台湾地区豢养动物粪便检体中梨形鞭毛虫与隐孢子虫存在情形

以生化免疫分析法及聚合酶連鎖反應法分析豢養動物糞便檢體中梨形鞭毛蟲與隱孢子蟲之存在情形
文浩洋1，許昺慕2，陳榮盛1，林玉庭3
1國立中正大學地震研究所研究生
2國立中正大學地球與環境科學系助理教授
3國立中正大學地球與環境科學系大學部學生
梨形鞭毛蟲(Giardia)與隱孢子蟲(Cryptosporidium)為可感染人類及其他多種生物，如魚類、兩棲類、鳥類及哺乳類之致病性微生物。

由隱孢子蟲感染所引起的疾病稱為隱孢子蟲症(Cryptosporidiosis)，梨形鞭毛蟲感染所引起的疾病則稱為梨形鞭毛蟲症(Giardiasis)。

此兩類致病性原生動物臨床患者通常會出現發燒、噁心、腹痛及腹瀉等症狀。

免疫力正常的患者病程結束後即可痊癒，免疫缺損者相關症狀則可持續數月之久，嚴重者甚至會導致死亡。

原蟲卵孢囊經由宿主攝食進入宿主體內後，通常會在小腸處破囊(Excystation)，進而釋放孢子體(Sporozoite)，經由宿主排放至環境中造成感染。

本研究採集八處採樣區共107個樣本，以酵素鍵結免疫呈色分析法(ELISA)、螢光免疫抗體法(IFA)以及聚合酶連鎖反應法(PCR)檢測梨形鞭毛蟲及隱孢子蟲於牛、豬、羊、雞、鴨等豢養動物糞便檢體之存在情形，最後並以DNA定序法判定梨形鞭毛蟲及隱孢子蟲之型別。

ELISA分析之結果顯示，糞便檢體中梨形鞭毛蟲與隱孢子蟲呈陽性反應之樣本比率皆為8.4％(9/107)。

以IFA分析梨形鞭毛蟲與隱孢子蟲，其呈陽性反應之比例皆為5.6％(6/107)。

至於PCR分析與DNA定序結果則顯示：梨形鞭毛蟲PCR呈陽性反應之樣本佔3.7％(4/107)，其型別均為G. lambla；隱孢子蟲PCR呈陽性反應之樣本佔5.6％(6/107)，其型別(species)為C. parvum、C. andersoni、C. muris calf。

關鍵字：梨形鞭毛蟲(Giardia)、隱孢子蟲(Cryptosporidium)、酵素鍵結免疫呈色分析法(ELISA)、螢光免疫抗體法(IFA)、聚合酶連鎖反應法(PCR)
1 前言
隱孢子蟲(Cryptosporidium)在1907年在土耳其就被發現，雖然當時土耳其引發隱孢子蟲症(Cryptosporidosis)大流行，但並不為人重視，直到1971年才有第一個牛隻感染隱孢子蟲的病歷紀錄，而人類感染的案例則到1976年才有紀錄；1982年發現隱孢子蟲的感染會造成愛滋病患者喪命後，隱孢子蟲症的問題才廣泛引起注意【1】。

隱孢子蟲是一種單細胞的寄生性原生動物，每個卵孢子中含有1至4個生殖芽孢(Sporozoite)，卵孢子通常會在宿主的小腸中破囊（Excystation），放出生殖芽孢進行生長及生殖，當卵孢子在小腸繁衍時，會刺激腸壁引起下痢，隱孢子蟲最終以卵孢子的型態【1】，由宿主的糞便排至環境中，如遇適當宿主攝入，則可以再次進行其生活史循環。

卵孢子的外形呈現卵形或圓球形，直徑隨著感染不同的宿主有所差異，直徑約4-6μm，為隱孢子蟲生命週期中的所存在的一種形式，它的特徵為具有2層卵囊壁（oocyst well）使其足以抵抗不適合生存的環境數個月，方能存在環境中伺機感染別的宿主【3】【4】。

