埃博霉素产生菌的纯化及其意义
埃博霉素B的分离纯化研究
埃博霉素B的分离纯化研究埃博霉素B的分离纯化研究摘要：埃博霉素B是一种广谱抗生素，具有很高的药用价值。
本研究旨在通过不同的分离纯化技术，获得高纯度的埃博霉素B。
通过研究不同的色谱法和电泳法，确定了最适宜的分离纯化方法。
本研究结果可为埃博霉素B的制备提供科学依据。
引言：埃博霉素B是一种由真菌埃博卤曼菌（Streptomyces echinensis）产生的抗生素。
它广谱抗菌，对革兰氏阳性、阴性菌以及真菌都具有一定的抑制作用。
因此，埃博霉素B在临床上应用广泛，被认为是一种非常重要的药物。
然而，在埃博霉素B的制备过程中，需要高纯度的埃博霉素B，以确保药物的疗效和安全性。
方法：本实验从埃博卤曼菌的发酵液中分离得到粗品，然后通过一系列色谱法和电泳法对其进行纯化。
首先，采用凝胶层析法对粗品进行初步纯化。
将粗品溶液注入隔层层析柱中，通过滤纸层析纯化，去除部分杂质。
得到的部分纯净液通过检测其抗菌活性，确认埃博霉素B的存在。
接下来，采用逆流色谱法进一步纯化。
将部分纯净液溶液注入逆流色谱柱，调整流速和梯度洗脱条件，逐渐脱附不同组分。
通过检测不同组分的吸光度和抗菌活性，找到含有高纯度埃博霉素B的相应洗脱峰。
最后，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳法对逆流色谱纯化的埃博霉素B进行表征和纯化效果的确认。
将洗脱峰样品加入凝胶孔中，进行电泳分离。
通过染色和照相技术，观察和记录电泳板上对应的色带，并确定纯净的埃博霉素B色带。
结果和讨论：经过初步纯化的粗品经过凝胶层析后，抗菌活性得到明显提高，验证了凝胶层析的有效性。
通过逆流色谱法的进一步纯化，得到了一系列洗脱峰。
其中的一个洗脱峰在吸光度和抗菌活性测试中显示了与埃博霉素B相一致的特征，因此被确认为高纯度埃博霉素B。
进一步的聚丙烯酰胺凝胶电泳结果也验证了逆流色谱纯化的效果，电泳板上观察到与埃博霉素B相一致的色带。
结论：通过本研究，我们成功地采用凝胶层析法和逆流色谱法对埃博霉素B进行了分离纯化。
埃博霉素产生菌的纯化及其意义
埃博霉素产生菌的纯化及其意义作者：任闪闪刘延霆杨联合赵博宇牛春玲来源：《中国校外教育·高教(下旬)》2014年第10期随着比紫杉醇临床效果更佳的埃博霉素被发现，埃博霉素的产生菌——纤维堆囊菌日益引起重视，本文通过对其纯化方法进行探索，简化纯化步骤，缩短纯化周期，为埃博霉素的进一步研究奠定基础。
埃博霉素纤维堆囊菌分离纯化目前最为知名的抗肿瘤药物非紫杉醇莫属。
但由于紫杉醇提取于红豆杉，而红豆杉又数量有限，后续资源不足，因此寻找与紫杉醇的代替者就显得尤为重要。
埃博霉素（Epothilones）与紫杉醇的作用机制相同，埃博霉素A、B和D对癌细胞的生物活性与紫杉醇相当，甚至更强，尤其是埃博霉素B，其活性比紫杉醇强10-100倍.但其水溶性更高，分子量更小，结构更简单，对紫杉醇抗性的肿瘤细胞也有抗性。
埃博霉素来源于粘细菌的纤维堆囊菌属。
但由于粘细菌不能以单细胞的形态进行生长且生长缓慢，因此分离纯化困难，纯化周期长，因此进一步探索粘细菌尤其是纤维堆囊菌的快速分离纯化显得尤为重要。
1材料与方法1.1土样采集河南中医学院的土样及腐殖质。
1.2主要试剂和仪器设备常规试剂自上海生工；提取DNA相关试剂，PCR相关试剂均购自于北京天根生物公司。
主要仪器设备：体式显微镜stekeo discovery V8；倒置显微镜DP73 TH4-200等。
1.3分离、纯化所需的培养基CNST培养基：KNO3 0.5 g/L，Na2HPO4 0.25 g/L，MgSO4·7H2O 1 g/L，FeCl3 0.01 g/L，微量元素液1mL，pH 7.2。
