阿魏酸酯酶的制备
微生物发酵产阿魏酸酯酶及释放阿魏酸研究概述
微生物发酵产阿魏酸酯酶及释放阿魏酸研究
概述
阿魏酸是一种被广泛应用于医药、香料、化妆品等方面的化合物，具有重要的经济价值。
而阿魏酸酯酶作为阿魏酸的生产中关键的酶类，其产生利用已经成为研究的热点。
本文就阿魏酸酯酶及释放阿魏酸的微生物发酵研究进行概述。
第一步，阐述阿魏酸
阿魏酸是一种天然的有机化合物，其主要存在位于阿魏植物的根和叶子中。
阿魏酸具有良好的药理学和生物学特性，能够提高肠胃交换和消化酶的活力，改善恶心、呕吐等症状。
第二步，阐述阿魏酸酯酶的产生及作用
阿魏酸酯酶是一种能够将阿魏酸与酸酯结合起来形成一种叫阿魏酸酯的酶，其产生利用是生产阿魏酸的关键步骤。
阿魏酸酯酶可以通过微生物筛选抑或利用重组DNA技术进行产生。
在阿魏酸的生产中，酯化反应和酯化解释放反应都需要阿魏酸酯酶的参与。
第三步，阐述微生物发酵产阿魏酸酯酶及释放阿魏酸
微生物发酵产阿魏酸酯酶及释放阿魏酸是目前的研究热点。
微生物发酵通常利用需氧性菌产生阿魏酸酯酶，在发酵过程中阿魏酸酯酶会释放出阿魏酸。
目前已经成功利用微生物发酵技术大规模生产阿魏酸，并广泛应用于医药、香料、化妆品等领域。
综上所述，阿魏酸酯酶及其释放阿魏酸的研究已经成为制备和生产阿
魏酸的关键所在，并开展了大量的研究工作，还需加强对微生物筛选、酶的分离纯化及酶产生的机制方面的研究。
随着科技的不断进步，相
信阿魏酸酯酶在未来的生产和应用领域中，必将发挥更大的作用。
【CN110184256A】耐热耐碱阿魏酸酯酶的制备方法及其应用【专利】
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910384386.3(22)申请日 2019.05.09(71)申请人 齐鲁工业大学地址 250353 山东省济南市长清区大学路3501号(72)发明人 徐振上 王婷 张夙夙 (74)专利代理机构 济南竹森知识产权代理事务所(普通合伙) 37270代理人 朱家富(51)Int.Cl.C12N 9/18(2006.01)C12N 15/70(2006.01)C12N 15/55(2006.01)C12P 7/42(2006.01)C12R 1/225(2006.01)(54)发明名称耐热耐碱阿魏酸酯酶的制备方法及其应用(57)摘要本发明公开了一种耐热耐碱阿魏酸酯酶的制备方法及其应用，属于生物技术领域。
所述耐热耐碱阿魏酸酯酶的制备方法，包括：步骤1：以卷曲乳杆菌的DNA为模板，制备含有阿魏酸酯酶基因的重组大肠杆菌，所述阿魏酸酯酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；步骤2：将所述重组大肠杆菌经IPTG诱导发酵，去除菌体，制备得到阿魏酸酯酶。
本发明制备的阿魏酸酯酶的最适反应条件为65℃和pH 7.0，具有良好的耐热性和耐碱性特点，使其在造纸、食品、制药与饲料等领域中具有应用潜力。
权利要求书2页 说明书7页序列表2页 附图3页CN 110184256 A 2019.08.30C N 110184256A权 利 要 求 书1/2页CN 110184256 A1.一种耐热耐碱阿魏酸酯酶的制备方法，其特征在于，包括：步骤1：以卷曲乳杆菌的DNA为模板，制备含有阿魏酸酯酶基因的重组大肠杆菌，所述阿魏酸酯酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；步骤2：将所述重组大肠杆菌经IPTG诱导发酵，去除菌体，制备得到阿魏酸酯酶。
2.根据权利要求1所述的耐热耐碱阿魏酸酯酶的制备方法，其特征在于，所述步骤1中，制备含有阿魏酸酯酶基因的重组大肠杆菌的步骤包括：(1)以卷曲乳杆菌的DNA为模板，PCR扩增阿魏酸酯酶基因片段，PCR扩增所使用的上下游引物分别为：上游引物FaeLcr-F 5′-atacatatgtcccgcgttacaattg-3′下游引物FaeLcr-R 5′-gcgctcgagaaataatggttttaaaaattg-3′；(2)将所得阿魏酸酯酶基因片段经NdeI和XhoI双酶切，与相同酶切线性化的表达载体pET-22b(+)连接，构建得到重组表达载体pET-FaeLcr；将重组表达载体pET-FaeLcr转化至宿主菌种大肠杆菌中，得到重组大肠杆菌。