隱孢子蟲症Cryptosporidiosis）是由隱孢子蟲（Cryptosporidium spp.）感染所引起的疾病，臨床患者通常會出現發燒、噁心、腹痛及腹瀉等症狀。

免疫力正常的患者病程結束後即可痊癒；免疫缺損者相關症狀則可持續數月之久，嚴重者甚至會導致死亡【1】。

梨形鞭毛蟲在十七世紀就已經被發現，1859年Lambl 最早發現並命名。

但直至1966年才證實梨形鞭毛蟲會引起人類腸道的感染，在美國、英國及加拿大都曾經大為流行，因此世界衛生組織(WHO)於1981年正式將梨形鞭毛蟲定義為致病性原生動物。

根據Craun 在1988年做的報告，大約有50％以上的水媒疾病是由梨形鞭毛蟲所引起，從1992年到1997年之美國境內爆發超過250萬件感染之案例【1】。

梨形鞭毛蟲是一種會導致腸道疾病的寄生性原生動物，它能感染溫血動物和人類。

梨形鞭毛蟲外部形狀為橢圓形(例如G. muris )或油滴狀(例如G. lamblia)，直徑長約8-14μm，內部的構造包括：二或四個細胞核、特殊的鞭毛結構以及染色體軸絲(Axoneme)。

梨形鞭毛蟲在囊孢期即具感染力，一旦進入營養體期(Trophozoite)其感染能力會消失。

囊孢期為其生命週期中的一個狀態，會因所處的環境狀況而自然發生，它有一個能抵抗惡劣環境的厚膜，能在4℃的水體中存活2到3個月【2】。

梨形鞭毛蟲主要寄生在動物內的十二指腸與空腸的絨毛之間，當成蟲隨著消化後的食物到大腸時，因大腸內的環境不利於成蟲的生存，便形成囊孢，而囊孢會隨著動物的糞便排放至環境中。

由梨形鞭毛蟲所引起的疾病稱為梨形鞭毛蟲症(Giardiasis)，一般在感染梨形鞭毛蟲之後十天，感染症狀即會出現，其症狀包括：水便性腹瀉、腸絞痛、胃腸脹氣、噁心、疲勞、精神欠佳、體重減
輕等，這些症狀大約會持續一個星期。

梨形鞭毛蟲症目前並無有效的治療法，只能由自身的免疫系統產生抗體而獲得痊癒；但是對於身體較弱的小孩、老人及免疫系統不全的人，卻會成為致命的疾病【1】。

2 設備與步驟
本研究使用三種不同的檢測方法，包括初步篩檢、確認實驗、完成實驗。

實驗流程圖如圖2.1所示。

首先將採樣收集的樣糞便檢體以免疫酵素呈色分析法，判定隱孢子蟲及梨形鞭毛蟲檢出率。

再將呈現陽性反應之糞便檢體以免疫螢光染色法，觀察隱孢子蟲及梨形鞭毛蟲存在之情形。

最後，將上述兩種方法皆呈現陽性反應之檢體，以聚合酶酵素連鎖反應法進行實驗，並將檢測出陽性反應之樣本以核酸定序法，分析出原蟲所屬之種別。

圖2.1 糞便檢體中隱孢子蟲及梨形鞭毛蟲存在性分析之實驗流程
2.1 採樣
本研究共採集了牛、豬、羊、馬、雞、鴨與觀賞鳥類等七種動物之糞便檢體，採樣區為柳營、關廟、大寮、屏東、新竹，採樣點多為私人農舍與專業酪農養殖
區。

所採集糞便檢體主要是以水便的為主，將動物所排放出新鮮糞便取置密封盒中，於24小時內運回實驗室作分析，並將糞便樣本存放在2~8℃下保存。

2.2 實驗分析
2.2.1 免疫酵素呈色分析法(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)
稱取3~5g之糞便檢體至於2ml的離心管中，滴入1200µl的緩衝稀釋液後，使用震盪器將離心管中糞便檢體、混合，使其均質化後，直立靜置10分鐘。

