抗人转铁蛋白受体单克隆抗体体外抗瘤效应研究

抗人转铁蛋白受体单克隆抗体体外抗瘤效应研究

目的：探讨抗人转铁蛋白受体（TfR）单克隆抗体（mAb）体外抗瘤效应。方法：采用CFSE染色、PIAnnexin Ⅴ染色和PI染色，通过流式细胞术分析抗人TfR mAb对高表达的人肝癌细胞系HepG2和人乳腺癌细胞系MCF7增殖、凋亡和周期的影响；通过MTT法检测抗人TfR mAb联合化疗药物对HepG2和MCF7细胞增殖的抑制作用。结果：抗人TfR mAb能抑制HepG2和MCF7细胞的增殖，并诱导其凋亡和S期阻滞；与化疗药物联用可增强其对肿瘤细胞增殖的抑制作用。结论：抗人TfR mAb具有良好的体外抗瘤效应。

关键字：转铁蛋白受体单克隆抗体体外抗瘤效应

转铁蛋白受体（transferrin receptor，TfR），即CD71分子，是细胞获得铁元素的关键性分子。由于TfR是细胞增殖所必须的，而且在快速生长的肿瘤细胞表面稳定性的高表达[1]，因而成为肿瘤生物治疗的一个相对特异性的靶点。针对TfR的治疗性抗体发展迅速，并在体内、外的抗瘤研究中取得了良好的效果。但有研究显示，不同的TfR抗体的生物学活性不尽相同[2]。我室所获得的抗人TfR单克隆抗体（mAb）可以特异性识别人肿瘤细胞表面TfR胞外端，并具有较高的亲合力，前期实验显示其对人红白血病细胞系K562具有明显的抗瘤作用[3]。在此我们进一步观察抗人TfR mAb对高表达TfR的人肝癌细胞系（HepG2）和人乳腺癌细胞系（MCF7）的增殖、周期和凋亡的影响；以及与临床常用化疗药物[5氟尿嘧啶（5FU）、阿霉素（ADM）]是否存在协同抗瘤作用，为临床应用研究提供实验依据。

1 材料和方法

1.1 材料抗人TfR mAb为本室所收藏的分泌抗人TfR杂交瘤细胞株，经诱生BALB/c（nu/nu）裸鼠腹水，DEAESephadex A50纯化，SDSPAGE电泳鉴定。羧基荧光素二酯酸盐琥珀酰亚胺酯（CFSE）、碘化丙啶（PI）、四甲基偶氮唑蓝（MTT）、二甲亚砜（DMSO）均为Sigma公司产品。PIAnnexin Ⅴ细胞凋亡检测试剂盒为南京凯基生物科技发展有限公司产品。5FU为浙江海正药业有限公司产品。ADM为法玛西亚有限公司产品。人肝癌细胞系HepG2和人乳腺癌细胞系MCF7均由本实验室保存。

1.2 方法

1.2.1 CFSE染色检测肿瘤细胞增殖分别收集对数生长期的HepG2细胞和MCF7细胞，用冰冷的PBS液洗涤2次后，调整细胞密度为5×109/L，取1 mL 加入1 μL CFSE（终浓度为1 μmol/L）置于37℃，孵育30 min。加入1 mL小牛血清终止染色，再用冰冷的PBS洗涤3次后接种于24孔培养板中（5×104/孔）。并预留1×106个染色后的细胞作为母代细胞，40 g/L多聚甲醛固定后4℃避光保存，待上机。待细胞贴壁后分别加入抗人TfR mAb至终浓度为20、40、60、80和100 mg/L，每种浓度重复3孔。并设相同浓度的非特异性鼠源性IgG

作为对照。作用72 h后，收集各组细胞。用冰冷的PBS液洗涤后，采用流式细胞仪FACS检测，并利用ModFit LT for Mac Ⅴ3.0软件进行参数获取和数据分析。

1.2.2 PIAnnexin Ⅴ染色检测肿瘤细胞凋亡分别取对数生长期的HepG2细胞和MCF7细胞接种于24孔培养板中（5×104/孔），加入抗人TfR mAb至终浓度为60 mg/L，重复3孔。并设相同浓度的非特异性鼠源性IgG作为对照。作用72 h后，收集各组细胞。用冰冷的PBS液洗涤2次后，按PIAnnexin Ⅴ细胞凋亡检测试剂盒说明书操作，采用流式细胞仪FACS检测，并利用CellQuest 软件进行参数获取和数据分析。

1.2.3 PI染色检测肿瘤细胞周期分别取对数生长期的HepG2细胞和MCF7细胞接种于24孔培养板（5×104/孔），加入抗人TfR mAb至终浓度为60 mg/L，重复3孔。并设相同浓度的非特异性鼠源性IgG作为阴性对照。作用72 h后，收集各组细胞。用冰冷的PBS液洗涤2次后，加入预冷的700 mL/L乙醇固定细胞4℃过夜。流式检测前用PBS液洗去固定液，加入0.5 mL的PI综合染液（含50 g/L RNA酶），避光染色30 min后，采用流式细胞仪FACS检测，并利用ModFit LT for Mac Ⅴ3.0软件进行参数获取和数据分析。

1.2.4 MTT比色法检测抗人TfR mAb联合化疗药物对肿瘤细胞增殖抑制作用分别取对数生长期的HepG2细胞和MCF7细胞接种于96孔培养板（1×104/孔），待细胞贴壁后，根据预实验结果分别加入IC50浓度的化疗药物（5FU、ADM）和抗人TfR mAb，37℃，50 mL/L CO2继续培养48 h后，每孔加入10 μL MTT （终浓度为0.5 g/L），继续培养4 h后，1000 r/min离心10 min，弃上清，每孔加100 μL DMSO，室温放置15 min，待甲臜完全溶解后，用酶标仪测定其A570值（以A630校准）。实验分为单用抗人TfR mAb组、单用化疗药物组和抗人TfR mAb联用化疗药物组。生长抑制率按如下公式计算：生长抑制率=[（1-实验组平均A值）/对照组平均A值]×100%。

1.2.5 统计学分析实验数据使用x±s表示，采用SPSS13.0统计软件进行Independent Sample T Test或OneWay ANOV A分析，组内差异采用LSD检验和q检验，以P＜0.01为具有统计学意义。

2 结果

2.1 抗人TfR mAb对肿瘤细胞增殖的抑制作用CFSE预染的HepG2细胞和MCF7细胞在含20、40、60、80和100 mg/L抗人TfR mAb的培养液中培养72 h后，与对照组（含相同浓度的鼠源性IgG）相比，增殖指数明显下降，具有统计学意义（P＜0.01，图1）。图1 抗人TfR mAb对HepG2细胞和MCF7细胞的生长抑制作用（略）

2.2 抗人TfR mAb诱导肿瘤细胞凋亡如图2所示，HepG2细胞和MCF7细胞在含60 mg/L抗人TfR mAb的培养液中培养72 h后，PI和Annexin ⅤFITC 染色后，以PI和Annexin Ⅴ双阳性细胞作为凋亡细胞，2种细胞均可见实验