
➢ 1952年以化学方法以牛胆汁中的脱氧胆酸为原料合成肾上皮质激素， 反应共需31个步骤，产品售价每克$200；
影响甾体生物转化的因素
物理因素
搅拌：增加搅拌速度，可以增加溶氧使基质均匀，提高转化率。 通气：增加氧的溶解，促进菌体生长及生物转化。
培养基的组成
碳源：常用的有葡萄糖，蔗糖，麦芽糖，糊精。 氮源：（有机，无机 金属离子：增加对转化有益的离子，去除负向影响的离子。
产物的分析与分离方法
纯化
需要用适当的与水不溶的有机溶剂将甾体从转化液种提取出来。 常用的有氯仿，乙酸乙酯，二氯甲烷等。溶剂的用量需根据产物在转化 液于提取液中的分配系数而定。提取时防止乳化。浓缩后利用各种色谱 法得到较纯的甾体转化物。
常用的转化方法
分批培养转化法 利用酶进行生物转化 应用渗透细胞进行生物转化 应用孢子进行生物转化 应用固定化细胞进行生物转化 应用干燥细胞进行生物转化 静息细胞转化法
微生物转化的过程
微生物转化实验概要过程如下：
选择需要的菌株
培养成熟菌丝或孢子
选择合适的转化方式
转化培养或转化菌丝及孢子悬
建到同一个工程菌中使得一次培养同时进行几步转化反应，使微 生物转化在天然药物修饰中发挥更重要的作用。
微生物转化的不同阶段
第一阶段：
菌体生长阶段，在该阶段中主要是供给菌体丰富的营 养，使其充分繁殖发育。（温度，pH，通气条件，培养及 成分。）
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菌种的扩大培养－新鲜的种子，菌种的分离纯化和复壮 一级种子：摇瓶培养，由斜面培养基中接入 二级种子：种子罐，质量检查，是否染菌
多级种子罐：50立的发酵罐一般使用三级发酵 接种菌龄，接种量 发酵：酶、次级代谢产物，纯种培养，产品提取和精制
4.3 菌种保藏
目的：使菌种的生命得以延续并保持其生物学特性
▪ 菌种保藏方法：
状，上面有一层色彩鲜艳的干粉；菌落和培养基 连接紧密，那以挑取；菌落正反面颜色常常不一致
最突出的特性： 产生大量的、种类繁多的抗生素
目前已发现和分离的5500种以上的抗生素，其中 4400多种为放线菌所产生。
实际应用的有100多种，如链霉素、井冈霉素等。 此外，还可用于：
生产维生素、嵋制剂； 甾体转化、石油脱蜡、烃类发酵、污水处 放线菌的存在范围： 土壤中最多，河流、湖泊和海洋中较少； 大气中也有很多菌丝和孢子，食品、动物上
放线菌为单细胞，革兰氏阳性。
菌丝分度15分钟）
放线菌的代表属： a. 链霉菌属 b. 诺卡氏菌属：可用于污水处理等 c. 放线菌属：多为致病菌 d. 小单胞菌属 e. 链孢囊菌属：可形成孢子囊和孢囊孢子 f. 游动放线菌属：孢囊孢子可以运动
杆菌：杆状或圆柱形。发酵工业中最常用。 螺旋菌：细胞呈弯曲杆状。（弧菌、螺旋菌） 醋杆菌属、乳杆菌属、芽孢杆菌属、梭状芽孢杆菌属、 大肠杆菌、短杆菌属
2、放线菌 菌落呈放线状而得名（Actinomyces） 厌气菌——放线菌属 好气菌——链霉菌属，也是放线菌
放线菌多为腐生，少数寄生。 菌落特点：干燥，不透明，表面呈紧密的丝绒
▪ 菌种保藏中心
ATCC（美国标准菌种收藏中心） ARC（美国农业部农业研究服务部） NCTC（英国国立标准菌种收藏所） CBS（荷兰霉菌中心保藏所） IFO（日本大阪发酵研究所） 中国有7个菌种保藏中心
4.5 微生物生物转化
定义：利用微生物中特定的酶将人工合成的非天然 化合物进行生物转化，转化液经分离纯化可 得到所需产品的过程。