1.4方法1.4.1土样采集的标准及初步处理将采集的有机质含量丰富（富含其它微生物）的土壤样品，自然风干后研成粉末状，平铺在灭过菌的平皿中，用配成适当浓度的制霉菌素液（1片/50mL无菌水）过夜处理，干燥后二次处理，将二次处理后干燥的土样装入灭过菌的离心管中待用。
菌种纯化的名词解释
菌种纯化的名词解释菌种纯化是一种用于分离和纯化细菌或真菌菌株的方法。
在微生物领域，菌种纯化是非常重要的实验技术之一。
通过菌种纯化，研究人员能够获得单一细菌或真菌菌株，并对其进行深入的研究，以揭示其特性、功能和潜在应用。
本文将从菌种纯化的目的、过程和应用等多个角度进行探讨。
首先，菌种纯化的目的是为了获得单一的、纯净的菌株。
在自然环境中，微生物菌群通常是复杂多样的，存在着大量不同种类的细菌和真菌。
然而，为了对某个特定菌株进行研究，研究人员需要确保所使用的样品中只含有单一的目标菌株。
通过菌种纯化，可以将目标菌株与其他杂质菌株分离开来，保证研究结果的准确性和可靠性。
菌种纯化的过程中，通常使用的技术包括菌落选择法、分离传代法和筛选法等。
其中，菌落选择法是最为常用和简单的一种方法。
该方法基于菌落形态、大小、颜色等特征，通过挑选表现出目标菌株特征的单个菌落，将其分离培养并进行传代，最终得到纯净的目标菌株。
对于一些难以分离的菌株，还可以采用筛选法，通过特定的培养基或试剂来选择目标菌株。
菌种纯化的过程需要仔细操作和耐心等待，确保所得到的菌株是纯净的。
菌种纯化在许多领域具有广泛的应用。
首先，菌种纯化在基础科学研究中扮演着重要的角色。
通过菌种纯化，科研人员可以对目标菌株进行系统的生物学、生化学和遗传学研究，揭示其特性和功能，为深入研究提供基础。
此外，在医学领域，菌种纯化也是研究病原微生物以及寻找新型抗菌药物的基础。
通过纯化分离病原菌株，可以研究其致病机制，寻找有效的抗菌药物，为临床治疗提供依据。
不仅在科学研究中，菌种纯化也在生物工程和农业领域具有重要意义。
生物工程的发展离不开对有用微生物的研究，菌种纯化可以获得纯净的工业微生物菌株，为生物合成、发酵生产等提供可靠的菌株资源。
在农业中，纯化微生物菌株还可以应用于生物农药和生物肥料的研制，为环保农业提供技术支持。
总之，菌种纯化是一项在微生物领域至关重要的实验技术。
通过菌种纯化，研究人员能够获得纯净的菌株，进行深入的研究和应用。
抗生素等生物制品中的纯化技术
抗生素等生物制品中的纯化技术随着现代医学技术的不断发展，生物制品如抗生素等的应用越来越广泛。
而这些生物制品中的纯化技术也变得越来越重要。
本文就来探讨一下抗生素等生物制品中的纯化技术。
一、纯化技术对生物制品的重要性纯化技术是生物制品制备过程中最基本的技术之一。
它可以减少生物制品中的杂质，提高生物制品的纯度和活性，从而提高生物制品的效果和安全性。
因此，纯化技术对生物制品的生产和应用具有非常重要的意义。
二、纯化技术的种类纯化技术主要包括三种：层析技术、电泳技术和逆流制备技术。
1.层析技术：层析技术是利用分子在固定相和移动相之间的分配系数差异进行纯化的一种技术。
层析技术包括吸附层析、醇沉淀层析、离子交换层析、氢氧化铝层析、凝胶滤过层析等。
2.电泳技术：电泳技术是利用分子在电场中的电性质进行纯化的一种技术。
电泳技术包括凝胶电泳、等电点聚焦电泳、二维凝胶电泳等。
3.逆流制备技术：逆流制备技术是利用逆水流将杂质带走，从而达到纯化的一种技术。
逆流制备技术包括逆流超滤、逆流凝胶过滤、逆流离子交换等。
三、抗生素等生物制品的纯化技术抗生素等生物制品的纯化技术主要采用层析技术和电泳技术。