冷冻干燥法制备阿魏酸酯酶和阿拉伯木聚糖酶固体混合酶制剂
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冷冻干燥
样品预冻温度： 预冻时间： *#$F ；
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食品工业科技
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材料与方法
材料与仪器
黑曲霉（ ! "#$%&’(()" *’&$% ， )!22 %,-$- ） 广 州
环凯生化试剂公司， 经选育获得， 采用 34) 培养基保 藏； 麦麸 渣 南方面粉厂； 玉米麸皮 华北制药厂； 蔗 使用前浸泡除去残余蔗糖， 干燥、 粉碎； 淀粉酶、 远天酶制剂厂； 硫酸铵、 硫酸镁、 柠檬
的水， -$F 搅拌浸提 #K 。后用三足式离心机离心浸提 液， 去除固体残渣。所得上清液再用截留分子量为 # 万的超滤膜管， 在 #,F 、 进 口 压 力 $&%C3L 条 件 下 超 滤酶液， 浓缩液放置于 -F 冰箱中， 备用。
收稿日期： #$$(*$.*%, 作者简介：薛枫（ ， 女， 在读硕士， 研究方向： 功能性食品。 ")*)+） 基金项目：广州市科技攻关重点项目（ 。 &##%,%+-##$" ）
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筛选冷冻干燥保护剂
耐热耐碱阿魏酸酯酶的制备方法及其应用[发明专利]
![耐热耐碱阿魏酸酯酶的制备方法及其应用[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/b14a90b43b3567ec102d8aed.png)
专利名称：耐热耐碱阿魏酸酯酶的制备方法及其应用专利类型：发明专利
发明人：徐振上,王婷,张夙夙
申请号：CN201910384386.3
申请日：20190509
公开号：CN110184256A
公开日：
20190830
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明公开了一种耐热耐碱阿魏酸酯酶的制备方法及其应用，属于生物技术领域。
所述耐热耐碱阿魏酸酯酶的制备方法，包括：步骤1：以卷曲乳杆菌的DNA为模板，制备含有阿魏酸酯酶基因的重组大肠杆菌，所述阿魏酸酯酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；步骤2：将所述重组大肠杆菌经IPTG诱导发酵，去除菌体，制备得到阿魏酸酯酶。
本发明制备的阿魏酸酯酶的最适反应条件为65℃和pH 7.0，具有良好的耐热性和耐碱性特点，使其在造纸、食品、制药与饲料等领域中具有应用潜力。
申请人：齐鲁工业大学
地址：250353 山东省济南市长清区大学路3501号
国籍：CN
代理机构：济南竹森知识产权代理事务所(普通合伙)
代理人：朱家富
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反胶束萃取阿魏酸酯酶
反胶束萃取阿魏酸酯酶王镇发;陈培钦;邓秩韬;谢晨;李夏兰【摘要】利用十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)/正己醇/异辛烷反胶束萃取阿魏酸酯酶.考察pH值、离子强度、CTAB浓度对阿魏酸酯酶的CTAB/正己醇/异辛烷反胶束萃取及其反萃取的影响.结果表明:萃取的最佳条件为酶液透析24 h,pH值为12,萃取液为25 mmol· L-1 CTAB的正己醇/异辛烷溶液(体积比为1∶5),萃取率接近100％;反萃取的最佳条件为pH值为7的0.20 mol·L-1 KCl溶液,反萃取率可达79％.纯化后比活为356.7μkat·g-1,纯化倍数为6.9,SDS-PAGE电泳显示两条带.