重组人可溶性PDGFR_Fc在昆虫细胞Sf9中的表达_谢秋玲

昆虫学报A c t aE n t o m o l o g i c aS i n i c a,J u l y2009,52(7):743-748I S S N0454-6296重组人可溶性P D G F Rβ/F c在昆虫细胞S f9中的表达谢秋玲1,2,＊,刘　兰1,2,刘秀贵1,2,张　玲1,2,徐丽慧1,2,洪　岸1,2(1.暨南大学生物工程研究所,广州　510632;2.广东省生物工程药物重点实验室,广州　510632)摘要:【目的】利用昆虫细胞B a c-t o-B a c杆状病毒表达系统表达血小板源性生长因子受体β(P D G F Rβ)链膜外区与人I g GF c片段的可溶性受体融合蛋白s P D G F Rβ/F c,并检测重组蛋白的特异性和生物活性。

【方法】采用B a c-t o-B a c系统,构建重组转移质粒p F a s t b a c-s P D G F Rβ/F c,转化到含穿梭载体B a c m i d的感受态细胞D H10B a c中,使目的基因与杆状病毒基因组D N A发生位点特异性重组,获得重组病毒D N A,将其通过脂质体转染昆虫细胞S f9获得重组病毒。

将该重组病毒感染S f9无血清细胞系,在S f9细胞中表达s P D G F Rβ/F c,对表达产物进行We s t e r nb l o t t i n g检测和P r o t e i n A亲合层析纯化,并进一步通过M T T法检测获得的重组蛋白生物学活性。

【结果】重组病毒感染S f9细胞后,经We s t e r nb l o t t i n g分析,能检测到一条分子量约为97k D a的特异性条带,与目的蛋白大小相符。

通过P r o t e i n A亲和层析,获得了纯度达75%以上,表达量为1μg/m L细胞培养上清的重组融合蛋白,M T T结果显示该重组融合蛋白s P D G F Rβ/F c具有抑制P D G F刺激的B a l b/c3T3细胞增殖的能力。

【结论】具有生物活性的重组可溶性受体融合蛋白s P D G F Rβ/F c可在昆虫细胞中成功地得到表达。

关键词:血小板源性生长因子受体;杆状病毒表达载体系统;昆虫细胞;重组蛋白;M T T法中图分类号:Q965 文献标识码:A 文章编号:0454-6296(2009)07-0743-06E x p r e s s i o no f r e c o m b i n a n t h u m a ns o l u b l ep l a t e l e t-d e r i v e dg r o w t hf a c t o rr e c e p t o r B e t a/F c c h i m e r a i n i n s e c t c e l l S f9X I EQ i u-L i n g1,2,＊,L I UL a n1,2,L I UX i u-G u i1,2,Z H A N GL i n g1,2,X UL i-H u i1,2,H O N GA n1,2(1.I n s t i t u t e o f B i o e n g i n e e r i n g,J i n a n U n i v e r s i t y,G u a n g z h o u510632,C h i n a;2.G u a n g d o n g P r o v i n c e K e y L a b o r a t o r y o fB i o e n g i n e e r i n g M e d i c i n e,G u a n g z h o u510632,C h i n a)A b s t r a c t:【A i m】B a c-t o-B a c b a c u l o v i r u s e x p r e s s i o ns y s t e m w a s u s e dt o o b t a i nas o l u b l e f u s i o np r o t e i ns P D G F Rβ/F c,c o m b i n i n g t h e e x t r a c e l l u l a r d o m a i n o f P D G F Rβc h a i n a n d t h e F c r e g i o n o f h u m a n I g Gi ni n s e c t c e l l s S f9,a n d t h e s p e c i f i c i t y a n d b i o a c t i v i t y o f t h e r e c o m b i n a n t p r o t e i n a r e d e t e c t e d.【M e t h o d s】T h eg e n e s P D G F Rβ/F c w a sc l o n e di n t oat r a n s f e rv e c t o r p F a s t B a ct of o r m t h er e c o m b i n a n t d o n o r p l a s m i dp F a s t b a c-s P D G F Rβ/F c,w h i c h w a s t r a n s f o r m e d i n t o E s c h e r i c h i a c o l iD H10B a c.B y t r a n s p o s i t i o n, s P D G F Rβ/F c g e n e w a s i n t e g r a t e di n t o B a c m i d,a n da r e c o m b i n a n t s h u t t l ev e c t o r r B a c m i d-s P D G F Rβ/F c w a s c o n s t r u c t e d.T h e nt h er B a c m i d-s P D G F Rβ/F cr e c o m b i n a n t g e n o m eD N A w a s u s e dt ot r a n s f e c t S f9 m e d i a t e d b y l i p i d b o d y,a n dt h e r e c o m b i n a n t b a c u l o v i r u s r B a c m i d-s P D G F Rβ/F c w a s o b t a i n e d,w h i c h w a sf u r t h e r u s e d t o i n f e c t t h e s e r u m-f r e e c e l l S f9t o e x p r e s s s P D G F Rβ/F c.T h e n t h e r e c o m b i n a n t p r o t e i n w a sp u r i f i e dw i t hP r o t e i nA c h r o m a t o g r a p h ya n da n a l y z e db yW e s t e r nb l o t t i n ga n dM T T a s s a y.【R e s u l t s】W e s t e r n b l o t t i n g a n a l y s i s s h o w e da s p e c i f i c b a n d a b o u t97k D a,c o n s i s t e n t w i t ht h e t a r g e t p r o t e i n,75% p u r e s P D G F Rβ/F cw a so b t a i n e db yu s i n gP r o t e i nA c h r o m a t o g r a p h yw i t hay i e l do f1μg/m Lc u l t u r e m e d i u m,w h i c hw a sc o n f i r m e dt ob ea b l et oi n h i b i t P D G F-i n d u c e d p r o l i f e r a t i o no f B a l b/c3T3c e l l.【C o n c l u s i o n】T h e r e c o m b i n a n tp r o t e i n s P D G F Rβ/F c w i t h a c t i v i t yo fi n h i b i t i n gP D G F-i n d u c e d c e l l p r o l i f e r a t i o n c a n b e s u c c e s s f u l l y e x p r e s s e d i n i n s e c t c e l l.K e yw o r d s:P l a t e l e t-d e r i v e dg r o w t hf a c t o rr e c e p t o r(P D G F R);b a c u l o v i r u se x p r e s s i o nv e c t o rs y s t e m(B E V S);i n s e c t c e l l;r e c o m b i n a n t p r o t e i n;M T T a s s a y基金项目:广东省科技计划项目(2008B030301349)作者简介:谢秋玲,女,1968年10月生,博士,副研究员,主要从事生物工程制药研究＊通讯作者A u t h o r f o r c o r r e s p o n d e n c e,E-m a i l:t x q l@j n u.e d u.c n收稿日期R e c e i v e d:2008-12-31;接受日期A c c e p t e d:2009-04-13744　昆虫学报A c t aE n t o m o l o g i c aS i n i c a52卷 血小板衍生生长因子(p l a t e l e t d e r i v e dg r o w t h f a c t o r,P D G F)是由血小板、单核/巨噬细胞、内皮细胞、血管平滑肌细胞、肾小球系、膜细胞、纤维母细胞等产生的多肽生长因子,具有促进细胞增殖、细胞趋化以及血管收缩等生物学效应。