本质上与直接发酵法是一样的，为酶催化反应 不同：发酵法：多酶低密度转化
生物转化：单酶或者多酶的高密度转化 生物转化优点：工艺简单、产物浓度高、转化率及
生产效率高，副产物少
▪ 微生物种类多，含酶丰富，可进行多种生物转化反 应
▪ 微生物生物转化反应具有高度选择性，尤其是立体 选择性，可完成一般化学反应难以实现的反应
6. 液氮保藏法：效果好，方法简单，保藏对象最为广泛 浓的悬液加入灭菌后的分散剂中，加入最终浓度10％
的甘油或者5％的DMSO作为防冻保护剂，立即熔封。 缓慢冷却到－25 ℃左右，保藏在－196 ℃的液氮罐中。
使用时取出放入38－40 ℃的温水振荡融化，然后接种
7. 低温保藏法 －20 ℃的低温中用15％甘油保藏。
d.变异株的分离和筛选 初筛：菌落形态、色泽的变化（有时会和性质有关联） 指示平板：平板培养基中有指示剂 复筛：营养缺陷型（中间培养淘汰野生型） 缺陷的类型：氨基酸、维生素、嘌呤、嘧啶等 发酵实验，检查其生产性能
▪ 重组工程菌的构建
天然微生物中所需要的酶含量少，不能适应生物催化的要求 利用遗传工程技术可以构建新的工程菌 大量表达生物催化所需要的酶 满足工业化生产的需要
基本原理：根据微生物的生理、生化特点，人工的创造条件 使微生物处于代谢不活泼、生长繁殖受抑制的休 眠状态。——低温、干燥、缺氧
1. 斜面保藏法：4℃可以保藏3-6个月，到期转接新鲜斜面 容易发生变异、染菌，可覆盖矿物油
2. 穿刺保藏法：用接种针将菌种穿刺接入培养基的1/2处，然 后覆盖无菌液体石蜡（保持水分、隔绝氧气） 从中接出来时要进行复壮
如甾体、萜类与生物碱等有机化合物中非活泼氢的羟化反应
▪ 反应条件温和，适用于不稳定化合物的制备 ▪ 一般用游离细胞或者固定化细胞培养法
▪ 游离细胞转化法： 1、底物的预处理
考虑底物的各种性质，包括渗透性，溶解度，稳定性和毒
性等。
目的：保证底物和催化反应的酶能够相互接触 a.酶的位置：胞内，底物首先要和细胞充分接触 b.底物要透过细胞壁和细胞膜进入胞内
4. 微生物与生物转化
概述
▪ 生物催化剂：微生物（细胞直接进行催化） 酶的来源，催化非天然有机物发生转 化反应
▪ 优点：1、同时参与反应的酶的种类多——底物范围广
2、不需要进行酶的分离纯化——方便，廉价，高效 3、解决辅酶再生问题
▪ 缺点：1、副产物多——得率低
2、产物分离纯化困难
▪ 用途：有机酸、氨基酸、核苷酸、抗生素、维生素、甾体
剂如吐温系列物，剧烈搅拌，形成乳化液，以减少传 质阻力。
3、霉菌（mold） 是一类“丝状真菌”的通称，不是分类学上的名词，
在分类学上分别隶属于藻状菌、子囊菌和半知菌。 定义：凡在营养基质上生长形成绒毛状、蜘蛛网
状或絮状菌丝体的真菌，通称为霉菌。 霉菌的菌落特征和放线菌类似，但是菌落较大，
质地一般比放线菌疏松。 用途：酿酒、制酱、发酵工业、农业、纺织、 食品、皮革加工 但是也会引起发霉变质，是人和动植物致病。
赤霉菌、白僵菌（生物农药，昆虫病害的防治）
4、酵母（Yeast） 大多数酵母为单细胞。一般呈卵圆形、圆形、圆柱
形或者柠檬形。 常用的为：酵母属（Saccharomyces）和假丝酵母
（Candida）。主要有酿酒酵母、产阮假丝酵母、 热带假丝酵母、毕赤酵母等。
4.2 微生物的分离和选育
▪ 微生物菌种的分离
如：藻类、蓝细菌等 b. 光能异养微生物：有机物为氢受体还原二氧化碳合成有机物 c. 化能自养微生物：以无机物氧化所产生的化学能作为能源，
