短链的寡聚核苷酸的序列测定

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DNA片段序列测定的策略

原理：将待测 DNA 克隆于噬菌体载体（M13）上，然后通过一定手段将待测 DNA 片断化（DNA 片断化的手段通常有超声波处理和酶切），得到两端彼此重叠的部位不同的若干小片段，再测出每一片段的序列，将各片段的序列依次排列，即能得出总的序列。
鸟枪法原理示意图
大致步骤： 1.超声波处理：将DNA随机断裂成一组相互重叠的300-900bp片段，电泳回收300-600bp片断作亚克隆 2.DNaseI切割：将DNA随机切割成一组相互重叠的片段，作亚克隆 3.限制酶消化：限制酶将DNA切割为含粘端的DNA片段，作亚克隆将上述含不同子片段的亚克隆扩增后进行测序
DNA片段序列测定的策略
主讲：刘天星小组成员：孙凯李幸
2012-6-7
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一、DNA测序二、主要测序策略
三、未来测序技术
一、DNA测序
DNA测序：对DNA分子的核苷酸排列顺序的测定，也就是测定组成 DNA分子的A、T、G、C的排列顺序。主要方法有桑格-库森法。原理：在四种反应体系中，寡聚核苷酸分别终止于不同位置的A、 T、G或C碱基，将待测DNA片段转变成一系列放射性核素标记的单链DNA片断，并使其一端为一固定的末端，而另一端由于长度不同，成为一系列相差1个碱基的连续末端。经电泳分离，放射自显影，可直接读出DNA的序列。
1、鸟枪法 2、缺失克隆法 3、引物步移 4、通用引物指导未知序列的测定
1、鸟枪法
鸟枪法（随机克隆测序）：将待测序列。当这些末端序列的数量达到一定程度后，性党羽待测DNA片段的每一部位的序列也就都被测定出来了。通过这些多测序列之间的重叠部分，最终可将整个DNA片段的额序列拼接出来。鸟枪法的优点是速度快，简单易行，成本较低。但用它来测序，最终排序结果的拼接组装不太容易。