靜置後的離心管小心的將蓋子打開，取上澄液100µl滴入反應槽(96格反應凹槽)，再取正控制組(RIDASCEREEN Giardia and Cryptosporidium Positive Control)、負控制組(RIDASCEREEN Giardia and Cryptosporidium Negative Control)各100µl，滴入反應槽中作為對照組，反應時間25分鐘。

將反應槽中液體倒掉(勿左右甩動，以免樣本互相干擾)後，倒置於衛生紙上，輕輕的將殘留的液體拍打乾淨；使用無菌塑膠吸管吸取100µl Wash Buffer稀釋液(RIDASCEREEN Wash Buffer，以去離子水稀釋10倍)來洗反應槽，重複上述步驟，需洗五次。

取Reagent 4 (RIDASCEREEN Giardia and Cryptosporidium Biotin Conjuate)，每格凹槽滴入100µl(約2滴)，反應10分鐘後，將反應槽中液體倒掉(勿左右甩動，以免樣本互相干擾)後，倒置於衛生紙上，輕輕的將殘留的液體拍打乾淨；使用無菌塑膠吸管吸取100µl Wash Buffer稀釋液(RIDASCEREEN Wash Buffer，以去離子水稀釋10倍)來洗反應槽，重複上述步驟，需洗五次。

取Reagent 5 (RIDASCEREEN Giardia and Cryptosporidium Streptavidin Conjugate)，每格凹槽滴入100µl(約2滴)，反應5分鐘後，將反應槽中液體倒掉(勿左右甩動，以免樣本互相干擾)後，倒置於衛生紙上，輕輕的將殘留的液體拍打乾淨；使用無菌塑膠吸管吸取100µl Wash Buffer稀釋液(RIDASCEREEN Wash Buffer，以去離子水稀釋10倍)來洗反應槽，重複上述步驟，需洗五次。

取Reagent A (RIDASCEREEN Giardia and Cryptosporidium Substrate)、Reagent B每格凹槽滴入50µl(約1滴)，反應15分鐘，紀錄凹槽的顏色反應。

將陽性反應與陰性反應之糞便檢體作紀錄。

2.2.2 螢光免疫抗體染色法(IFA)
經過ELISA分析呈現陽性反應之糞便檢體，使用螢光免疫抗體(IFA)染色，在螢光顯微鏡下，以肉眼鏡檢的方式來計數梨形鞭毛蟲及隱孢子蟲卵囊。

其實驗之方法流程如下：
1. 取少量糞便檢體塗於特製玻片上(Spot On, Dynal)，放入45℃烘箱20分鐘
2. 在45℃下將烘乾後的樣本玻片取出，每片玻片內滴入65 µl甲醇，置入培養箱
中烘乾，使梨型鞭毛蟲或隱孢子蟲固定在玻片上。

3. 當原蟲固定完成後，取梨型鞭毛蟲與隱孢子蟲之螢光免疫抗體(Waterborne,
USA) 45 µl滴入玻片中，置於37℃培養箱中，反應30分鐘。

4. 樣本玻片從培養箱中取出後，以PBS將多餘的染劑清洗，每片玻片以無菌塑
膠吸管滴上一滴PBS (70 µl)，將玻片傾斜，使流洗液從玻片中流出，再用紙巾由玻片下緣將流洗液吸拭掉(注意不可碰觸到樣本且不得使玻片乾掉)，重覆此步驟五次。

5. 取Mounting Medium (Merifluor Mounting Medium) 50 µl滴入玻片，塗上封片
膠後蓋上蓋玻片，並使用紙巾吸去玻片周圍多餘的液體。

6. 最後，使用螢光顯微鏡進行鏡檢計數，如果無法馬上觀察計數，樣
本玻片必頇保存在0~8℃的暗處，同時需有保濕的處理，避免玻片
乾掉。

7. 將陽性反應與陰性反應的檢體作紀錄。

2.2.3 聚合酶連鎖反應(PCR)
2.2.
3.1 DNA純化萃取
本研究使用NucleoSpin Tissue試劑來抽取原蟲之DNA。

選擇最佳化試劑進行實驗，不但可提高DNA之純度，亦可避免樣品含有抑制PCR的物質影響PCR 之結果。

NucleoSpin Tissue
1.取糞便檢體約0.1g加入無菌水900μl，震盪均勻後，11000g離心5分鐘，吸
棄上清液留下約200μl
2.加入180μl 緩衝溶液T1，混合均勻。