以二氧化碳作为碳源合成有机物 如：硝化细菌、硫细菌等 d. 化能异养微生物：大多数微生物都属于这类。
腐生型和寄生型
▪ 微生物的培养方法
a. 表面培养：类似自然培养 b. 固体培养：固体培养基，设备简单，自动化程度低 c. 液体深层培养：可控性好，设备投资大，工业化生产
工艺的选择 a. 提供构成细胞物质和代谢产物的有关营养物质 b. 提供能量 c. 加入前体物质用于提高产品的产量 包括：碳源（糖类、有机酸、醇和氨基酸、碳氢化合物、
二氧化碳－光合作用，化学能） 氮源：有机氮、无机氮、固氮微生物（空气中的氮） 无机元素：酶活、生长因子 生长辅助物质：营养缺陷，酵母粉、麦芽汁 水分：占细胞总量的80-90％ 气体：氧气和二氧化碳
4、性能鉴定 两步法：初筛（快速的培养和测定方法，也可在纯种分离时
进行） 复筛（比较复杂，精确，定量，可以确定目的菌种） 重复实验确认菌种性质，获得几株野生型菌株
▪ 诱变育种
野生型菌种性能尚达不到工业生产的要求，因此要进行 “育种：。
方法：基因突变（自然、诱发）
诱变：诱变剂处理（致死率和突变率，正突变和负突变）、 高效筛选方法：可以借鉴野生型的筛选方法
原理：将微生物或者孢子冷冻，然后在减压情况下利用 升华原理除去水分，使细胞的生命活度处于停止 状态，然后进行低温保藏（一般4℃）。
常用分散剂：脱脂牛奶和血清
菌种：处于生长后期的微生物，一般细菌培养24小时， 酵母培养72小时，放线菌和丝状菌种培养7天 加入分散剂并刮下微生物菌体或孢子，制成悬液 －30℃左右冷冻，真空干燥，使水分升华 干燥完毕后，抽真空并熔封。 复壮后使用
全世界由于霉变而不能食（饲）用的谷物约占2％。 目前已知的霉菌毒素达100种以上。其中毒性最强的 是由黄曲霉菌产生的黄曲霉毒素——致癌 常用霉菌： a.毛酶： 制作腐乳、豆豉等食品，甾体转化 b.根霉：淀粉酶、糖化酶（米根霉） c.曲霉：制酱、酿酒、制醋、酶制剂、有机酸、糖化
黑曲霉、米曲霉、黄曲霉 d.青霉：产黄青霉、橘青霉、娄地青霉、展青霉 e.红曲、木霉、地霉、假囊霉、脉孢菌、交链孢霉、
培养基优化：单因子实验、正交实验、代谢途径 研究内容：种类、浓度、比例、缓冲能力和种类 粘度、杂质影响、诱导物、前体、促进剂 的加入量、加入时间和加入方式， 各种影响因素相互的作用 文献报道、菌种基本要求、同类微生物的要求 细胞生长和产物形成动力学研究
▪ 微生物的营养类型：
a. 光能自养微生物：光合作用，光为能源，无机物作为氢的 受体还原二氧化碳合成有机化合物
激素等手性化合物的工业化生产
4.1 微生物学基础
▪ 微生物的特点 微生物（microorganism）：
所有形态微小，单细胞的或个体结构较为简单的多细胞 的、甚或没有细胞结构的低等生物的通称。
微生物类群十分庞杂，包括： 病毒(不具细胞结构)、立克次氏体、细菌、放线菌(单细胞) 酵母、霉菌、单细胞藻类、原生动物等
操作步骤： a. 载体 b. 基因的分离 c. DNA分子的切割和连接 d. 引入宿主细胞 e. 重组体的筛选 f. 外源基因的表达 （转录、翻译、修饰）
▪ 原生质体技术：多酶体系的重组
包括：原生质体诱变、转化或转染、融合等。
克隆天然酶基因
▪ 已知序列直接用PCR扩增 ▪ 未知序列
– 根据同类酶保守序列设计引物或探针钓基因 – 或探针钓基因
3. 干燥保藏法：适用于形成芽孢的细菌、形成孢子的丝状真菌 和放线菌。