高通量测序常用名词科普

高通量测序常用名词汇总一代测序技术：即传统的Sanger测序法,Sanger法是根据核苷酸在待定序列模板上的引物点开始,随机在某一个特定的碱基处终止,并且在每个碱基后面进行荧光标记,产生以A、T、C、G结束的四组不同长度的一系列核苷酸,每一次序列测定由一套四个单独的反应构成,每个反应含有所有四种脱氧核苷酸三磷酸dNTP,并混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸ddNTP;由于ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH 基团,使延长的寡聚核苷酸选择性地在G、A、T 或C处终止,使反应得到一组长几百至几千碱基的链终止产物;它们具有共同的起始点,但终止在不同的的核苷酸上,可通过高分辨率变性凝胶电泳分离大小不同的片段,通过检测得到DNA碱基序列;二代测序技术：next generation sequencingNGS又称为高通量测序技术,与传统测序相比,二代测序技术可以一次对几十万到几百万条核酸分子同时进行序列测定,从而使得对一个物种的转录组和基因组进行细致全貌的分析成为可能,所以又被称为深度测序Deep sequencing;NGS主要的平台有Roche454 & 454+,IlluminaHiSeq 2000/2500、GA IIx、MiSeq,ABI SOLiD等;基因：Gene,是遗传的物质基础,是DNA或RNA分子上具有遗传信息的特定核苷酸序列;基因通过复制把遗传信息传递给下一代,使后代出现与亲代相似的性状;DNA：Deoxyribonucleic acid,脱氧核糖核酸,一个脱氧核苷酸分子由三部分组成：含氮碱基、脱氧核糖、磷酸;脱氧核糖核酸通过3',5'-磷酸二酯键按一定的顺序彼此相连构成长链,即DNA链,DNA链上特定的核苷酸序列包含有生物的遗传信息,是绝大部分生物遗传信息的载体;RNA：Ribonucleic Acid,,核糖核酸,一个核糖核苷酸分子由碱基,核糖和磷酸构成;核糖核苷酸经磷酯键缩合而成长链状分子称之为RNA链;RNA是存在于生物细胞以及部分病毒、类病毒中的遗传信息载体;不同种类的RNA链长不同,行使各式各样的生物功能,如参与蛋白质生物合成的RNA有信使RNA、转移RNA和核糖体RNA等;16S rDNA："S"是沉降系数,是反映生物大分子在离心场中向下沉降速度的一个指标,值越高,说明分子越大;rDNAribosome DNA指的是原核生物基因组中编码核糖体RNArRNA分子对应的DNA序列,16S rDNA 是原核生物编码核糖体小亚基16S rRNA的基因;细菌rRNA核糖体RNA按沉降系数分为3种,分别为5S、16S和23S rRNA;16S rDNA是细菌染色体上编码16S rRNA相对应的DNA序列,存在于所有细菌染色体基因中;16S rRNA 普遍存在于原核生物中;16S rRNA 分子,其大小约1540bp,既含有高度保守的序列区域,又有中度保守和高度变化的序列区域,其可变区序列因细菌不同而异,恒定区序列基本保守,所以可利用恒定区序列设计引物,将16S rDNA片段扩增出来,通过高通量测序利用可变区序列的差异来对不同菌属、菌种的细菌进行分类鉴定;cDNA：complementary DNA,互补脱氧核糖核酸,与RNA链互补的单链DNA,以RNA为模板,在反转录酶的作用下所合成的DNA;Small RNA：生物体内一类高度保守的重要的功能分子,其大小在18-30nt,包括microRNA、siRNA、snRNA、snoRNA和piRNApiwi-interacting RNA等,它的主要功能是诱导基因沉默,调控细胞生长、发育、基因转录和翻译等生物学过程;以miRNA为例介绍它们的功能：miRNA 与RNA诱导沉默复合体RNA induced silencing complex, RISC结合,并将此复合体与其互补的mRNA序列结合,根据靶序列与miRNA的互补程度,从而导致靶序列降解或干扰靶序列蛋白质的翻译过程;SD 区域：Segment duplication,串联重复是由序列相近的一些 DNA 片段串联组成;串联重复在人类基因多样性的灵长类基因中发挥重要作用;Genotype and phenotype：基因型与表型,基因型是指某一生物个体全部基因组合的总称；表型,又称性状,是基因型和环境共同作用的结果;基因组：Genome,单倍体细胞核、细胞器线粒体、叶绿体或病毒粒子所含的全部DNA分子或RNA分子;全基因组de novo测序：又称从头测序,它不依赖于任何现有的序列资料,而直接对某个物种的基因组进行测序,然后利用生物信息学分析手段对序列进行拼接、组装,从而获得该物种的基因组序列图谱;全基因组重测序：对已有参考序列Reference Sequence物种的不同个体进行基因组测序,并以此为基础进行个体或群体水平的遗传差异性分析;全基因组重测序能够发现大量的单核苷酸多态性位点SNP、拷贝数变异Copy Number Variation,CNV、插入缺失InDel,Insertion/Deletion、结构变异Structure Variation,SV等变异类型,以准确快速的方法将单个参考基因组信息上升为群体遗传特征;转录组：Transcriptome,是指特定生长阶段某组织或细胞内所有转录产物的集合；狭义上指所有mRNA的集合;转录组测序：对某组织在某一功能状态下所能转录出来的所有RNA进行测序,获得特定状态下的该物种的几乎所有转录本序列信息;通常转录组测序是指对mRNA进行测序获得相关序列的过程;其根据所研究物种是否有参考基因组序列分为转录组de novo测序无参考基因组序列和转录组重测序有参考基因组序列;外显子组：Exome,人类基因组全部外显子区域的集合称为外显子组,是基因中重要的编码蛋白的部分,并涵盖了与个体表型相关的大部分的功能性变异;外显子组测序：是指利用序列捕获技术将全基因组外显子区域DNA捕捉并富集后进行高通量测序的基因组分析方法;外显子测序相对于基因组重测序成本较低,对研究已知基因的SNP、InDel 等具有较大的优势;目标区域测序：应用相关试剂盒对基因组上感兴趣的目标区域进行捕获富集后进行大规模测序,一般需要根据目标区域专门定制捕获芯片;宏基因组：Metagenome,指特定生活环境中全部微小生物遗传物质的总和;它包含了可培养的和未可培养的微生物的基因;目前主要指环境样品中的细菌和真菌的基因组总和;宏基因组16S rRNA测序：可以对特定环境下的细菌和古细菌群体的微生物种类和风度进行有效的鉴定;对不同地点、不同条件下的多个样本16S rRNA的PCR产物平行测序,可以比较不同样本间的微生物组成及成分差异,进而阐明物种丰度、种群结果等生态学信息;表观遗传学：Epigenetics,是指在基因组DNA序列没有改变的情况下,基因的表达调控和性状发生了可遗传的变化;表观遗传的现象很多,已知的有DNA甲基化DNA methylation,基因组印记genomic impriting,母体效应maternal effects,基因沉默gene silencing,核仁显性,休眠转座子激活和RNA编辑RNA editing等;全基因组甲基化测序：DNA 甲基化是指在 DNA 甲基化转移酶的作用下,在基因组 CpG 二核苷酸的胞嘧啶5'碳位共价键结合一个甲基基团;DNA 