1. 抗生素的层析技术抗生素的层析技术主要包括吸附层析和离子交换层析两种。
吸附层析是利用抗生素与特定吸附剂的亲和力进行分离的一种层析技术。
离子交换层析是利用离子交换材料对抗生素中离子进行吸附分离的一种层析技术。
2. 抗生素的电泳技术抗生素的电泳技术主要包括凝胶电泳和等电点聚焦电泳两种。
凝胶电泳是利用凝胶的筛选作用进行分离的一种电泳技术。
等电点聚焦电泳是利用抗生素在不同条件下具有不同等电点的特性进行分离的一种电泳技术。
四、结语随着生物制品的应用范围越来越广泛，生物制品的纯化技术也变得越来越重要。
抗生素等生物制品的纯化技术既有层析技术的高效快捷，又有电泳技术的高分辨率，可以满足不同生物制品的不同需求。
未来，生物制品纯化技术的发展将不断推进，为临床治疗提供更加精准、高效、安全的生物制品。
埃博霉素高产菌株的诱变筛选
①收集的细胞 以 ｌ Ｌ Ｂ 缓 冲液洗 涤细胞表 面的培养基 ， ｍＰＳ 重复洗涤三次 ， 常规离心后收集细胞 。②细胞再 以 １ ｍ Ｐ Ｓ混 ０ ＬＢ 匀悬浮 ， 振荡摇匀 ３ ｒ ｎ尽量使聚团细胞 分散。③ 分散 的细胞 ０ ｉ， ａ 采用无菌脱脂棉进行过滤 。 ④血球计数板对细胞进行计数。 Ｂ ＰＳ 缓冲液稀释使菌悬液 中的细胞数为 １８ ｉｍ 。 ０ ￣ ／ Ｌ ￣ １ ． ４化学诱变筛选 取菌悬液 １ｍＬ于 １０ Ｌ小 摇瓶 中 ，向小摇瓶 中加入诱 ０ ０ｍ 变剂硫酸二乙酯 ， 保持终浓度分别为 １ ２ ３ ４ ５ ％、 ％、％、％、％。诱 变时间允别选 择为 １ ５分钟 ，Ｏ分钟 ，５ 钟 ，０ ３ ４分 ６ 分钟 。 诱变结 束后 ， 向摇瓶 中加人 ｌ Ｌ ｍ 浓度为 ２ ％的硫代硫 酸钠溶液 来终止 诱变 ， 之后 ，０ ｔ ２ ０￣ Ｌ菌液涂布于 Ｍ２ ６固体平 板上 ，０ ３ ℃培养 ６ ， ｄ 观察生长情况并且绘制浓度致死 曲线和绘制致 死 曲线 ，选择
马铃薯淀粉 、 萄糖 、 葡 酵母 浸粉 （ 国 Ｐ Ｏ Ｇ 美 Ｒ ＭＥ Ａ公 司 ） 诱变前都有明显提高（＜． ） ， Ｐ ０ ５。具体情况见表 １ ０ 。 表 １诱变前后埃博霉素产量对 比（ ／ ） ｍｇ Ｌ 硫酸二 乙酯 （ 北京 化学试剂有 限公司 ）ＨＬ 一 ６大孔中性树 脂 、 Ｄ１ （ 上海华羚树脂有限公司 ）Ｂ Ｈ一 １２电热恒 温培养箱 （ 、Ｐ ９６ 上海 恒 ）Ｚ －一 ０Ｄ全温型多振幅高速轨道摇床 （ ，ＨＷＹ ２ ０ 上海智城 ） ， Ｒ 一 ２旋转蒸发器 （ Ｅ５ 上海青浦沪西仪 器厂 ）高效液相色谱 （ ， 日 本岛津公 司） 。 １ Ｇ １菌体 的培养 ．Ｌ ３ ２ ① 平 板 中生 长 的 菌 株 Ｄ Ｓ５接 种 于 Ｃ Ｓ’ 纸 片上 ， ３讨 论 Ｅ３ Ｎｑ滤 埃博霉素具有很强 的抗肿瘤活性 ， 能在较低浓度杀死癌细 ３℃培养 ４。②将分解 的滤纸 片直接 转接人液体 Ｍ ６ Ｏ ｄ ２ 培养基 。 。 粘细菌为 中，０ ， ０ｍｎ ３￣ １ ｒ ｉ摇床培养 ６ 。③将 Ｍ ６ Ｃ ２／ ｄ ２ 培养基 中生 长的细 胞脚为此选择合适 的产埃博霉素菌株价值重大问其 中 目前 ， 由于埃博霉素在粘 细菌 中产量 胞培养液转入含有玻璃 珠转子的摇瓶 中 ，振荡摇匀 ３ ０分钟 ， 主要的产埃博 霉素菌株 ， 难 且基 ， 尽量使 聚团细胞分散 。④ 分散的细胞 以 １％接种量重 新接 种 较少 ， 以大规模发酵生产 ， 因工程操作较为繁琐困难目所 ０ 即针对 于新鲜的 Ｍ２ 培养基 中， ３ ℃下 ， １０／ ｉ ６ 在 ０ 以 ２ ｒ ｎ摇床培养 ３ 。 以在提高埃博 霉素 的产量研究普遍放 在了两个方面上 ， ａ ｒ ｄ ６ １ 。 ⑤培养后 的细胞 置于 ４ｃ ｑ环境 中放 置 ６ ， ｈ低温诱 导同步生长 。 埃博霉素的异源表达以及粘细菌开展的菌株选育［ 本文以 ｐ Ｈ耐受 的 Ｄ Ｓ ５高产 菌株 作为出发菌株 ，为 了 Ｅ３ ⑥低温诱导 的细胞 以 ２％的接种 量再 次接种于新鲜的 Ｍ ６ ０ ２ 培 养基 中 ， ３ ℃、２ ｒ ｉ 于 ０ １０／ ｎ摇床 培养 １ ， 细胞处 于同步生 长 进一步提高埃 博霉素产量 ，采用 了传统 的硫 酸二 乙酯对菌株 ａ ｒ ｄ使 进行诱变 ， 筛选到了 ６株产量有所提高 的突变株。结果显示高 状态 。 产菌株的埃博霉素 Ａ与 Ｂ的平 均产 量与诱变前都有明显提高 １ － ３菌悬液制备
埃博霉素的生物合成
埃博霉素的生物合成阎家麒1，鲁习金2（1. 湖北荆工药业有限公司，湖北京山431800； 2. 湖北荆工生物工程有限公司，湖北荆门448124）摘要：埃博霉素是由粘细菌纤维堆囊菌产生的次级代谢产物。
与紫杉醇相似，它们可以抑制微管解聚，使细胞有丝分裂终止在G2-M期。
在p-糖蛋白表达型的多药耐药性肿瘤细胞系中维持很大的毒性，而且比紫杉醇有更好的水溶性。
全合成埃博霉素虽然可以实现，但是与发酵方法相比尚无经济可行性。
本文介绍了埃博霉素生物合成基因簇的克隆和异源表达，同时也对Red/ET重组技术的特点以及在埃博霉素生物合成中的应用进行了详细阐述。
关键词：埃博霉素（埃坡霉素，埃坡西龙）；生物合成；埃博霉素基因簇；埃博霉素D内酰胺衍生物；Red/ET 重组技术埃博霉素（埃坡霉素，埃坡西龙，epothilones）是由黏细菌纤维素堆囊菌分泌的结构为16元内酯大环为中心体，噻唑环配基为侧链的一类细胞毒性化合物，是一种具有类似紫杉醇微管蛋白聚合和微管稳定作用的新抗肿瘤药物（图1）。
Fig.1 epothilones作者简介：阎家麒(1939-), 男，教授，专业方向：基因工程制药，天然产物有机合成。
Tel: 013469789911 E-mail: yanjq99@1埃博霉素的发现埃博霉素A和B是在20世纪90年代由Höfle及其同事最先从南非Zambesi河岸的泥土中找到一种黏细菌纤维素堆囊菌Sorangium cellulosum(Myxococcales) 菌株So ce90，从其培养物中分离提取了一种抗真菌活性的化合物并对其进行性质研究[1,2]。
首先用光谱和X－射线衍射晶体学方法测定了埃博霉素的结构排布, 该化合物是依据它的结构亚单位，epo tide, thi azo l和ket one命名的（图2）。
Fig.2 The naming of epothilones1995年前后，Bollag等人发现埃博霉素是一种具有类似紫杉醇的促微管蛋白聚合特性、结构新颖的抗肿瘤化合物。
纤维堆囊菌基因转化体系建立及埃博霉素生物发酵和纯化工艺研究
纤维堆囊菌基因转化体系建立及埃博霉素生物发酵和纯化工艺研究来源于纤维堆囊菌(Sorangium cellulosum)二级代谢产物的埃博霉素是一种新型抗癌剂,机制与紫杉醇相似,能够稳定微管蛋白,抑制细胞的分裂和增殖。
但由于它具有更好的水溶性、简单的化学结构,并且对紫杉醇的耐受细胞表现出很大活性以及不会象紫杉醇那样产生内毒素等的优点,激发了科研人员和制药公司的极大热情,成为化学界、生物界和临床医学研究的热点。
在化学全合成、生物发酵、生物的合成改造、活性与构象关系的推导、基因簇异源表达等方面取得了卓越的成就。
当前已经有5种埃博霉素类活性物进入II期和III期临床评估,作为新的第三代化疗药物走向市场指日可待。