3.加入25μl proteinase K，混合均勻，放置56度反應1-3小時，直至原蟲細胞
分解完成。

4.加入200μl緩衝溶液B3，震盪均勻後放置70度十分鐘。

5.加入210μl酒精（96-100％），震盪均勻。

6.將Tissue 濾管放置2ml收集管，將之前添加各種緩衝溶液之水樣移至濾管。

7.以11000g離心一分鐘，移除廢液。

8.添加500μl 緩衝溶液BW，11000g離心一分鐘，移除廢液。

9.添加600μl 緩衝溶液B5，11000g離心一分鐘，移除廢液。

10.再次11000g離心一分鐘，確定所有液體完全已通過濾管。

11. 將濾管移至1.5ml離心管，加入預熱70度的緩衝溶液BE，放置室溫一分鐘，
使DNA完全溶解，離心11000g一分鐘。

12.儲存於-20度冰箱。

2.2.
3.2 primer (引子)的設計
本研究中所使用之梨形鞭毛蟲與隱孢子蟲之引子其序列、位置及產物長度之資訊乃列於表2.1與表2.2。

表2.1 隱孢子蟲之引子序列、位置與產物長度
表2.2 梨形鞭毛蟲之引子序列、位置與產物長度
2.2.
3.3 PCR最佳操作條件
一般PCR 操作條件為，為了要充分讓雙股模板變成單股模板，故一開始設定94℃、5 min。

以94℃使DNA分離30 s，而煉合溫度(Tm)則依primer 的Tm 值加以改變，時間則為30 s，再以72℃進行複製延伸1 min，此為一個循環週期(cycle)；循環週期數則依實驗條件與結果決定。

最後再以72℃10 min 進行最終延長(final extension)
2.2.
3.4 PCR試劑配置
取萃取純化後的DNA 10 μL當作模板，Primer-F/Primer-R(10 mM each/μL)各2.5μL、5 μL PCRbuffer、1 μL 的dNTP Mix (40 mM ea ch/μL)、0.4 μL 的PCR Polymerase，再加入PCR-Grade Water 使得總體積為50 μL，以進行PCR 反應。

另外負控制組則以高溫高壓滅菌後之去離子水當作模板DNA。

3 結果與討論
本研究使用的三種檢測原蟲方法-免疫酵素呈色分析法、螢光免疫抗體染色法、聚合酶連鎖反應。

實驗順序為：先將檢體以免疫酵素呈色分析法檢測，經檢測呈現陽性反應之檢體，再以螢光免疫抗體染色法檢測，經過2項檢測皆呈現陽性反應之檢體，以聚合酶連鎖反應分析與定序。

3.1 不同豢養動物之檢測結果
本研究採集牛、豬、羊、馬、雞、鴨、觀賞鳥類之糞便檢體，共107個樣本。

本研究檢測不同豢養動物之感染梨形鞭毛蟲之結果如表3.1：牛的樣本75個，有5個呈現陽性反應，檢出率7％。

豬的樣本2個，所有樣本皆為陰性反應。

羊的樣本6個，有1個呈現陽性反應，檢出率17％。

鴨的樣本10個、雞的樣本11個、馬的樣本1個、觀賞鳥類的樣本2個，所有樣本皆為陰性反應；檢測隱孢子蟲之結果如表3.2：牛的樣本75個，有3個呈現陽性反應，檢出率4％。