甲基化已经成为表观遗传学和表观基因组学的重要研究内容;甲基化是基因表达的主要调控方式之一,研究染色体DNA甲基化情况是了解基因调控的重要手段;对已经有参考基因组的物种的基因组DNA用标准亚硫酸氢盐Bisulfite处理后,未甲基化的胞嘧啶C会脱氨基形成尿嘧啶U,经PCR扩增,U替换为胸腺嘧啶T,而发生甲基化的胞嘧啶C保持不变;将处理组与参考基因组序列进行比对,可发现甲基化位点并对甲基化情况进行定量分析的方法叫做全基因组甲基化测序;ChIp-Seq：Chromatin Immunoprecipitation sequencing,即染色质免疫共沉淀-测序技术,即通过染色质免疫共沉淀技术特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段;对富集得到的DNA片段进行纯化与文库构建,然后进行高通量测序,从而得到全基因组范围内可以与目的蛋白相互作用的DNA片段的方法叫做ChIP-Seq;数字表达谱：Digital Gene Expression Profile,利用新一代高通量测序技术和高性能计算分析技术,能够全面、经济、快速地检测某一物种特定组织在特定状态下的基因表达情况,即运用特定的酶对mRNA距polyA tail 21-25nt的位置进行酶切,所获得的带polyA尾的序列Tag通过高通量测序,该tag被测得的次数即是对应基因的表达值;数字基因表达谱已被广泛应用于基础科学研究、医学研究和药物研发等领域;特点是经济,但获得的数据量有限;若想获得转录本的更多信息的话,一般都采用转录组测序的方法来测序;SBS：sequencing by synthesis,边合成边测序反应,是指在DNA聚合酶的作用下延伸碱基所进行的测序;Run：指高通量测序平台单次上机测序反应;图1. Flow Cell结构示意图Lane：也叫channel,单泳道,每条泳道包含2列column,每列分布有多个小区tile,如图1;不同的测序平台Flow Cell中所含的Lane不一样,如HiSeq 2000是2个flow cell,每个flow cell中含有8个lane；HiSeq 2500是包含2个mini flow cell快速运行模式和2个high output flow cell,两个模式不能同时运行,其中每个mini flow cell包含2个lane,每个high output flow cell中包含8个lane；Miseq系统的flow cell仅含有1个lane; Tile：小区,每条Lane中有2列tile,合计120个小区;每个小区上分布数目繁多的簇结合位点,如图1;Cluster：簇,在Illumina测序平台中会采用桥式PCR方式生产DNA簇,每个DNA簇才能产生亮度达到CCD可以分辨的荧光点;Index：标签,在Illumina平台的多重测序Multiplexed Sequencing过程中会使用Index 来区分样品,并在常规测序完成后,针对Index部分额外进行7个循环的测序,通过Index的识别,可以在1条Lane中区分12种不同的样品;Barcode：与Index同义,多指在Roche GS FLX 454测序平台的16S PCR产物的测序过程中接头序列所包含的的用来区分不同样本的序列;PF%：PF%是指符合测序质量标准的簇的百分比,与测序的通量相关联;Fasta：一种序列存储格式;一个序列文件若以FASTA格式存储,则每一条序列的第一行以“>”开头,而跟随“>”的是序列的ID号即唯一的标识符及对该序列的描述信息；第二行开始是序列内容,序列短于61nt的,则一行排列完；序列长于61nt的,则每行存储61nt,最后剩下小于61nt的,在最后一行排列完；第二条序列另起一行,仍然由“>”和序列的ID号开始,以此类推;Fastq：Fastq是Solexa测序技术中一种反映测序序列的碱基质量的文件格式;第一行以“”符号开头,后面紧跟一个序列的描述信息；第二行是该序列的内容；第三行以“+”符号开头,后面可以是该序列的描述信息,也可省略；而第四行是第二行中的序列内容每个碱基所对应的测序质量值;Read：高通量测序平台产生的序列标签就称为 reads;基因组组装：进行基因组或转录组de novo测序时,物种基因组经构建不同的文库测序所得的片段需经过生物信息学手段对其进行整理拼接,并通过一定的标准如N50对后续组装结果进行质量评估等,最终获得高准确度的基因组序列的过程;基因组测序深度：测序得到的总碱基数与待测基因组大小的比值;如测一个物种的全基因组的重测序,基因组大小约为5G,测序获得100G的数据量,则测序深度为20×;基因组覆盖率：指测序获得的序列占整个基因组的比例;由于基因组中的高GC、重复序列等复杂结构的存在,测序最终拼接组装获得的序列往往无法覆盖有所的区域,这部分没有获得的区域就称为Gap;例如一个细菌基因组测序,覆盖率是98%,那么还有2%的序列区域是没有通过测序获得的;Contig：在de novo测序中拼接软件基于 reads 之间的 overlap 区,拼接获得的中间没有gap的序列称为 Contig重叠群;Scaffold：基因组 de novo 测序,通过 reads 拼接获得 Contigs 后,往往还需要构建 454 Paired-end 库或 Illumina Mate-pair 库,以获得一定大小片段如 3Kb、8Kb、10Kb、20Kb 两端的序列;基于这些序列,可以确定一些Contig 之间的顺序关系,这些先后顺序已知的Contigs 组成 Scaffold;Contig N50：Reads拼接后会获得一些不同长度的Contigs;将所有的Contig长度相加,能获得一个Contig总长度;然后将所有的Contigs按照从长到短进行排序,如获得Contig 1,Contig 2,Contig 3……Contig 25;将Contig按照这个顺序依次相加,当相加的长度达到Contig总长度的一半时,最后一个加上的Contig长度即为Contig N50;举例：Contig 1+Contig 2+ Contig 3 +Contig 4=Contig总长度1/2时,Contig 4的长度即为Contig N50;Contig N50可以作为基因组拼接的结果好坏的一个判断标准;Scaffold N50：Scaffold N50与Contig N50的定义类似;Contigs拼接组装获得一些不同长度的Scaffolds;将所有的Scaffold长度相加,能获得一个Scaffold总长度;然后将所有的Scaffolds按照从长到短进行排序,如获得Scaffold 1,Scaffold 2,Scaffold 3……Scaffold 25;将Scaffold按照这个顺序依次相加,当相加的长度达到Scaffold总长度的一半时,最后一个加上的Scaffold长度即为Scaffold N50;举例：Scaffold 1+Scaffold 2+ Scaffold 3 +Scaffold 4 +Scaffold 5=Scaffold总长度1/2时,Scaffold 5的长度即为Scaffold N50;Scaffold N50可以作为基因组拼接的结果好坏的一个判断标准;Isotig：指在转录组de novo测序时,用454平台测序完成后组装出的结果,一个isotig可视为一个转录本;Isogroup：指转录组de novo测序中,用454平台测序完成后组装出的结果获得的可聚类到同一个基因的转录本群;GC%：GC含量,全基因组范围内或在特定基因组序列内的4种碱基中,鸟嘌呤和胞嘧啶所占的比率;SNP：single