国产纤维素酶的复配技术及其稳定性研究

国产纤维素酶的复配技术及其稳定性研究飘逸人生2010年12月12日单一纤维素酶的优化配制•作为纺织应用产品，纤维素酶制剂要求具有良好的贮存稳定性及高的处理效率。

•为了达到上述要求，可在纤维素酶制剂中加入适当的稳定剂及促进剂。

•要求所添加助剂与纤维素酶具有良好的相容性，促进剂对纤维素具有适宜的吸附能力，不影响纤维素酶处理浴的pH值，本身价格低，能够产生较大经济效益。

多种功能性酶制剂的复配•目前的工艺多采用单一的酶进行处理，实际上酶的复配也是酶应用的重要环节，须开发2种或2种以上酶的混拼复配产品。

•通过多种功能酶的复配可以实现多道工艺的一浴处理，提高加工效率。

•利用多种酶之间的协同效应，扬长避短，以期达到仅靠一种酶所无法达到的效果。

•目前需要解决的是不同酶制剂的相容性及复配酶的稳定性问题。

新型酶的开发•纺织工业中只需纤维素酶破坏棉纤维束分子问氢键，松散棉纤维束的结构，而无需将纤维素降解为葡萄糖。

•为了达到返旧及抛光的目的，仅选甩内切酶含量高的纤维素酶即可。

•已经证实内切酶含量高的纤维素酶，会产象更优越的返旧感。

新型酶的开发•但目前酶纺织酶制剂主要来源于微生物，采用的是一些常见菌种。

由这些菌种产生的酶制剂的作用对象具有一定的局限性，而且多为复合酶，无法满足一些特殊处理对酶制剂的要求。

因此对新酶种的研究、开发已经成为纺织酶应用的一个前沿内容。

•目前在通过筛选具有某种功能的菌种，然后利用基因改牲生产高性能的酶制剂及通过克隆、转基因获得基因工程菌，进行新酶种的生产方面已经获得了一些重要的进展，为生化技术在纺织工业中的成用展示了美好的前景。

纤维素酶的复配技术依据•屏蔽理论•膨胀猜想•两性假说•渗透压原理纤维素酶的作用机制•纤维素酶的催化效率最终源自发生在纤维素酶和它的底物之间的多种弱的作用的形成和相互作用所释放的自由能。