但作为埃博霉素的来源菌—纤维堆囊菌,因为传代时间长、菌株特异性强、耐药范围广、聚集生长和可使用的分子标记少等不利因素,使得对纤维堆囊菌基因操作极为困难,对埃博霉素合成的基因调控、操纵子的工作方式,转录的控速部分等问题的认知近于空白。
除此之外,到目前为止人们还没有在纤维堆囊菌乃至粘细菌中找到一个能自主复制,独立于宿主细胞的质粒。
以上种种原因成为限制对纤维堆囊菌所产生的丰富的、具有生物活性二级代谢产物进行研究和利用的瓶颈。
本文以埃博霉素的阳性菌株——S. cellulosum So ce90为对象,研究了该菌株的发酵条件和纯化的工艺流程,并通过利用广谱可移动质粒pRK415构建含有EpoPro片段(埃博霉素合成酶基因中epoA起始密码子(GTG)上游(-890～-1bp)区域)和荧光蛋白基因的pRP-GFP载体,建立了针对该菌株的基因转化体系。
主要结论如下:①以高效液相色谱为检测手段,埃博霉素的产量为指标,比较9种不同培养基,筛选出适合S. cellulosum So ce90的培养基和发酵条件。
适宜培养基(II号发酵液)的主要成分是:2g/L脱脂大豆粉,10g/L马铃薯淀粉,8g/L 脱脂奶粉,2g/L酵母浸膏,2g/L葡萄糖,8 mg/L Na-FeIII-EDTA,1 g/L MgSO4 ? 7H2O,1g/L CaCl2 ? 2H2O,11.5g/L HEPES,2%(v/v)树脂XAD-16。
生物合成埃博霉素的主要菌种研究
生物合成埃博霉素的主要菌种研究
王超;刘新利
【期刊名称】《山东轻工业学院学报（自然科学版）》
【年(卷),期】2013(000)002
【摘要】目前国际上主要报道过三株埃博霉素原始产生菌：纤维堆囊菌So ce90、SMP44和So0157-2。
关于埃博霉素的生物发酵研究也多集中于此三种菌及其诱
变菌株。
国内外也有许多单位致力于将埃博霉素合成酶基因簇进行异源表达。
但由于埃博霉素对异源宿主菌具有细胞毒性，导致异源表达较为困难或产物产量不尽如人意，因此，目前大部分研究仍致力于对纤维堆囊菌菌种及其发酵条件的改良，以提高发酵产量。
【总页数】5页(P29-33)
【作者】王超;刘新利
【作者单位】山东轻工业学院山东省微生物工程重点实验室，山东济南250353;
山东轻工业学院山东省微生物工程重点实验室，山东济南250353
【正文语种】中文
【中图分类】Q93
【相关文献】
1.埃博霉素的生物合成 [J], 阎家麒;张文凯
2.抗肿瘤药物埃坡霉素生物合成进展 [J], 顾勤兰;王进欣
3.利福霉素的生物合成及菌种选育 [J], 李宗伟;吴健;王付转;陈红歌
4.纤维堆囊菌SoF5-76产埃博霉素B分批发酵动力学研究 [J], 马利云;龚国利;王娜
5.埃博霉素B小试发酵罐发酵条件研究 [J], 马利云;龚国利
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埃博霉素
目录
• • • • 1.埃博霉素简介 2.埃博霉素与紫杉醇的比较 3.埃博霉素的抗癌机理 4.埃博霉素的生物合成
一、埃博霉素简介
• 埃博霉素（ Epothilones ）是一种天然产物， 1993年由德国生物技术研究公司的科学家 Hofle从降解纤维素的粘液菌，纤维堆囊菌 的培养液中分离得到，最开始作为抗真菌药 和杀虫剂研究，但对植物的毒性太大。 • 埃博霉素是一类16元环的大环内酯化合物， 在Ｃ15位置连接了一个含噻唑环的侧链。 • 由发酵制备时，埃博霉素Ａ和Ｂ是主要产 物，埃博霉素Ｃ—Ｆ是次要产物，但Ｃ—Ｆ 可以经一步反应从Ａ或者Ｂ得到。
3.代谢产物提取和分离 （1）提取（吸附和解吸附）： 加入2%弱极性大孔吸附树脂，能较完全的吸附发酵液 中代谢产物，采用乙酸乙酯作为有机溶剂解吸附。 （2）分离纯化： • 代谢物纯化流程图： 吸附剂 提取物 有机溶剂解吸附