nucleotide polymorphism,单核苷酸多态性,个体间基因组DNA序列同一位置单个核苷酸变异替代、插入或缺失所引起的多态性；不同物种个体基因组 DNA 序列同一位置上的单个核苷酸存在差别的现象;有这种差别的基因座、DNA序列等可作为基因组作图的标志;SNP 在CG序列上出现最为频繁,而且多是C转换为T ,原因是CG中的C 常为甲基化的,自发地脱氨后即成为胸腺嘧啶;一般而言,SNP 是指变异频率大于 1 %的单核苷酸变异,主要用于高危群体的发现、疾病相关基因的鉴定、药物的设计和测试以及生物学的基础研究等;InDel：Insertion/Deletion,插入/缺失,在基因组重测序进行mapping时,进行容Gap的比对并检测可信的Short InDel,如基因组上小片段>50bp的插入或缺失;在检测过程中,Gap 的长度为1~5个碱基;CNV：copy number variation,基因组拷贝数变异,是基因组变异的一种形式,通常使基因组中大片段的DNA形成非正常的拷贝数量;如人类正常染色体拷贝数是2,有些染色体区域拷贝数变成1或3,这样,该区域发生拷贝数缺失或增加,位于该区域内的基因表达量也会受到影响;如果把一条染色体分成A-B-C-D四个区域,则A-B-C-C-D/A-C-B-C-D/A-C-C-B-C-D/A-B-D 分别发生了C区域的扩增及缺失,扩增的位置可以是连续扩增如 A-B-C-C-D 也可以是在其他位置的扩增,如A-C-B-C-D;SV：structure variation,基因组结构变异,染色体结构变异是指在染色体上发生了大片段的变异;主要包括染色体大片段的插入和缺失引起 CNV 的变化,染色体内部的某块区域发生重复复制、翻转颠换、易位、两条染色体之间发生重组inter-chromosome trans-location 等;基因表达差异：是指某一物种或特定细胞在特定时期/功能状态下,多样本间不同基因在mRNA水平上表达量的差异,可通过RPKM/FPKM值来体现;RPKM：Reads Per Kilobase per Million mapped reads Mortazavi etal., 2008,是指每 1 百万个map 上的reads 中map 到外显子的每1K 个碱基上的reads 个数;计算公式四RPKM=106C/NL/103,其中C为唯一比对到目的基因的reads数；N为唯一比对到参考基因的总reads数,L是目的基因编码区的碱基数;RPKM法可以消除基因长度、数据量之间的差异进行计算基因表达量;可变剪切：alternative splicing大多数真核基因转录产生的mRNA前体是按一种方式剪接产生出一种mRNA,因而只产生一种蛋白质;但有些基因产生的mRNA前体可按不同的方式剪接,产生出两种或更多种mRNA,即可变剪接;基因融合：Gene fusion,将基因组位置不同的两个或多个基因中的一部分或全部整合到一起,形成新的基因,称作融合基因或嵌合体基因,该基因有可能翻译出融合或嵌合体蛋白;基因家族分析：通过进行BLASTN/ HMM比对等查找基因归属的基因家族并添加相关功能注释;基因组注释：Genome annotation是利用生物信息学方法和工具,对基因组所有基因的生物学功能进行高通量注释,是当前功能基因组学研究的一个热点;基因组注释的研究内容包括基因识别和基因功能注释两个方面;基因识别的核心是确定全基因组序列中所有基因的确切位置;常见的基因组注释有GO注释、pathway分析;GO注释：gene ontology是指对基因功能的注解;GO强调基因产物在细胞中的功能;GO不能反映此基因的表达情况,即是否在特定细胞中、特定组织中、特定发育阶段或与某种疾病相关,但GO支持其他的OBOopen biology ontologies成员成立其他类型的本体论数据库如发育本体学、蛋白组本体学、基因芯片本体学等Pathway注释：是指对功能基因参与的信号通路等进行分析注释;甲基化率：是指在甲基化测序中,发生甲基化的胞嘧啶占所有胞嘧啶的比率;CpG岛：CpG island 是指DNA上一个区域,此区域含有大量相联的胞嘧啶C、鸟嘌呤G,以及使两者相连的磷酸酯键p;基因组中长度为300～3000 bp的富含CpG二核苷酸的一些区域,主要存在于基因的5’区域;启动子区中CpG岛的未甲基化状态是基因转录所必需的,而CpG序列中的C的甲基化可导致基因转录被抑制;Q20,Q30:基因的二代测序中,每测一个碱基会给出一个相应的质量值,这个质量值是衡量测序准确度的;碱基的质量值13,错误率为5%,20的错误率为1%,30的错误率为0.1%;行业中Q20与Q30则表示质量值≧20或30的碱基所占百分比;例如一共测了1G的数据量,其中有0.9G的碱基质量值大于或等于20,那么Q20则为90%;Q20值是指的测序过程碱基识别Base Calling过程中,对所识别的碱基给出的错误概率;质量值是Q20,则错误识别的概率是1%,即错误率1%,或者正确率是99%；质量值是Q30,则错误识别的概率是0.1%,即错误率0.1%,或者正确率是99.9%；质量值是Q40,则错误识别的概率是0.01%,即错误率0.01%,或者正确率是99.99%；全基因组测序全基因组测序-技术路线提取基因组DNA,然后随机打断,电泳回收所需长度的DNA片段0.2~5Kb,加上接头, 进行基因簇cluster制备或电子扩增E-PCR,最后利用Paired-EndSolexa或者Mate-PairSOLiD的方法对插入片段进行测序;然后对测得的序列组装成Contig,通过Paired-End的距离可进一步组装成Scaffold,进而可组装成染色体等;组装效果与测序深度与覆盖度、测序质量等有关;常用的组装有：SOAPdenovo、Trimity、Abyss等;全基因组测序-原理双末端Paired-End测序原理测序深度Sequencing Depth：测序得到的碱基总量bp与基因组大小Genome的比值,它是评价测序量的指标之一;测序深度与基因组覆盖度之间是一个正相关的关系,测序带来的错误率或假阳性结果会随着测序深度的提升而下降;重测序的个体,如果采用的是Paired-End 或Mate-Pair方案,当测序深度在10~15X以上时,基因组覆盖度和测序错误率控制均得以保证;测序深度对基因组覆盖度和测序错误率的影响HOM：纯合体 HET：杂合体全基因组测序-分析流程1．数据量产出总碱基数量、Totally mapped reads、Uniquely mapped reads统计,测序深度分析;2．一致性序列组装与参考基因组序列Reference genome sequence的比对分析,利用贝叶斯统计模型检测出每个碱基位点的最大可能性基因型,并组装出该个体基因组的一致序列;3．SNP检测及在基因组中的分布提取全基因组中所有多态性位点,结合质量值、测序深度、重复性等因素作进一步的过滤筛选,最终得到可信度高的SNP数据集;并根据参考基因组序列对检测到的变异进行注释; 4．InDel检测及在基因组的分布在进行mapping的过程中,进行容Gap的比对并检测可信的Short InDel;在检测过程中,Gap 的长度为1~5个碱基;5．Structure Variation检测及在基因组中的分布目前SBC能够检测到的结构变异类型主要有：插入、缺失、复制、倒位、易位等;根据测序个体序列与参考基因组序列比对分析结果,检测全基因组水平的结构变异并对检测到的变异进进行注释;全基因组重测序生物信息学分析流程。