豬的樣本2個，有1個呈現陽性反應，檢出率50％。

羊的樣本6個，有2個呈現陽性反應，檢出率33％。

鴨的樣本10個、雞的樣本11個、馬的樣本1個、觀賞鳥類的樣本2個，所有樣本皆為陰性反應。

3.2 不同地區之檢測結果
本研究依據不同地區檢測其感染梨形鞭毛蟲之結果如表3.3：新竹地區的樣本14個，有1個呈現陽性反應，檢出率7％。

關廟地區的樣本13個，所有樣本皆為陰性反應。

柳營地區的樣本51個，有5個呈現陽性反應，檢出率10％。

屏東地區的樣本18個，所有樣本皆為陰性反應。

大寮地區的樣本8個，所有樣本皆為陰性反應；檢測隱孢子蟲之結果如表3.4：新竹地區的樣本14個，有2個呈現陽性反應，檢出率14％。

關廟地區的樣本13個，所有樣本皆為陰性反應。

柳營地區的樣本51個，有4個呈現陽性反應，檢出率8％。

屏東地區的樣本18個，所有樣本皆為陰性反應。

大寮地區的樣本8個，所有樣本皆為陰性反應。

3.3核酸定序結果
梨形鞭毛蟲核酸定序之結果如表3.5所示。

G. lamblia是目前環境中最常見的型別，亦是目前研究與分析梨形鞭毛蟲之重點，G. lamblia可同時感染人類及其他動物。

文獻中指出G. lamblia之分類有兩種。

第一種分類為Nash 將G. lamblia 分為A、B 兩種群體(Assemblage)基因型，A群體主要感染宿主為人類，B群體主要感染宿主為人類與其他哺乳類動物。

第二種分類為Mayrhofer 將梨形鞭毛蟲更細分為八個群體，群體(A1、A2、B)皆可感染人類與目前常豢養之動物，屬於人畜共同傳染型，群體(C、D) 為感染狗之專一宿主，群體E為感染人類豢養畜牧之動物，如牛、羊、羊駝、山羊、豬【5】。

本研究檢測之樣本結果皆為G. lamblia，經由基因銀行進行其血清型比對，得到之結果依Nash之分類皆屬B 型；依Mayrhofer 之分類亦屬B型。

經由文獻得知，B型屬人畜共同傳染型，曾在國外造成集體感染之案例。

隱孢子蟲核酸定序之結果如表3.6。

本研究由豬
的糞便檢體中檢測出C. andersoni 。

C. andersoni主要感染宿主為牛、駱駝、綿羊，原蟲卵囊形狀與C. muris非常相似。

本研究另由牛與羊的檢體中檢測出C. muris calf、C. parvum。

C. muris主要感染齧齒目動物，而C. muris calf、是從感染牛隻身上分離出的型別，此型別屬於會感染人類的型。

C. parvum可感染包括人在內的152 種哺乳類動物，是所有型別中可感染最多種動物之型別，亦是目前環境中隱孢子蟲檢測之重點。

C. parvum可分為2型，第一型屬於會感染人類，第二型會感染其餘哺乳類動物【6】。

人類感染C. parvum與C. muris calf 主要原因為，近年來畜牧業的興盛發展，使得人畜接觸機會增加，無形中增加人畜共同感染之風險。

表3.1 不同豢養動物糞便檢體中梨形鞭毛蟲之檢測結果
表3.2 不同豢養動物糞便檢體中隱孢子蟲之檢測結果
4 結論
本研究對於不同區域與不同和豢養動物進行梨形鞭毛蟲及隱孢子蟲存在情形進行調查，並評估目前環境中原蟲存在之型別，是否可能造成人畜共同傳染之危機。

實驗結果顯示，目前環境中梨形鞭毛蟲及隱孢子蟲存在率並不高，但根據分析結果得知，所檢測出之型別皆屬於會傳染給人類之型別，仍不可不注意。

近年來人類之畜牧活動常飼養大量的經濟動物，一但豢養動物受到梨形鞭毛蟲或隱孢子蟲感染，而飼養者未經處理即任意排放含有原蟲卵囊之糞便至環境水體，將成為另一項嚴重的水污染來源。

在農業方面，若以動物糞便作為肥料來源，卻未適當處理，亦可能造成水源污染。

5 參考文獻
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