%The cetrimonium bromide/hexanol/isooctane reverse micelles extraction and backward extraction were used to purify feruloyl esterase. The effects of pH, ionic strength and cetrimonium bromide (CTAB) concentration on the cetrimonium bromide/hexanol/isooctane reverse micelles extraction and backward extraction were studied. The results showed that the extraction efficiency was nearly 100% when the optimal extraction conditions were used as followed: enzyme dialysis time 24 h, pH 12 and CTAB concentration in hexanol/isooctane solution (volume ratio 1:5) 25 mmol · L-1. The optimal condition of backward extraction was 0. 20mol · L-1 KCl with pH 7, and the efficiency of backward extraction was 79%. After extraction and backward extraction of the enzyme, specific activity was 356. 7 μkat · g-1, purification fold was 6. 9, and SDS-PAGE electrophoresis showed two bands.【期刊名称】《华侨大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2013(034)002【总页数】4页(P182-185)【关键词】阿魏酸酯酶;反胶束;萃取;十六烷基三甲基溴化铵【作者】王镇发;陈培钦;邓秩韬;谢晨;李夏兰【作者单位】华侨大学化工学院,福建厦门361021【正文语种】中文【中图分类】Q556.1阿魏酸酯酶（EC 3.1.1.73）是羧酸酯水解酶的一个亚类，属胞外酶，其主要生物功能是水解多糖与阿魏酸连结的酯键［1］.1987年，Mackenzie等［2］首次在橄榄色链霉菌中发现了阿魏酸酯酶；1991年，Faulds等［3］成功分离纯化了阿魏酸酯酶.到目前，已从真菌和细菌中得到超过40种阿魏酸酯酶［4-6］，各种微生物分泌的阿魏酸酯酶在氨基酸序列、肽链的结构、物化性质和催化特性上有所不同［4-7］.阿魏酸酯酶的分离纯化是其应用的基础，所以阿魏酸酯酶的分离纯化一直都是研究的一个重点.相比于层析法，反胶束萃取蛋白质具有成本低、回收率高、操作时间短和处理量大等优点.本实验室已从腐烂的木质纤维中筛选到1株产阿魏酸酯酶的菌株，并对其进行了鉴定［8］.本文研究反胶束萃取法分离纯化该菌种发酵所产的阿魏酸酯酶，为阿魏酸酯酶的应用提供前期的基础.1 实验材料和方法1.1 主要试剂和仪器反式阿魏酸标准品，美国Sigma公司；阿魏酸甲酯，华侨大学化工学院曾庆友老师合成；十六烷基三甲基溴化铵（CTAB），分析纯，北京佰利申科贸有限公司；异辛烷，正己醇，甲醇，氯化钾等均为市售，分析纯.DYY-8C型电泳仪，北京市六一仪器厂；Agilent 1100型高效液相色谱仪，美国Agilent公司；Thermo EC120小型垂直电泳系统，美国Thermo公司；ODS-C18型色谱柱（5μm，4.6 mm×250 mm），美国Thermo公司；MW3500型透析袋，上海绿鸟科技发展有限公司；XW-80A型漩涡混合仪，上海精科实业有限公司.1.2 实验方法1.2.1 发酵液的制备菌种及发酵液的制备，参见文献［9］.1.2.2 阿魏酸及阿魏酸酯酶酶活的测定阿魏酸的测定采用HPLC法［8］.