基因工程试题库讲解

《基因工程》试题库（一）一、选择题（单选或多选）（每题2分，共计20分）1.下面哪一种特性不是密码所具有的? ( )(a)偏爱性(b)简并性(c)重叠性(d)连续性2. 黏性末端连接法，不仅操作方便，而且( )(a)产生新切点(b)易于回收外源片段(c)载体不易环化(d)影响外源基因的表达3. 用菌落杂交法筛选重组体时，( )(a)需要外源基因的表达(b)不需要外源基因的表达(c)要根据克隆基因同探针的同源性(d)上述说法都正确4. DNA在染色体的常染色质区压缩多少倍?( )(a)6倍(b)10倍(c)40倍(d)240倍(c)1000倍10000倍5. 对于一个特定的起点，引发体的组成包括：( )(a)在起始位点与DnaG引发酶相互作用的一个寡聚酶(b)一个防止DNA降解的单链结合蛋白(c)DnaB解旋酶和附加的DnaC，DnaT，PriA等蛋白(d)DnaB，单链结合蛋白，DnaC，DnaT，PriA蛋白和DnaG引发酶(e)DnaB解旋酶，DnaG引发酶和DNA聚合酶Ⅲ6. 下面哪些是在反转录病毒中发现的基因?( )(a)gag(b)pol(c)env(d)OnC7. 下列哪些基因以典型的串联形式存在于真核生物基因组?( )(a)球蛋白基因(b)组蛋白基因(c)rRNA基因(d)肌动蛋白基因8. 以下关于抗体类型转变的叙述哪些是正确的?( )(a)每种重链具有不同的功能(b)类型转变的次序按染色体上重链排列顺序进行(c)一旦一种类型转换发生，其他的转换将不再进行(d)也可通过可变剪接改变重链9. 下列哪些转录因子含有TBP?( )(a)TFⅡB (b)TFⅢA (c)SLl (d)TFⅡD (e)TFⅢB (f)UBFl 10．剪接小体的组装( )(a)按有序的途径一步步完成(b)涉及snRNP与水溶性蛋白(即不是任何snRNP组分的蛋白)(c)不需要ATP(d)伴随着多次snRNP的重组合(e)以上都正确二、判断题（每题1分，共计10分）1．一个带有反向重复序列的双链DNA经变性后，复性时其单链可形成发夹环。

第一代测序技术(1)