原理：将微生物吸附在各种载体上，干燥后保藏。 使用时要进行复壮，常用的为灭菌的沙子和土壤
4. 悬液保藏法：将微生物悬浮于不含养分的溶液中，如蒸馏水 磷酸缓冲液或生理盐水中，然后密封保藏
5. 冷冻干燥保藏法：保藏期长，变异小，便于大量保藏，适用 范围广，是各保藏机构的主要方法
真菌细胞壁透过性较好，因此转化效率高 细菌细胞壁透过性较差，因此转化效率低 一般底物在转化体系中溶解度大，生物转化率就高
▪ 常用底物添加方法： 微生物转化反应一般在水溶液中进行，因此水溶性
强的底物可以高效进行反应，对于水溶性差的底物
(大多数生物转化的底物水溶性都比较差，非天然有机化合物)
可以采用下列方法： a.无毒性的溶剂溶解底物，如乙醇、丙酮等。 b.直接添加固体底物，然后添加无毒性的表面活性
多级种子罐：50立的发酵罐一般使用三级发酵 接种菌龄，接种量 发酵：酶、次级代谢产物，纯种培养，产品提取和精制
4.3 菌种保藏
目的：使菌种的生命得以延续并保持其生物学特性
▪ 菌种保藏方法：
状，上面有一层色彩鲜艳的干粉；菌落和培养基 连接紧密，那以挑取；菌落正反面颜色常常不一致
最突出的特性： 产生大量的、种类繁多的抗生素
目前已发现和分离的5500种以上的抗生素，其中 4400多种为放线菌所产生。
实际应用的有100多种，如链霉素、井冈霉素等。 此外，还可用于：
生产维生素、嵋制剂； 甾体转化、石油脱蜡、烃类发酵、污水处 放线菌的存在范围： 土壤中最多，河流、湖泊和海洋中较少； 大气中也有很多菌丝和孢子，食品、动物上
放线菌为单细胞，革兰氏阳性。
菌丝分度15分钟）
放线菌的代表属： a. 链霉菌属 b. 诺卡氏菌属：可用于污水处理等 c. 放线菌属：多为致病菌 d. 小单胞菌属 e. 链孢囊菌属：可形成孢子囊和孢囊孢子 f. 游动放线菌属：孢囊孢子可以运动
杆菌：杆状或圆柱形。发酵工业中最常用。 螺旋菌：细胞呈弯曲杆状。（弧菌、螺旋菌） 醋杆菌属、乳杆菌属、芽孢杆菌属、梭状芽孢杆菌属、 大肠杆菌、短杆菌属
2、放线菌 菌落呈放线状而得名（Actinomyces） 厌气菌——放线菌属 好气菌——链霉菌属，也是放线菌
放线菌多为腐生，少数寄生。 菌落特点：干燥，不透明，表面呈紧密的丝绒
▪ 菌种保藏中心
ATCC（美国标准菌种收藏中心） ARC（美国农业部农业研究服务部） NCTC（英国国立标准菌种收藏所） CBS（荷兰霉菌中心保藏所） IFO（日本大阪发酵研究所） 中国有7个菌种保藏中心
4.5 微生物生物转化
定义：利用微生物中特定的酶将人工合成的非天然 化合物进行生物转化，转化液经分离纯化可 得到所需产品的过程。
本质上与直接发酵法是一样的，为酶催化反应 不同：发酵法：多酶低密度转化
生物转化：单酶或者多酶的高密度转化 生物转化优点：工艺简单、产物浓度高、转化率及
生产效率高，副产物少
▪ 微生物种类多，含酶丰富，可进行多种生物转化反 应
▪ 微生物生物转化反应具有高度选择性，尤其是立体 选择性，可完成一般化学反应难以实现的反应
6. 液氮保藏法：效果好，方法简单，保藏对象最为广泛 浓的悬液加入灭菌后的分散剂中，加入最终浓度10％
的甘油或者5％的DMSO作为防冻保护剂，立即熔封。 缓慢冷却到－25 ℃左右，保藏在－196 ℃的液氮罐中。
使用时取出放入38－40 ℃的温水振荡融化，然后接种
7. 低温保藏法 －20 ℃的低温中用15％甘油保藏。