阿魏酸酯酶活测定方法参见文献［9］.1.2.3 蛋白质浓度测定蛋白质浓度的测定采用考马斯亮蓝法［10］.1.2.4 反胶束萃取阿魏酸酯酶 1）萃取.用1 mol·L-1 HCl溶液、1 mol·L-1 NaOH 溶液调节酶液p H值，用KCl调节酶液的离子强度.称取一定质量的CTAB加入小试管中，再加入2 m L体积比为1：5的正己醇／异辛烷溶液，振荡片刻，加入等体积的酶液，漩涡振荡2 min，室温静置；待分层后测定下层水相的酶活力和蛋白浓度，计算萃取率（E）和纯化倍数（D）.2）反萃取.在另一只小试管中加入1.5 m L萃取相，再加入等体积一定p H值和浓度的KCl溶液，漩涡振荡2 min，室温静置；待油水分层后测定下层水相中的酶活力和蛋白浓度，计算总萃取率（Et）和纯化倍数.1.2.5 电泳将经反胶束萃取和反萃取的的酶液进行SDS-PAGE电泳.2 结果与讨论2.1 p H值对萃取率的影响在KCl浓度为0.01 mol·L-1时萃取阿魏酸酯酶，结果如图1所示.从图1可知：萃取液p H值为12时，萃取率最高，达到94.5%.p H值主要决定蛋白质所带的静电荷，进而改变蛋白质表面电荷和反胶束内表面电荷间的静电作用［11］.CTAB 是阳离子表面活性剂，极性头带正电.因此，只有在水相p H值大于蛋白质等电点时，蛋白质带负电荷，才能被包裹进反胶束中.该菌分泌的阿魏酸酯酶的p I值还未测定，但据报道，不同菌株来源的阿魏酸酯酶的p I值在3～10之间［12］.所以p H值越大，水相p H值和蛋白质等电点的差值越大，静电作用就越强，萃取率就越高.2.2 KCl浓度对萃取率的影响在p H值为12时萃取阿魏酸酯酶，结果如图2所示.从图2可知：随着离子浓度的增高，萃取率迅速降低，KCl浓度为0.5 mol·L-1时，萃取率只有15%.这可用双电子层理论［11］解释，即离子强度的增加减弱了表面活性剂极性头之间的斥力，反胶束体积变小，蛋白质甚至无法进入反胶束.图1 p H值对萃取率的影响Fig.1 Effect of p H value on extraction efficiency 图2 KCl浓度对萃取率的影响Fig.2 Effect of concentration of KCl on extraction efficiency2.3 CTAB浓度对萃取率的影响在p H值为12，KCl浓度为0时萃取阿魏酸酯酶，结果如图3所示.从图3可知：当CTAB浓度小于25 mmol·L-1时，萃取率随着CTAB浓度的增加而提高.这是因为表面活性剂浓度的增加使反胶束的数量增加，萃取率提高.当CTAB浓度达到25 mmol·L-1时，水相中的阿魏酸酯酶全部进入反胶束中，萃取率接近100%.2.4 反萃取时水相p H值对反萃取的影响图3 CTAB浓度对萃取率的影响Fig.3 Effect of concentration of CTAB on extraction efficiency优化条件下（p H值为12，CTAB浓度为25 mmol·L-1，KCl浓度为0）对阿魏酸酯酶进行萃取后，在0和0.15 mol·L-1的KCl溶液中进行反萃取阿魏酸酯酶，结果如图4所示.从图4可知：当KCl浓度为0.15 mol·L-1，p H值为5～10时，其反萃取率为70%左右；而当p H＞8时，反萃取率下降.若KCl浓度为0时，改变水相的p H值，即使当水相p H值低于阿魏酸酯酶的p I值时，阿魏酸酯酶带正电荷与CTAB的极性头所带的正电荷排斥，也无法实现阿魏酸酯酶从反胶束中的反萃取.这说明在萃取中起作用的不只是静电作用，还有其他的因素，如疏水相互作用［11］、立体相互作用和特异性相互作用［12］.2.5 反萃取时水相的KCl浓度对反萃取的影响用p H值为7的不同浓度KCl溶液进行反萃取阿魏酸酯酶，结果如图5所示.从图5可知：随着KCl浓度的升高，反萃取率逐渐增大，当KCl浓度为0.20 mol·L-1时，反萃取率最高为79%.当离子强度增大时，反胶束表面双电层变薄［13］，阿魏酸酯酶与反胶束表面之间的静电吸引减弱，酶在反胶束中的溶解度降低，从而使反萃取率提高.