葡聚糖凝胶LH一20
纯品
C18反相色谱
（2）中试规模试验
以20L发酵罐作为种子罐。
培养条件:20L发酵罐发酵体积16L，通气 0.3一0.6V/Vmin，压力6.0PSIG，pH7.4， 启始转速180r/min，溶氧值保持在30以上。
（3）250L中试发酵
20L种子罐培养72h后转入250L发酵罐。 两种补料方式： ①采用30-60h只之间补加复合培养基的补料方式。 成分以马铃薯淀粉、黄豆粉、葡萄糖为主。 ②补加葡萄糖。250L中试规模发酵在80一100h 之间缓慢加入1%-5%葡萄糖溶液，10h补加完成。 整个过程，溶氧保持在39左右，pH值略有下降。
三、埃博霉素的抗癌机理
• 埃博霉素对细胞有强烈的细胞毒活性，其 中埃搏霉素B的作用效果更强，能够诱导微 管蛋白在低浓度和GTP（三磷酸鸟苷酸） 及微管蛋白不存在的条件下聚合形成微管， 抑制癌细胞的分裂，从而导致癌细胞的死 亡。
抗癌新药埃博霉素B中试生产及产业化
抗癌新药埃博霉素B中试生产及产业化埃博霉素（Epothilones），又名埃坡霉素，埃坡西龙。
是由黏细菌纤维堆囊菌Sorangium cellulosum产生的次级代谢产物，其结构为16元内酯大环为中心体，噻唑环配基为侧链的一类细胞毒性化合物。
埃博霉素的抗肿瘤作用机理与紫杉醇相似，即抑制微管解聚。
埃博霉素在p-糖蛋白表达型的多药耐药性肿瘤细胞系中显示很强的抗肿瘤活性，这种肿瘤细胞系紫杉醇是杀不死的，加之埃博霉素比紫杉醇有更好的水溶性，且毒副作用很小，被公认为21世纪最有效的抗癌药物。
由美国施贵宝公司开发的埃博霉素B内酰胺衍生物Ixabepilone（商品名Ixempra, “伊沙匹隆”），于2007年10月16日获得FDA批准在美国上市，这是迄今第一个上市的埃博霉素衍生物一、项目的背景及实施的必要性1、项目所属行业或产业在我国经济发展中的地位、发展现状、技术瓶颈以及亟待解决的技术问题本项目属生物医药行业，即药物生物技术产业化。
本项目是采用基因工程育种技术培育埃博霉素B高产菌株，以该菌株高产率发酵生产抗癌药物埃博霉素B，以及通过半合成方法获得埃博霉素衍生物，作为抗癌药物的原料药和用于生产相应制剂。
该技术产业化将为我国生物制药行业增添一个新的产品和产业类型。
本项目目标是抗癌药物的研发与生产。
目前，在国内有4家研发埃博霉素单位，他们是：①山东大学，主要是粘细菌生物学基础研究；②广州华南理工大学，主要是粘细菌分离鉴定及高产菌株诱变研究；③华北制药集团新药中心，已经建立了黏细菌研究平台，着手埃博霉素B 的研发；④阎家麒教授主持的课题组，主要研究埃博霉素全长基因簇及其质粒构建，获得埃博霉素B的高产菌株并进行实验室制备和中试生产。
国内觊觎并实施埃博霉素B研发的生产企业主要是浙江华东药业集团股份有限公司和浙江海正药业，目前两家的实验室研究阶段尚未结束，产率均达不到中试要求的最低水平，以及产物分离等难题正在摸索之中，现阶段尚不具备大规模生产的条件。
纤维堆囊菌高产埃博霉素发酵条件与提取工艺优化研究的开题报告
纤维堆囊菌高产埃博霉素发酵条件与提取工艺优化研究的开题报告一、研究背景及意义埃博霉素是一种广谱青霉素类抗生素，具有良好的抗菌活性，可用于治疗多种感染疾病。
然而，市售的埃博霉素数量及质量均较为有限，且价格较为昂贵，因此研究如何高效地生产和提取埃博霉素，对于降低其生产成本和提高抗生素的质量具有重要的意义。
纤维堆囊菌是一种可以高效产生埃博霉素的微生物菌株，目前已被广泛研究和应用。
然而，纤维堆囊菌的发酵条件和埃博霉素的提取工艺还需要进一步的优化。