d.变异株的分离和筛选 初筛：菌落形态、色泽的变化（有时会和性质有关联） 指示平板：平板培养基中有指示剂 复筛：营养缺陷型（中间培养淘汰野生型） 缺陷的类型：氨基酸、维生素、嘌呤、嘧啶等 发酵实验，检查其生产性能
▪ 重组工程菌的构建
天然微生物中所需要的酶含量少，不能适应生物催化的要求 利用遗传工程技术可以构建新的工程菌 大量表达生物催化所需要的酶 满足工业化生产的需要
基本原理：根据微生物的生理、生化特点，人工的创造条件 使微生物处于代谢不活泼、生长繁殖受抑制的休 眠状态。——低温、干燥、缺氧
1. 斜面保藏法：4℃可以保藏3-6个月，到期转接新鲜斜面 容易发生变异、染菌，可覆盖矿物油
2. 穿刺保藏法：用接种针将菌种穿刺接入培养基的1/2处，然 后覆盖无菌液体石蜡（保持水分、隔绝氧气） 从中接出来时要进行复壮
如甾体、萜类与生物碱等有机化合物中非活泼氢的羟化反应
▪ 反应条件温和，适用于不稳定化合物的制备 ▪ 一般用游离细胞或者固定化细胞培养法
▪ 游离细胞转化法： 1、底物的预处理
考虑底物的各种性质，包括渗透性，溶解度，稳定性和毒
性等。
目的：保证底物和催化反应的酶能够相互接触 a.酶的位置：胞内，底物首先要和细胞充分接触 b.底物要透过细胞壁和细胞膜进入胞内
4. 微生物与生物转化
概述
▪ 生物催化剂：微生物（细胞直接进行催化） 酶的来源，催化非天然有机物发生转 化反应
▪ 优点：1、同时参与反应的酶的种类多——底物范围广
2、不需要进行酶的分离纯化——方便，廉价，高效 3、解决辅酶再生问题
▪ 缺点：1、副产物多——得率低
2、产物分离纯化困难
▪ 用途：有机酸、氨基酸、核苷酸、抗生素、维生素、甾体
剂如吐温系列物，剧烈搅拌，形成乳化液，以减少传 质阻力。
3、霉菌（mold） 是一类“丝状真菌”的通称，不是分类学上的名词，
在分类学上分别隶属于藻状菌、子囊菌和半知菌。 定义：凡在营养基质上生长形成绒毛状、蜘蛛网
状或絮状菌丝体的真菌，通称为霉菌。 霉菌的菌落特征和放线菌类似，但是菌落较大，
质地一般比放线菌疏松。 用途：酿酒、制酱、发酵工业、农业、纺织、 食品、皮革加工 但是也会引起发霉变质，是人和动植物致病。
赤霉菌、白僵菌（生物农药，昆虫病害的防治）
4、酵母（Yeast） 大多数酵母为单细胞。一般呈卵圆形、圆形、圆柱
形或者柠檬形。 常用的为：酵母属（Saccharomyces）和假丝酵母
（Candida）。主要有酿酒酵母、产阮假丝酵母、 热带假丝酵母、毕赤酵母等。
4.2 微生物的分离和选育
▪ 微生物菌种的分离
如：藻类、蓝细菌等 b. 光能异养微生物：有机物为氢受体还原二氧化碳合成有机物 c. 化能自养微生物：以无机物氧化所产生的化学能作为能源，
以二氧化碳作为碳源合成有机物 如：硝化细菌、硫细菌等 d. 化能异养微生物：大多数微生物都属于这类。
腐生型和寄生型
▪ 微生物的培养方法
a. 表面培养：类似自然培养 b. 固体培养：固体培养基，设备简单，自动化程度低 c. 液体深层培养：可控性好，设备投资大，工业化生产
工艺的选择 a. 提供构成细胞物质和代谢产物的有关营养物质 b. 提供能量 c. 加入前体物质用于提高产品的产量 包括：碳源（糖类、有机酸、醇和氨基酸、碳氢化合物、
二氧化碳－光合作用，化学能） 氮源：有机氮、无机氮、固氮微生物（空气中的氮） 无机元素：酶活、生长因子 生长辅助物质：营养缺陷，酵母粉、麦芽汁 水分：占细胞总量的80-90％ 气体：氧气和二氧化碳