但进一步提高KCl浓度，反萃取率开始下降，当KCl浓度为0.25 mol·L-1时，萃取率仅为56%.这可能是较高的KCl浓度会导致酶的盐析，从而使反萃取率降低.图4 反萃取水相的p H值对总萃取率的影响Fig.4 Effect of p H in backward aqueous phase on the total extraction efficiency图5 反萃取水相KCl浓度对总萃取率的影响Fig.5 Effect of concentration ofKCl in backward aqueous phase on the total extraction efficiency透析后粗酶液在p H值为12，CTAB浓度为25 mmol·m L-1，KCl浓度为0下萃取，在0.2 mol·L-1 KCl下反萃取，酶活力（z）和蛋白浓度（c（蛋白质））的变化如表1所示.通过萃取和反萃取，阿魏酸酯酶回收率（Et）为79.0%，比活（Δz）从51.7μkat·g-1提高到356.7μkat·g-1，纯化倍数（D）为6.9.表1 阿魏酸酯酶纯化的各参数Tab.1 Summary of the purification of feruloylesterases溶液 z／μkat·L-1 c（蛋白质）／mg·L-1 Δz／μkat·g-1 D Et／%粗酶液11.0 211.0 51.7 - -萃取液 11.9 102.1 116.2 2.24 99.8反萃液8.6 24.1 356.7 6.90 79.02.6 反胶束纯化结果电泳图6为不同透析时间的阿魏酸酯酶液反胶束萃取纯化后的SDS-PAGE电泳图.其中：1为Marker；2为发酵液；3为经反胶束萃取及反萃取的纯化结果.从图6中可知：在条带35 ku左右有一条带，与本实验室报导的相近［9］，为阿魏酸酯酶的条带.同时还可以看出：CTAB反胶束纯化阿魏酸酯酶有较好的效果，尤其是对除去分子量大于阿魏酸酯酶的蛋白质.3 结论图6 阿魏酸酯酶液反胶束萃取后的电泳图Fig.6 Electrophoresis of feruloyl esterase after reverse micelles extraction研究结果表明：萃取时，透析后的粗酶液的p H值为12时，与等体积的25 mmol·L-1 CTAB反胶束溶液混合，阿魏酸酯酶萃取率最高，接近100%；反萃取时，将反胶束与等体积p H值为7的0.20 mol·L-1 KCl溶液混合，漩涡振荡3 min，阿魏酸酯酶总得率最高为79%，比活从粗酶液的51.7μkat·g-1提高到356.7μkat·g-1，纯化倍数为6.9.阿魏酸酯酶酶液经反胶束萃取后，SDS-PAGE电泳只显示两条带，说明CTAB／正己醇／异辛烷反胶束体系能有效地分离纯化阿魏酸酯酶.此方法与层析法相比，具有提取时间短、成本低、易于放大等优点.参考文献：［1］ CREPIN V，FAULDS C，CONNERTON I.Functional classification ofthe microbial feruloyl esterases［J］.Applied Microbiology and Biotechnology，2004，63（6）：647-652.［2］ MACKENZIE C R，BILOUS D，SCHNEIDER H，et al.Induction ofcellulolytic and xylanolytic enzyme systems in Streptomyces spp.［J］.Applied and Environmenta Microbiology，1987，53（12）：2835-2839.［3］ FAULDS C B，WILLIAMSON G.The purification and characterizationof 4-hydroxy-3-methoxycinnamic（ferulic）acid esterase from Streptomycesolivochromogenes［J］.Microbiology，1991，137（10）：2339-2345.