因此，本研究旨在对纤维堆囊菌高产埃博霉素的发酵条件和提取工艺进行优化研究，以提高埃博霉素的产量和质量，从而实现抗生素的高效生产和提取。
二、研究内容1. 纤维堆囊菌高产埃博霉素的发酵条件优化（1）分析影响埃博霉素产量的关键因素，如培养基成分、pH值、温度和转速等。
（2）通过单因素和响应面等实验设计方法，对关键因素进行优化，确定最佳发酵条件。
（3）通过生产级反应器发酵，验证最佳发酵条件下的埃博霉素产量。
2. 埃博霉素的提取工艺优化（1）研究不同提取方法对埃博霉素提取量的影响，包括有机溶剂浸提、超声波提取等。
（2）通过单因素和响应面等实验设计方法，优化提取条件。
（3）通过高效液相色谱法（HPLC）对提取液中的埃博霉素进行定量分析，确定最佳提取工艺。
三、研究方法1. 实验菌株选取：纤维堆囊菌2. 实验设计和操作方法：单因素实验、响应面实验、生产级反应器发酵、有机溶剂浸提、超声波提取、HPLC分析等。
3. 数据处理：使用统计学方法处理实验结果，绘制统计图表等。
四、预期成果1. 确定纤维堆囊菌高产埃博霉素的最佳发酵条件。
2. 优化埃博霉素的提取工艺，提高提取效率和产品质量。
3. 确定高效的制备埃博霉素的方法，为工业化生产提供技术基础。
五、研究进展目前已完成纤维堆囊菌高产埃博霉素的发酵条件优化实验，初步确定了最佳发酵条件。
正在开展埃博霉素的提取工艺优化实验，并进行HPLC分析和统计学处理。
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埃博霉素产生菌的纯化及其意义
随着比紫杉醇临床效果更佳的埃博霉素被发现，埃博霉素的产生菌——纤维堆囊菌日益引起重视，本文通过对其纯化方法进行探索，简化纯化步骤，缩短纯化周期，为埃博霉素的进一步研究奠定基础。
埃博霉素纤维堆囊菌分离纯化
目前最为知名的抗肿瘤药物非紫杉醇莫属。
但由于紫杉醇提取于红豆杉，而红豆杉又数量有限，后续资源不足，因此寻找与紫杉醇的代替者就显得尤为重要。
埃博霉素（Epothilones）与紫杉醇的作用机制相同，埃博霉素A、B和D对癌细胞的生物活性与紫杉醇相当，甚至更强，尤其是埃博霉素B，其活性比紫杉醇强10-100倍.但其水溶性更高，分子量更小，结构更简单，对紫杉醇抗性的肿瘤细胞也有抗性。
埃博霉素来源于粘细菌的纤维堆囊菌属。
但由于粘细菌不能以单细胞的形态进行生长且生长缓慢，因此分离纯化困难，纯化周期长，因此进一步探索粘细菌尤其是纤维堆囊菌的快速分离纯化显得尤为重要。
1材料与方法
1.1土样
采集河南中医学院的土样及腐殖质。
1.2主要试剂和仪器设备
常规试剂自上海生工；提取DNA相关试剂，PCR相关试剂均购自于北京天根生物公司。
主要仪器设备：体式显微镜stekeo discovery V8；倒置显微镜DP73 TH4-200等。
1.3分离、纯化所需的培养基
CNST培养基：KNO3 0.5 g/L，Na2HPO4 0.25 g/L，MgSO4·7H2O 1 g/L，FeCl3
0.01 g/L，微量元素液1mL，pH 7.2。
1.4方法
1.4.1土样采集的标准及初步处理
将采集的有机质含量丰富（富含其它微生物）的土壤样品，自然风干后研成粉末状，平铺在灭过菌的平皿中，用配成适当浓度的制霉菌素液（1片/50mL无菌水）过夜处理，干燥后二次处理，将二次处理后干燥的土样装入灭过菌的离心管中待用。
1.4.2纤维堆囊菌分离富集纯化及验纯
纤维堆囊菌的分离富集一般用CNST培养基。
配制CNST灭菌后待其冷却至不烫手时，加入30～40U经过过滤除菌的放线菌酮液，≤40U的青霉素，5～20U的庆大霉素，≤40U的卡那霉素，≤100U的氨苄青霉素，凝固后，贴上1.5～2cm见方的灭菌滤纸片，每皿4张，倒置平板，在超净台中放置1-2天后除去培养基水汽。