4、性能鉴定 两步法：初筛（快速的培养和测定方法，也可在纯种分离时
进行） 复筛（比较复杂，精确，定量，可以确定目的菌种） 重复实验确认菌种性质，获得几株野生型菌株
▪ 诱变育种
野生型菌种性能尚达不到工业生产的要求，因此要进行 “育种：。
方法：基因突变（自然、诱发）
诱变：诱变剂处理（致死率和突变率，正突变和负突变）、 高效筛选方法：可以借鉴野生型的筛选方法
原理：将微生物或者孢子冷冻，然后在减压情况下利用 升华原理除去水分，使细胞的生命活度处于停止 状态，然后进行低温保藏（一般4℃）。
常用分散剂：脱脂牛奶和血清
菌种：处于生长后期的微生物，一般细菌培养24小时， 酵母培养72小时，放线菌和丝状菌种培养7天 加入分散剂并刮下微生物菌体或孢子，制成悬液 －30℃左右冷冻，真空干燥，使水分升华 干燥完毕后，抽真空并熔封。 复壮后使用
全世界由于霉变而不能食（饲）用的谷物约占2％。 目前已知的霉菌毒素达100种以上。其中毒性最强的 是由黄曲霉菌产生的黄曲霉毒素——致癌 常用霉菌： a.毛酶： 制作腐乳、豆豉等食品，甾体转化 b.根霉：淀粉酶、糖化酶（米根霉） c.曲霉：制酱、酿酒、制醋、酶制剂、有机酸、糖化
黑曲霉、米曲霉、黄曲霉 d.青霉：产黄青霉、橘青霉、娄地青霉、展青霉 e.红曲、木霉、地霉、假囊霉、脉孢菌、交链孢霉、
培养基优化：单因子实验、正交实验、代谢途径 研究内容：种类、浓度、比例、缓冲能力和种类 粘度、杂质影响、诱导物、前体、促进剂 的加入量、加入时间和加入方式， 各种影响因素相互的作用 文献报道、菌种基本要求、同类微生物的要求 细胞生长和产物形成动力学研究
▪ 微生物的营养类型：
a. 光能自养微生物：光合作用，光为能源，无机物作为氢的 受体还原二氧化碳合成有机化合物
激素等手性化合物的工业化生产
4.1 微生物学基础
▪ 微生物的特点 微生物（microorganism）：
所有形态微小，单细胞的或个体结构较为简单的多细胞 的、甚或没有细胞结构的低等生物的通称。
微生物类群十分庞杂，包括： 病毒(不具细胞结构)、立克次氏体、细菌、放线菌(单细胞) 酵母、霉菌、单细胞藻类、原生动物等
操作步骤： a. 载体 b. 基因的分离 c. DNA分子的切割和连接 d. 引入宿主细胞 e. 重组体的筛选 f. 外源基因的表达 （转录、翻译、修饰）
▪ 原生质体技术：多酶体系的重组
包括：原生质体诱变、转化或转染、融合等。
克隆天然酶基因
▪ 已知序列直接用PCR扩增 ▪ 未知序列
– 根据同类酶保守序列设计引物或探针钓基因 – 或探针钓基因
3. 干燥保藏法：适用于形成芽孢的细菌、形成孢子的丝状真菌 和放线菌。
原理：将微生物吸附在各种载体上，干燥后保藏。 使用时要进行复壮，常用的为灭菌的沙子和土壤
4. 悬液保藏法：将微生物悬浮于不含养分的溶液中，如蒸馏水 磷酸缓冲液或生理盐水中，然后密封保藏
5. 冷冻干燥保藏法：保藏期长，变异小，便于大量保藏，适用 范围广，是各保藏机构的主要方法
真菌细胞壁透过性较好，因此转化效率高 细菌细胞壁透过性较差，因此转化效率低 一般底物在转化体系中溶解度大，生物转化率就高
▪ 常用底物添加方法： 微生物转化反应一般在水溶液中进行，因此水溶性
强的底物可以高效进行反应，对于水溶性差的底物
(大多数生物转化的底物水溶性都比较差，非天然有机化合物)
可以采用下列方法： a.无毒性的溶剂溶解底物，如乙醇、丙酮等。 b.直接添加固体底物，然后添加无毒性的表面活性