•这种结合能既贡献于纤维素酶作用的专一性，又贡献于它的催化作用。

纤维素酶的邻近效应•邻近效应(proximity effect)底物分子在纤维素酶活性部位的集中，使它们的有效浓度超过了它们处在溶液中的浓度。

同样的道理，底物结合在催化部位的氨基酸残基附近, 增高了两个反应物的浓度。

纤维素酶的邻近效应•纤维素酶和底物间的相互作用力是催化作用的关键。

•化学反应的速度取决于反应物分子的有效碰撞。

处在溶液中的反应物分子只有通过彼此扩散相遇才有可能发生反应。

•在生理条件下，一个典型的溶质分子和酶分子活性部位的结合的频率大约是108～109 mol·L-1S-1。

纤维素酶的邻近效应•如果反应物之间有静电吸引，相遇的频率可能是很高的。

•底物同纤维素酶的结合是一种非常快速的二级反应。

•如因纤维素酶的存在能加快底物分子的扩散相遇的频率，酶促反应速度就能加快。

•目前对这种效应的证实尚缺乏证据，但认为可能涉及两者间的静电吸引力。

纤维素酶的邻近效应•邻近效应需要底物分子同纤维素酶弱的结合，即这种结合是低亲和力的。

•非常紧密的结合会使催化变得无效。

•实验表明，邻近效应对酶促反应的贡献是使反应的效率提高104～105。

纤维素酶的共价催化 •共价催化(covalent catalysis)是指催化剂与底物之间瞬间形成共价键以提高反应速度的一种催化机制。

•通常，共价键的形成是通过催化剂上的亲核基团和底物的亲电基团的反应实现的。

这种催化形式叫做亲核催化。

纤维素酶的共价催化 •生物学上重要的亲核剂是带负电荷的基团或含有容易与缺电子基团形成共价键的未共用的电子对。

•亲电剂包括那些带正电荷的、含未饱和的价电子层的﹑或具电负性的原子。

纤维素酶功能性应用——屏蔽理论•纤维素酶在水洗中的应用，主要有两大用途：一是去毛抛光，二是返旧整理。

•相对应的，对于纤维素酶来说，就一定有两大基团去实现这两大用途。

•其中一种组分主要作用于去毛抛光，另一种组分主要作用于返旧整理，两者协同作用，密不可分。

纤维素酶功能性应用——屏蔽理论•对棉纤维进行纤维素酶整理时，在达到所需要的整理效果同时，希望对棉纤维的强力损失最低。

在去毛抛光中，还需要尽可能的减少颜色的变化。

•纤维素酶是一种特殊的高分子化合物，我们可以通过特殊的复配加工，屏蔽纤维素酶的某种功能，以达到期望的效果。

纤维素酶功能性应用——屏蔽理论•笔者在大量的实验中发现，通过特殊的复配加工，可以完全屏蔽酸性纤维素酶的去毛抛光功能，使其只能作用于返旧整理。

•同时也发现，屏蔽后的酸性纤维素酶除了没有去毛抛光效果外，剥色、色光、再沾色和强力损失等其他的效果几乎没有变化。

纤维素酶功能性应用——屏蔽理论•为此，笔者大胆假想：如果通过一定的复配加工，屏蔽酸性纤维素酶的返旧整理功能，保留去毛抛光功能，那在棉纤维的去毛抛光整理中，将不会造成棉纤维的强力降低，也没有色变，更不存在再沾色。

•但在实践中，笔者还没有找到合适的工艺，完全屏蔽酸性纤维素酶的返旧整理功能。

•目前只能达到屏蔽部分返旧整理功能，减轻再沾色和强力损失。

增强纤维素酶抛光效果——膨胀猜想•纤维素酶在去毛抛光中，我们期望其能取得良好的去毛效果的同时，尽可能的不影响棉纤维的强力。

•在实验中发现，当对棉纤维进行合理的膨胀后，再进行去毛抛光，会取得意想不到的效果。

增强纤维素酶抛光效果——膨胀猜想•棉纤维是弯曲的抱合结构，要想不影响棉纤维的强力，在去毛抛光时，尽可能的不要水解棉纤维的结晶区，只要水解非定型区就能达到效果。

当对棉纤维进行膨胀时，将棉纤维的弯曲抱合结构拉直，露出非定型区，使其与纤维素酶有尽可能多的触点，已达到更好的去毛抛光效果。

•同时，如果加入特殊的化合物，抑制纤维素酶的水解结晶区的结构基团，就可以尽可能的不影响棉纤维的强力了！纤维素酶沾色机理——两性假说•在传统的研究中，针对靛蓝牛仔纤维素酶水洗工艺中，影响靛蓝再沾色的主要因素是纤维素酶种类而pH值的影响很小。

•酶蛋白的吸附量是靛蓝染料沾色的主要因素，酶蛋白吸附量越大，再沾色越重。

•纤维素酶蛋白和靛蓝染料具有亲和性，当纤维素酶在织物表面吸附并进行催化反应时，靛蓝染料随之跟着吸附，使织物形成返沾色。

纤维素酶沾色机理——两性假说•在实践中发现，除了酶的种类外，pH值也是影响靛蓝再沾色的重要原因。

•其一，棉纤维一般是呈阴离子性，而靛蓝染料是典型的还原染料，在酸性条件下，靛蓝染料呈阳离子性，靛蓝染料和棉纤维产生相互间的吸附作用力，以至于产生再沾色；而且在一定的pH值范围内，随着pH 值的降低，靛蓝染料的阳离子性越强，靛蓝染料和棉纤维相互间的吸附作用力增强，再沾色越严重。

纤维素酶沾色机理——两性假说•其二，纤维素酶是一种两性物质，在酸性条件下，纤维素酶主要呈阳离子性，并带有一定的阴离子性，纤维素酶的阳离子性端与呈阴离子性的棉纤维相互吸附，由于与棉纤维的触点增多，水洗效果就要好一些，而纤维素酶呈阴离子性端与成阳离子性的靛蓝染料相互吸附，从而形成了再沾色。

纤维素酶沾色机理——两性假说•在一定的pH值范围内，随着pH值的升高，纤维素酶的阳离子性逐渐减弱，阴离子性逐渐增强，纤维素酶阳离子性端与棉纤维相互吸附作用力降低，触点减少，导致与水洗效果变差；•同时靛蓝的阳离子性也逐渐减弱，阴离子性逐渐增强，与纤维素酶阴离子性端和棉纤维的吸附作用力也减弱，再沾色也相对变轻。