［4］ TOPAKAS E，VAFIADI C，CHRISTAKOPOULOS P.Microbial production，characterization and applications of feruloyl esterases［J］.Process Biochemistry，2007，42（4）：497-509.［5］ BENOIT I，DANCHIN E G J，BLEICHRODT R J，et al.Biotechnological applications and potential of fungal feruloyl esterases based on prevalence，classification and biochemical diversity［J］.Biotechnology Letters，2008，30（3）：387-396.［6］ KOSEKI T，FUSHINOBU S，SHIRAKAWA H，et al.Occurrence，properties，and applications of feruloyl esterases［J］.Applied Microbiology and Biotechnology，2009，84（5）：803-810.［7］ FAZARY A E，JU Y H.Feruloyl esterases as biotechnological tools：Current and future perspectives［J］.Acta Biochimica et Biophysica Sinica，2007，39（11）：811-828.［8］李夏兰，胡雪松，范韵敏，等.一株产阿魏酸酯酶青霉菌株的筛选、鉴定及生长特征［J］.微生物学通报，2010，37（11）：1588-1593.［9］李夏兰，范韵敏，方柏山.来自桔青霉的阿魏酸酯酶的分离纯化、理化性质［J］.微生物学报，2010，50（8）：1058-1064.［10］汪家正，范明.蛋白质技术手册［M］.北京：科学出版社，2000：42-47. ［11］王金枝，曹学君.反胶束萃取技术分离胰激肽原酶［J］.中国生物工程杂志，2007，27（3）：93-99.［12］ KOSEKI T，FUSHINOBU S，SHIRAKAWA H，et al.Occurrence，properties and applications of feruloyl esterases［J］.Applied Microbiology and Biotechnology，2009，84（5）：803-810.［13］李凯，李成付，李加友，等.反胶束萃取精氨酸脱亚胺酶［J］.精细化工，2008，25（2）：163-166.。
阿魏酸酯酶的制备
阿魏酸酯酶的制备
薛枫;欧仕益;汪勇;黄才欢;刘子立
【期刊名称】《食品与发酵工业》
【年(卷),期】2006(032)004
【摘要】阿魏酸酯酶是一种新型酶制剂,在食品、饲料和造纸工业中都有着广阔的应用前景,但目前还没有工业化产品.文中研究了超滤和冷冻干燥制备阿魏酸酯酶的工艺条件,结果表明,酶液pH值为8.06时有利于酶蛋白截留;装液厚度为6 mm时,酶粉剂冷冻干燥时间为24 h;添加1%～2%的聚乙二醇可以保护酶液在冷冻干燥过程中不失活;阿魏酸酯酶的液体和固体产品在保存过程中均表现出了较好的稳定性.【总页数】4页(P46-49)
【作者】薛枫;欧仕益;汪勇;黄才欢;刘子立
【作者单位】暨南大学食品科学与工程系,广州,510632;暨南大学食品科学与工程系,广州,510632;暨南大学食品科学与工程系,广州,510632;暨南大学食品科学与工程系,广州,510632;暨南大学食品科学与工程系,广州,510632
【正文语种】中文
【中图分类】TS2