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第一代测序技术
传统的链终止法，化学讲解法，以及在它们的基础上来的各种DNA测序技术传统成为第一代DNA测序技术。
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原理
第一步是短寡聚核苷酸在每个分子的相同位置上退火，然后该寡聚核苷酸就充当引物来合成与模板互补的新的DNA链。用双脱氧核苷酸作为链终止试剂（双脱氧核苷酸在脱氧核糖上没有聚合酶延伸链所需要的3－OH基团，所以可被用作链终止试剂）通过聚合酶的引物延伸产生一系列大小不同的分子后再进行分离的方法。
行大规模地全基因组重测序也成为了可能。
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第三代测序技术
第三代测序技术是指单分子测序技术。DNA测序时，不需要经过PCR扩增，实现了对每一条DNA分子的单独测序。
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原理
第三代测序技术原理主要分为两大技术阵营：第一大阵营是单分子荧光测序，代表性的技术为美国螺旋生物(Helicos)的SMS技术和美国太平洋生
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应用
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高通量测序
高通量测序技术（High-throughput sequencing）又称“下一代”测序技术（"Next-generation" sequencing technology），以能一次并行对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定和一般读长较短等为标志。
根据发展历史、影响力、测序原理和技术不同等，主要有以下几种：大规模平行签名测序（Massively Parallel Signature Sequencing, MPSS)、聚合酶克隆（Polony Sequencing）、454焦磷酸测序（454 pyrosequencing）、Illumina (Solexa) sequencing、ABI SOLiD sequencing、离子半导体测序（Ion semiconductor sequencing）、DNA 纳米球测序（DNA nanoball sequencing）等。

寡聚核苷酸cpg的物理外观

寡聚核苷酸cpg的物理外观
寡聚核苷酸CpG（CpG oligodeoxynucleotides）是一种特殊的DNA序列，其物理外观具有一定的特点。

CpG寡核苷酸是一种短链的DNA分子，通常由寡聚二核苷酸组成，其中的CpG二核苷酸单元以CpG二核苷酸单元排列。

CpG二核苷酸单元是指在DNA分子中，紧邻的胞嘧啶（C）和鸟嘌呤（G）碱基以磷酸二酯键连接在一起。

从物理外观上看，CpG寡核苷酸呈现为线性的双链DNA结构，通常呈现为螺旋状的形态。

在实验室中，CpG寡核苷酸通常以固体或溶液的形式存在。

在溶液中，CpG寡核苷酸呈现为无色透明的液体，具有一定的粘稠度。

由于其特殊的DNA序列结构，CpG寡核苷酸在实验室中常常需要在低温下保存，以避免其分子结构的变化。

此外，CpG寡核苷酸在生物体内也具有一定的物理外观特点。

在细胞内，CpG寡核苷酸可以与蛋白质形成复合物，通过特定的受体介导信号转导通路，参与免疫应答等生物学过程。

因此，CpG寡核苷酸的物理外观不仅限于实验室中的形态，还包括其在生物体内的分子结构和相互作用。

总的来说，CpG寡核苷酸的物理外观呈现为线性的双链DNA结
构，在实验室中以固体或溶液的形式存在，而在生物体内则与蛋白质形成复合物，参与免疫应答等生物学过程。

对CpG寡核苷酸的物理外观的研究有助于深入理解其在生物体内的作用机制，为其在免疫治疗等领域的应用提供理论基础。

寡核苷酸微阵列

寡核苷酸微阵列寡核苷酸微阵列是一种用于检测和分析核酸序列的技术。

它是基于DNA或RNA的互补配对原理，通过将多个寡核苷酸分子固定在芯片上并与待测样品中的核酸片段进行杂交反应，从而实现对目标序列的检测和分析。

下面将从原理、制备、应用等几个方面来介绍寡核苷酸微阵列。

首先是寡核苷酸微阵列的原理。

DNA或RNA寡核苷酸是由4种核苷酸（腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶和鳞状嘧啶）组成的短链，它们能与目标核酸序列中的互补碱基序列发生特异性的互补配对反应。

寡核苷酸微阵列就是将这些寡核苷酸固定在芯片上的特定区域，形成一个网格状的阵列。

待测样品中的核酸片段与芯片上寡核苷酸的互补序列结合，通过检测这些结合事件可以获得目标序列的信息。

其次是寡核苷酸微阵列的制备过程。

寡核苷酸微阵列的制备需要经过一系列的步骤。

首先是设计合适的寡核苷酸序列，这一步需要考虑到目标序列的长度、互补序列的选择等因素。

然后，寡核苷酸需要被固定在芯片上，通常采用的方法是利用化学反应或生物反应在芯片表面形成共价键或非共价键。

最后，经过检验和分析，确定寡核苷酸微阵列的质量和性能。

寡核苷酸微阵列具有广泛的应用。

首先是基因表达谱分析。

通过将寡核苷酸微阵列与从生物样品中提取的mRNA反应，可以得到样品中基因的表达情况。

这对于研究不同组织或细胞类型的基因表达差异、发现新的基因等具有重要意义。

其次是SNP分析。

SNP（Single Nucleotide Polymorphism）是指遗传序列中单个核苷酸的变异。

通过寡核苷酸微阵列可以高通量地对大量SNP进行检测，有助于研究与疾病发生有关的基因突变。

此外，寡核苷酸微阵列还可以用于药物筛选、病毒检测等领域。

总结一下，寡核苷酸微阵列是一种用于检测和分析核酸序列的技术。

它通过固定在芯片上的寡核苷酸与待测样品中的核酸片段发生互补配对反应，实现对目标序列的检测和分析。

寡核苷酸微阵列的制备需要经过设计、固定和检验等步骤。

这一技术具有广泛的应用，如基因表达谱分析、SNP分析、药物筛选等。

寡核苷酸序列分析

寡核苷酸序列分析
寡核苷酸序列分析是一种用于研究和确定短的DNA或RNA片段（通常为20-30个核苷酸）核苷酸种类和排列顺序的生物技术，在许多生物学和医学领域都有重要的应用价值。