纤维素酶沾色机理——两性假说•对于阴、阳离子表面活性剂影响到纤维素酶的水洗效果，也就不难解释。

•对于阴离子表面活性剂而言，它与纤维素酶阳离子端结合，减少了纤维素酶与棉纤维的触点，从而影响到纤维素酶的水洗效果；•对于阳离子表面活性剂而言，它与纤维素酶阳离子端对棉纤维形成竞争，自然会降低纤维素酶与棉纤维的触点，触点减少，水洗效果自然变差。

纤维素酶沾色机理——两性假说•纤维素酶是一两性物质，在一定的pH值条下，纤维素酶会形成阴、阳离子端，随着阴、阳离子端的增强与减弱，会影响到纤维素酶的水洗效果和靛蓝染料的再沾色效果。

•除了纤维素酶的种类外，pH值也是影响纤维素酶水洗效果和靛蓝染料再沾色的重要因素。

纤维素酶稳定的分子基础•稳定的空间结构是纤维素酶催化活性稳定的基础。

•纤维素酶分子空间结构通常比一级结构更为脆弱。

•作用较弱的非共价键对纤维素酶稳定性的影响更引人关注。

•非共价键包括：疏水键、氢键、离子键、范德华力和金属离子结合等。

影响纤维素酶稳定的微环境因素•物理因素温度、机械作用力、辐射与光氧化作用、压力、容器表面吸附、电磁场等。

影响纤维素酶稳定的微环境因素•化学因素酸碱度、氧化作用、表面活性剂、聚合与解聚作用、变性剂、重金属离子、有机溶剂以及各种化学反应等。

•生物因素蛋白酶和杂菌污染。

改善和稳定纤维素酶的方法•纤维素酶分子稳定的作用力较为微弱。

•纤维素酶的稳定性从本质上讲是氨基酸组成和各种作用力综合的结果。

•通过改良纤维素酶作用体系，改善和提高纤维素酶的稳定性。

改善和稳定纤维素酶的方法•蛋白质工程以蛋白质结构和功能关系为基础，按照需要，进行计算机辅助分子设计，采用分子生物学新技术来改造天然蛋白质，并创造出更优良的新蛋白子分子。

一般情况下，经过改造的纤维素酶分子只是对一种不利因素稳定性增加，对其它因素还是不稳定。

改善和稳定纤维素酶的方法•化学修饰通过化学试剂特异性修饰纤维素酶分子的某个或某类氨基酸，从而稳定蛋白质的构象，提高其耐热性或其它稳定性。

酶分子可离解的基团：氨基-NH2、羧基-COOH、羟基-OH、巯基-SH、咪唑基等都可进行修饰。

脱氨基可以改善酶的稳定性，消除酶分子表面氨基酸的电荷。

改善和稳定纤维素酶的方法•小分子修饰蛋白质表面的一半基团由非极性氨基酸组成，这些非极性表面原子簇与水接触不利于纤维素酶的稳定。

利用小分子化合物使表面亲水化就能提高纤维素酶的稳定性。

氨基葡萄糖改善和稳定纤维素酶的方法•大分子修饰双功能试剂：与酶分子中或分子间肽链的两个游离氨基分别发生反应，使它们交联起来，通过共价键形成交固结构，增加酶的稳定性。

单功能试剂：蛋白质、多糖、聚乙二醇等可以与酶结合，增加酶的稳定性。

改善和稳定纤维素酶的方法•固定化通过化学或物理方法，将纤维素酶与不溶性固态支持物结合或载体包埋。

改善和稳定纤维素酶的方法优化微环境•稳定剂防腐剂、多羟基化合物、食用胶、盐类和氨基酸等。

•缓冲剂极端pH是纤维素酶分子不稳定的原因。

改善和稳定纤维素酶的方法•共溶剂糖类、多元醇、氨基酸及其衍生物、无机盐、甘油、多聚物等一般称为蛋白质共溶剂。

高浓度的共溶剂能稳定蛋白质，共溶剂混合使用时效果远大于单一稳定能力之和。

改善和稳定纤维素酶的方法•无机盐一般而言，在纤维素酶液中添加无机盐离子能明显改善纤维素酶的机械稳定性和耐热性。

无机盐离子能结合纤维素酶分子中的配对阴离子，降低分子内静电排斥作用，增加了纤维素酶的稳定性。

改善和稳定纤维素酶的方法•功能性高分子物质通过填补纤维素酶空间结构的空隙，降低了有温度升高引起纤维素酶空间结构改变而导致的酶活损失，同时还可以通过氢键与纤维素酶蛋白表面分子相连，从而使纤维素酶蛋白的分子稳定。