将土样研碎后，适量匀撒在滤纸片上，每个CNST平板接一个土样。
先在30℃的培养箱中培养一周，之后将接有土样的平板置于室温下继续培养，在解剖镜下坚持每天观察，如果滤纸片变橘红或者橙红色或者有菌膜出现则用接种铲将变色部分（此为纤维堆囊菌的子实体部分）或菌膜转接至新的平板上。
对于纤维堆囊菌的纯化，主要是在显微镜下转接其子实体或菌膜，具体方法为：先将在显微镜下观察到的较纯的菌膜或子实体的位置在平皿底部标出，之后在超净台中用注射器转接至新的加有各种抗生素的CNST平板上，多次转接后（此时霉菌的量大大减少），对菌体（主要是子实体）进行洗涤。
对于染菌严重的子实体，用过滤好的放线菌酮配成溶液，具体浓度是0.05mg/mL，分装至各个1.5mL的离心管中，然后在离心管中接入染菌子实体，于56～57℃水浴3～4h（个别染菌严重的子实体可以提高水浴温度，但不能超过57℃），之后将子实体转接至新的平板，待菌重新长出。
如果仍有染菌，可以多次重复此步骤。
直至可以长出完整透明的菌膜。
1.4.3纤维堆囊菌DNA的提取
采用CTAB法提取菌株DNA，并适当稀释作为模板，进行PCR扩增菌株16S rDNA序列。
所用引物为细菌常用引物：27f和1492r。
PCR 扩增程序为：94℃5min；94℃1min；58℃1min；72℃3min；30 cycles；72℃10min；4℃保温。
2实验结果
2.1纤维堆囊菌的分离纯化——形态观察
可以观察到子实体在滤纸上大量堆积，培养基中3～5成团，20～200μm，呈黄色、橙红色、棕黄色、铁锈色、黑色；营养细胞呈圆柱状，末端钝圆，长2.5～10μm；粘孢子在形态上与营养细胞区别小，长1～3μm；其扩展菌膜辐射状或扇状，边缘通常有树枝状或其它不规则突起。
如图1，符合纤维堆囊菌形态学上的特征。
A B
C
图1 不同生长周期的纤维堆囊菌（5×）
A在滤纸上刚刚完成富集；B扩展到滤纸边缘的营养细胞；C营养细胞在琼脂上完成富集，形成大量子实体
2.2纤维堆囊菌的分离纯化-分子生物学鉴定
纯化的纤维堆囊菌16S rDNA序列与NCBI上的基因序列相比较，相似性都在98%以上。
3讨论
结合纤维堆囊菌特殊的生长特点：（1）菌体细胞可聚集形成肉眼可见的子实体结构；（2）在贫瘠的培养基上易形成扩展的菌落；（3）粘细菌的子实体或粘孢子具有较高的耐热性。
本文创新性地使用了抗生素洗涤法与高温处理法相结合，大大提高了纯化效率。
制霉菌素抑制霉菌的效果很好，但其水溶性较差，而将二甲亚砜作为溶剂加入培养基中又严重影响纤维堆囊菌的生长且有刺激性气味。
故有必要找出能够替代制霉菌素的抗生素，最终发现用水溶性较好且相对浓度较高的放线菌酮对子实体进行洗涤，可以达到同样的抑制霉菌的效果。
结合纤维堆囊菌的子实体耐高温这一相对优势生理特点对其进行高温水浴，在抑制甚至杀死其它杂菌的同时又不影响纤维堆囊菌的生长。
通过此方法，使纤维堆囊菌的纯化时间由之前的半年甚至一年缩短至一到两个月。
相对于微生物的传统纯化方法和粘细菌的其他纯化方法，本文的试验方法简单高效，为纤维堆囊菌资源提供更加丰富和多样的研究材料，同时也为大量获得埃博霉素（Epothilones）及其结构类似物提供更多的原始产生菌。
参考文献：
[1]Gerth K，B.N.，Hoffe C，et al.，EpothiJones A and B：Antifungal and Cytotoxic Compounds from Sorangium cellulosum （Myxobacteria）[J].J Antibiot，1996，（49）：560-563.。