寡核苷酸是药物研究中的一个新热点，一些具有特异性结合或者裂解致病基因的寡核苷酸可以开发成新型药物，它们作用效率高、应用范围广，可以对传统药物进行补充，具有广泛的应用前景。

对寡聚核苷酸进行序列分析是基因药物的研发和生产过程中必不可少的一环。

BTP-寡核苷酸序列分析流程。

质谱技术的发展为寡核苷酸序列鉴定提供了强有力的分析方法。

寡核苷酸分子在高分辨率质谱仪中被解离成一系列碎片离子，这些碎片带有质荷比（m/z）值，通过对这些片段离子的质谱分析，可以推断原始寡核苷酸的碱基序列。

百泰派克生物科技（BTP）通过CNAS/ISO9001双重质量体系认证，公司基于Thermo公司的Obitrap Fusion Lumos质谱仪结合Nano-LC纳升色谱技术，开发并验证了高精度寡核苷酸序列分析方法，能够对ASO（反义寡核苷酸）、siRNA（小干扰RNA）、miRNA（微小RNA）、Aptamer（核酸适配体）等不同的寡核苷酸样品进行高分辨、高准确度的序列鉴定，满足客户不同的需求。

中/英文项目报告
在技术报告中，百泰派克会为您提供详细的中英文双语版技术报告，报告包括：
1. 实验步骤（中英文）。

2. 相关的质谱参数（中英文）。

3. 寡核苷酸序列分析详细信息。

4. 质谱图片。

5. 原始数据。

寡核苷酸序列分析一站式服务
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百泰派克一站式服务完成：样品处理-上机分析-数据分析-项目报告。

寡核苷酸序列

寡核苷酸序列寡核苷酸是一种由少于20个核苷酸分子组成的小分子。

它们可以被用于多种生物学应用，例如制备基因探针、扩增特定DNA序列等。

在研究中，寡核苷酸也可以用作基于序列的检测方法，在诸如基因组测序和突变检测等领域中具有重要的应用价值。

因此，对于寡核苷酸序列有一个深入的了解显得至关重要。

本文将深入探讨寡核苷酸序列及其相关知识。

1. 寡核苷酸的结构与命名寡核苷酸由少于20个核苷酸单元组成，每个碱基单元包含一个含氮碱基和一个脱氧核糖分子。

根据脱氧核糖与含氮碱基的结合方式不同，它们可以被进一步分为两类：核苷酸和核苷酸酰胺。

核苷酸由一个含氮碱基、一个脱氧核糖和一个磷酸基团组成，而核苷酸酰胺则缺少磷酸基团。

寡核苷酸的命名方法和DNA和RNA相同。

例如，5'-ATCGCTCCA-3'是一个由9个核苷酸单元组成的DNA寡核苷酸，其中5'和3'末端表示脱氧核糖分子的两个端点。

2.1 寡核苷酸作为探针主要使用寡核苷酸的应用之一是作为基因探针。

寡核苷酸可以与DNA序列的互补链结合并标记荧光标记，以便研究者可以追踪DNA的存在。

这是许多应用中所需的，例如应用于基因组测序、检测特定DNA序列的技术、核酸杂交检测等。

这些技术都可以使用寡核苷酸做为探针的基础。

除了用作探针之外，寡核苷酸还可以作为特异性代理用于调节基因表达。

这种方法被称为小分子RNA疗法，通常是通过抑制靶基因的表达来治疗疾病。

小分子RNA是一类非编码RNA，长度通常小于22个核苷酸。

当小分子RNA与靶基因的mRNA互补时，它可以将靶基因的mRNA降解，从而抑制该基因的表达。

总之，寡核苷酸作为基因探针和小分子RNA都有着非常广泛的应用前景。

在不断地研究和开发中，相信它们将会有越来越多的重大发现和应用。

寡核苷酸的纯化与质量鉴定

---------------------------------------------------------------最新资料推荐------------------------------------------------------寡核苷酸的纯化与质量鉴定寡核苷酸的纯化与质量鉴定市售或者委托别人合成的寡核苷酸常常已经纯化，自行合成的须经过纯化后方可应用。

一、寡核苷酸的收获和去保护基结合在合成柱内玻璃粉上的寡核苷酸链经浓氨水处理后便脱落下来，核苷酸链上的保护基因在浓氨水中于55℃水浴中保温 6 小时以上被去除，经Sephadex-G25 柱脱盐干燥后分装保存。

(一)将合成柱一头的封盖打开，将颗粒倒入一个 3.0ml 带有密封垫的螺口盖小瓶内，加入新开封的浓氨水 2ml。

密封好，置55℃水浴过夜(至少 6 小时)。

这步操作将脱支持物与去保护基两步合并到一起，目的是为了减少脱支持物不彻底造成的寡核苷酸的丢失。

合成柱不易拆开的，可在合成柱一端接上 5ml 一次性注射器，分两次加入以上量的浓氨水，使氨水充满合成柱并设法使之停留在柱内，留置 15 分钟后将氨水推入小瓶内，再向柱内注入第二次氨水，作用 15 分钟后推出。