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阿魏酸酯酶 (ferulic acid esterase) 是最近才分离 纯化出来的一种酯酶 ,它是羧酸酯水解酶的一个亚 类 ,也是一种胞外酶[1 ] 。阿魏酸酯酶最主要的用途是 水解阿魏酸甲酯 、低聚糖阿魏酸酯和多糖阿魏酸酯中 的酯键 ,将阿魏酸游离出来[2 ] 。因此 ,在食品工业中 可利用该酶打断阿魏酸与细胞壁材料如麸皮 、秸秆中 多糖的交联 ,高效降解多糖并获得反式阿魏酸 (42羟 基232甲基222苯丙烯酸) 。它和阿拉伯木聚糖酶联合 作用的水解产物低聚糖 (主要是低聚木糖) 、阿魏酸都 是重要的功能性食品基料 ,戊糖可用于酒精发酵 、生 产木糖醇等 。饲料工业与造纸工业可分别利用此酶 提高纤维饲料的消化率和帮助脱除木质素 。可见 ,阿 魏酸酯酶具有广阔的应用前景[3 ,4 ] 。
计算剩余酶活 。
1121412 保护剂聚乙二醇浓度对酶活的影响
在酶液中分别加入 0105 %、011 %、015 %、1 %、
2 %、4 %、5 %的聚乙二醇 ,待冻干结束后测定酶活 。
计算剩余酶活 。
11215 液体及固体酶制剂保存过程中酶活保持率的
测定
将液体酶制剂 (加入2 000 mg/ kg 的山梨酸钾 ,
;2)
回收率
=
浓缩液总酶活 原酶液总酶活
×100
%
;3)
截留率
:膜对酶的截留情况
,通过截留率可以考察膜及该装置的质量水平
,
通常情况下 ,截留率大 ,有助于提高酶的收率 , 截留率 = (1 - 滤原过酶液液总总活活力力) ×100 % ;4) 滤过液中的蛋白质未检出 。
213 冷冻干燥时间对酶粉失水率及酶活的影响 采用冷冻干燥技术将液体酶制剂进一步制成固
图 1 超滤 p H 值对膜通量的影响 (进口压力 011 MPa ,温度 32 ℃)
212 酶液 p H值对超滤后酶活的影响 经过超滤后 ,酶液浓缩了 6 倍 ,大部分的酶蛋白
被截留 。从表 1 可知 ,在滤过液中阿魏酸酯酶只有微 量酶活 ,而蛋白质含量太低未检出 ;浓缩酶液蛋白质 浓度相比原酶液提高了 5 倍以上 。同样 ,酶活也提高 了 5 倍以上 ,说明中空纤维膜可以对阿魏酸酯酶起到 很好的浓缩作用 。当 p H 为 8106 和 4140 时 ,回收率 超过 100 % ,这是因为测定浓缩酶液酶活时用水稀释 6 倍 ,测定的酶活值再乘以稀释倍数 6 为浓缩酶液酶 活 (浓缩酶液对底物过饱和 ,需稀释后测定 ,有研究表 明发酵产阿魏酸酯酶稀释后酶活甚至比未稀释时更 高[4 ]) ,而稀释后浓缩酶液相比原酶液含有的阿魏酸 更少 ,消除了产物抑制效应 (酶液中的小分子物质阿 魏酸产生于发酵过程 ,也是该酶水解玉米皮的产物之 一 ,对水解反应有产物抑制效应 。在膜浓缩过程中小 分子的阿魏酸透过膜而大分子的酶被截留 ,经超滤后 的浓缩液和原酶液中的阿魏酸浓度相当 ,但是浓缩液 稀释 6 倍后阿魏酸浓度则大大降低 ,因此测定酶活时 消除了产物抑制效应) ,提高了酶活 ,所以回收率超过 了 100 %。根据回收率和截留率以及蛋白质浓缩倍
食品与发酵工业 FOOD AND FERMEN TATION INDUSTRIES
阿魏酸酯酶的制备 3
薛 枫 欧仕益 汪 勇 黄才欢 刘子立
(暨南大学食品科学与工程系 , 广州 ,510632)
摘 要 阿魏酸酯酶是一种新型酶制剂 ,在食品 、饲料和造纸工业中都有着广阔的应用前景 ,但目前还没有工业 化产品 。文中研究了超滤和冷冻干燥制备阿魏酸酯酶的工艺条件 ,结果表明 ,酶液 p H 值为 8106 时有利于酶蛋 白截留 ;装液厚度为 6 mm 时 ,酶粉剂冷冻干燥时间为 24 h ;添加 1 %～2 %的聚乙二醇可以保护酶液在冷冻干燥 过程中不失活 ;阿魏酸酯酶的液体和固体产品在保存过程中均表现出了较好的稳定性 。 关键词 阿魏酸酯酶 ,超滤 ,冷冻干燥
酶活 / U·mL - 1
2143 1101 16122 2105 1104 11177 119 0195 11151
总酶活 /U
29 118 10 093 32 433 24 643 10 425 23 549 22 753 9 541 23 018
浓缩倍数1) 6
回收率2) /%
111138
6
95156
酶活保持率/
%
=
保存试验结束时酶活 保存试验开始时酶活
×100
11216 酶活测定
阿魏酸酯酶酶活定义 :1 个酶活力单位 ( U) 是指