同法进行55℃过夜处理。

用注射器注入氨水需注意尽量密封，以免氨气挥发，可将注射器的活塞插入针管内，推入的距离不要太大，以免压力过大使氨水从柱的另一端流出。

(二)从55℃水浴中取出小瓶后不能立即开盖以免液体因氨1 / 6气的逸出而飞溅，需将小瓶置4℃冷却，以降低瓶内氨气产生的压力。

(三)准备 Sephadex-G25 柱。

称取 10gSephadexG25，洒在 200ml 去离子水中，待浸透后置100℃水浴中煮沸 1 小时。

室温下放置 30分钟，倾去上层不沉淀小颗粒。

用一个 10ml 一次性注射器制作分离柱，柱下不接导管，装Sephadex-G25 至 10ml 刻度，在顶上放一圆形滤纸片，以防止加液时搅动柱床，用 30ml1%氨水洗柱，让液体自然流干。

寡核苷酸图谱分析

---------------------------------------------------------------最新资料推荐------------------------------------------------------寡核苷酸图谱分析寡核苷酸图谱分析寡核苷酸图谱分析是指核酸或核酸片段经 T1 核酸酶切割后电泳，少数较大分子量的酶切核酸片段在聚丙烯酰胺凝胶上分布特点的比较。

因为它是通过少数核酸片段来了解整个核酸的特征，如同根据指纹特点判断案情一样，因此又称为指纹图分析(Analysis of fingerprint map)。

该法最大优点为比较简便，敏感性高，能显示出核酸间细小的差别，但缺点是无法对差别大的两条来源不同的核酸进行比较。

目前该种方法已在病毒学研究中得到了广泛的应用，特别是对RNA 病毒分类、鉴定病毒遗传变异等，在流行病学调查中具有重要意义。

(一) 原理提纯后的病毒核酸，通过适当的酶切，可产生大小不同的片段，经放射性同位素标记(或在病毒培养时标记)后，进行垂直双相电泳，再经放射自显影，可得到特征性的图谱，即寡核苷酸指纹图谱。

所用的酶一般是 T1 核糖核酸酶，这种酶是一种 RNA 限制酶，特异性地作用于鸟嘌呤核苷酸的 3磷酸基团，切割与其邻近核苷酸相连的 5磷酯键，最终产物为带 3磷酸鸟嘌呤末端的寡核苷酸，即每断片的 3末端为鸟嘌呤并带有磷酸，而 5末端就暴露出羟基团。

然后在 T4 多核苷酸激酶的作用下，用 32P－ATP 标记寡核苷酸1 / 8的 5末端，最后用饱和酚和酵母 RNA 混合液终止激酶的作用。

在 pH3.5 条件下，从上到下进行第一相电泳，依片段所带电荷的不同将其分开，其后在 pH8.2 条件下，从右到左进行第二相电泳，可根据片段长短的不同将其分开，通过自显影，便可在底片上看到片段的位置和数目，借此对不同的病毒株的核酸进行分析比较。

在电泳中一般采用两种指示剂：一种为溴酚蓝(BPB)，它的大小相当于 8-10 个核苷酸，在 pH3.5 时呈绿色，在 pH8.2时呈蓝色；另一种为联苯胺(Xylene Cyanol，简称 XC)，其大小相当于 25 个核苷酸，在 pH3.5 时为蓝色，pH8.2 时为绿色，它周围的点为重点观察区。

分子生物学实验报告

分子生物学实验报告实验二从 cDNA 文库中靶片断扩增（ 4h ）一、实验目的1.掌握聚合酶链式反应的原理。

2.掌握移液枪和PCR 仪的基本操作技术。

二、实验原理：PCR 技术，即聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction ，PCR）。

经典的PCR 过程包括：变性（denaturing step ）、退火（annealing step ）和延伸（extension step ）三个步骤。

变性过程，即在高温94℃ ~98 ℃下，模板DNA 双链或经PCR 扩增形成的双链DNA 解离，使之形成两条单链ssDNA 。

随后，模板DNA 与引物的退火（复性）过程中，温度降至55℃左右，特异序列的引物与模板DNA 单链的互补序列配对结合；之后，引物的延伸过程，DNA 模板-引物结合物在耐热的DNA 聚合酶（如：Taq 酶）的作用下，以dNTP 为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链。

重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。

每完成一个循环需2～4 分钟，2～3 小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。

PCR 反应的成分和作用：总体积：一般为25μ l ～100 μl（一）无Mg2+buffer ：由纯水、kcl 、Tris 组成。

Tris 用于调节反应体系pH 值，使Taq 酶在偏碱性环境中反挥活性。

kcl 可降低退火温度，但不能超过50 mmol/L ，否则会抑制DNA 聚合酶活性。

（二）Mg2+: 终浓度为 1.5 ～ 2.0mmol/L ，其对应dNTP 为200 μ mol/L ，注意Mg2+ 与dNTPs 之间的浓度关系，由于dNTP 与Taq 酶竟争Mg2+ ，当dNTP 浓度达到 1 mmol/L 时会抑制Taq 酶的活性。

Mg2+能影响反应的特异性和产率。