在温度 40 ℃、p H414 条件下 ,水解去淀粉玉米麸皮 1 min 产生 1μg 阿魏酸所需要的酶量 。
酶解底物为除去蛋白质和淀粉后的玉米麸皮 。
蛋白质和淀粉的去除按欧仕益等[6 ] 的方法进行 ,烘
此稀释 6 倍后测定 ,测定结果乘以 6 为浓缩液酶活) 。
11214 冷冻干燥
样品预冻温度 : - 20 ℃;预冻时间 : 12 h ; 干燥室
压力 10～100 Pa ;加热板加热方式 :空气自然加热 。
1121411 干燥时间对酶活的影响
将装液厚度为 6 mm 的样品进行冷冻干燥 ,分别
在干燥 8 、12 、16 、24 、30 h 测定酶活 ,并按重量法测定 水分含量 。取未冷冻及只冷冻未干燥样品测定酶活 。
发酵结束后 ,加入麸曲总重 10 倍的水 ,40 ℃搅拌 浸提 2 h 。后用三足式离心机离心浸提液 ,去除固体 残渣 ,获得清液为酶液 。 11213 超 滤
采用截留分子质量为 2 万 u 的超滤膜管 ,在进口 压力为 011 MPa 、温度 32 ℃的条件下进行试验 。
测定酶液 p H 值为 8106 、6134 、4140 三个不同条 件下的超滤通量 ,原酶液 、滤过液和浓缩液分别取样
2006 年第 32 卷第 4 期 (总第 220 期) 47
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无菌操作台 ,苏州净化设备厂 ;NU F 中空纤维超 滤膜组件 ,有效膜面积 016 m2 ,无锡市超滤设备厂 ; FD21 冷冻干燥机 ,北京博医康实验仪器有限公司 ;53 WBUV/ V IS 分 光 光 度 计 , 上 海 光 学 仪 器 厂 ; P YX2 250S2A 生化培养箱 ,科力仪器 ; 三足式离心机 ,张家 港市苏南化工机械厂 ; SHA2BA 恒温水浴振荡器 ,浙 江富华 ; KDN204A 定氮仪 。 112 试验方法 11211 发 酵
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环凯生化试剂公司 ,经选育获得 ,采用 PDA 培养基保 藏 ;麦麸 :南方面粉厂 ;玉米麸皮 :华北制药厂 ;蔗渣 : 使用前浸泡除去残余蔗糖 ,干燥、粉碎 ;淀粉酶、木瓜 蛋白酶 :远天酶制剂厂 。(NH4) 2SO4 、MgSO4 、柠檬酸 、 Na2 HPO4 、聚乙二醇 (分子质量 6 000 u) 均为分析纯。
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生产与科研经验
测定酶活 、蛋白质浓度 (注 :测定酶活时原酶液和滤过 液直接测定 ,浓缩液因浓缩 6 倍后对底物过饱和 ,因
1 000 mg/ kg 的尼泊金乙酯做防腐剂) ,不加保护剂 、
加 1 % PEG、加 2 % PEG 的固体酶制剂密封放置于
4 ℃冰箱 ,分别于 1 个月 、3 个月后测定酶活 。将加
1 % PEG、加 2 % PEG 的固体酶制剂密封放置于室温
环境下 1 个星期后测定酶活 。计算酶活保持率 。
蛋白质测定按凯氏定氮法进行[8 ] 。
2 结果与讨论
211 酶液 p H值对超滤膜通量的影响
超滤的目的是为了进一步浓缩酶液 ,以方便酶的 保存 ,并且除去发酵过程中产生的阿魏酸等小分子物 质 ,消除产物抑制 。当酶液 p H 值为 6134 时获得了 最大的超滤膜通量 (图 1) ,而 p H 值为 4140 时的膜通 量相比中性和碱性条件显著降低 。阿魏酸酯酶的等 电点在 4 左右 ,可推测在酸性条件下进行超滤时 ,由 于接近等电点 ,酶表面电荷较少 ,酶相互聚集 。这种 酶的聚集体更容易吸附到表面带负电荷聚砜膜的表 面 ,形成凝胶层 ,从而增加了膜的阻力 ,使得膜通量下 降 。当溶液 p H 值在 8106 时超滤膜通量也较中性条 件下要小 ,可能是因为黑曲霉发酵本身能够产生一些 壳聚糖类物质[9 ] ,这些物质在碱性条件下沉淀 ,形成 较大的颗粒 ,从而堵塞膜孔 ,导致膜通量的减小 。
干 ,粉碎 。 液体酶用稀酸调 p H 到 414 (酶的最适 p H) ,测定