临床免疫学免疫电泳技术

第七章免疫电泳技术
本章考点
1.概述
2.免疫电泳技术
3.应用
免疫电泳技术是根据抗原及抗体反应的高度特异性，电泳技术的高分辨力和具有微量、快速的特点，将凝胶内电泳与免疫扩散相结合的一项免疫学技术。

第一节基本原理
一、原理
免疫电泳技术实质上是在直流电场作用下的凝胶扩散试验。

它的原理是将凝胶扩散置于直流电场中，在一定的条件下，抗原及抗体离解成为带正电或负电的电子，在电场中向异相电荷的电极移动，所带净电荷量越多、颗粒越小，泳动速度越快，反之则慢。

由于电流加速了抗原、抗体的运行速度，缩短了两者结合的时间，加快了沉淀现象的产生。

当有多种带电荷的物质电泳时，由于静电荷不同，而区分成不同区带，使抗原决定簇不同的成分得以区分。

影响因素有：①电场强度；②溶液pH；③离子强度；④电渗等。

二、电解质和蛋白质的电离特性、电泳迁移率、电渗
蛋白质的基本单位是氨基酸，在水溶液中具有两性电离特性，当缓冲液pH与蛋白质等电点（PI）相当时呈电中性，无电泳迁移性；缓冲液pH大于蛋白质等电点（PI）时带正电荷，向阴极端移动；缓冲液pH
小于蛋白质等电点（PI）时带负电荷，向阳极端移动。

在同一电场条件下，各种带电粒子在单位时间内的移动距离称电泳迁移率。

在电场中液体对固体可出现相对移动，产生电渗现象。

电渗不影响蛋白质的分离，但影响其原点位置。

影响因素有：①电场强度；②溶液pH；③离子强度；④电渗。

三、常用载体
有琼脂和琼脂糖凝胶。

其特点是提高了敏感性及反应速度，并可将带电性不同的组分区分开。

第二节常用技术
免疫电泳常用技术有：
1.对流免疫电泳：对流免疫电泳原理是将双向扩散试验与电泳相结合的定向加速的免疫扩散技术。

在琼脂板上打两排孔，左侧各加入待测抗原，右侧孔内加入相应抗体，抗原在阴极侧，抗体在阳极侧。

通电后，在pH8.4缓冲液中带负电荷的蛋白质抗原泳向阳极抗体侧，而抗体借电渗作用流向阴极侧，在两者之间或抗体侧形成沉淀线。

本法敏感度比双向扩散试验高8～16倍。

图23 对流电泳示意图（1）为阳性，（2）为弱阳性，（3）抗原强阳性，抗原过量，（4）抗原强阳性
2.火箭免疫电泳：火箭免疫电泳原理是将单向扩散试验与电泳相结合的免疫扩散技术。

实质上是加速度的单向扩散。

当待测抗原在含有适量抗体的琼脂板中泳动时，在抗原与抗体达到适当比例时。

形成大的不溶性免疫复合物而沉淀，此沉淀物不再移动，未与抗体结合的抗原可穿过此沉淀，继续向前迁移并形成新的沉淀，随着抗原的减少，沉淀带越来越窄，形成火箭状沉淀，峰形高度与抗原量成正相关。

当琼脂中抗体量固定时，以不同浓度的抗原泳动的沉淀峰高度绘制标准曲线。

图24 火箭电泳
（1）（2）（3）为标本
（4）（5）（6）为标准抗原
3.免疫电泳：是区带电泳和免疫双扩散相结合的一种免疫化学技术。

检测原理是在普通琼脂中央纵向挖一2.0mm宽的小槽，两侧各打一孔，将待测标本与标准抗原分别加入两侧孔内进行琼脂区带电泳，各蛋白质抗原成分因分子量及电泳迁移率不同，分离成若干肉眼不可见的区带，然后将抗体放入槽内进行自由扩散，根据抗原电泳位置、含量及与抗体比例不同，而出现不同位置、不同形状和不同大小的沉淀线。

待测样品与已知抗原相比较，可对待测样品的成分及性质进行分析。

此技术为定性试验，目前主要用在纯化抗原和抗体成分的分析及正常和异常免疫球蛋白的识别与鉴定。

图25 免疫电泳示意图
4.免疫固定电泳：这是区带电泳与免疫沉淀反应相结合的技术。

检测原理是将血清蛋白质在琼脂糖凝胶介质上电泳后，再将抗血清直接加入电泳后蛋白质区带表面，或将浸有抗血清的滤纸贴于其上。

参考泳道则加蛋白固定剂，作区带参考。

孵育后，抗原与对应抗体直接发生沉淀反应，形成的复合物嵌于固相支持物中。

经固定后的电泳凝胶在洗脱液中漂洗，将未结合的游离抗原或抗体洗去，则出现被结合固定的某种蛋白，氨基黑染色后观察结果。

第三节免疫电泳技术临床应用
免疫电泳目前大量应用于纯化抗原和抗体成分的分析及正常和异常体液蛋白的识别等方面；火箭免疫电泳作为抗原定量只能测定μg／ml以上的含量，目前较多应用于放射自显影技术；免疫固定电泳最常用于M蛋白的鉴定，此外免疫固定电泳也用于尿液中本周蛋白的检测及κ、λ分型、脑脊液中寡克隆蛋白的检测及分型。

习题38 在对流免疫电泳中，抗体向阴性移动的原因是
A.抗体带正电
B.抗体带负电
C.扩散作用
D.电泳作用
E.电渗作用
[答疑编号5]
『正确答案』E
『答案解析』通电后，在pH8.4缓冲液中带负电荷的蛋白质抗原泳向阳极抗体侧，而抗体借电渗作用流向阴极侧，在两者之间或抗体侧形成沉淀线。

习题39 对流免疫电泳沉淀线出现在抗体阳极一侧，说明
A.抗原强阳性
B.抗原阳性
C.抗原弱阳性
D.抗原阴性
E.与抗原抗体无关
[答疑编号5]
『正确答案』A（见解析）
『答案解析』
对流电泳示意图（1）为阳性，（2）为弱阳性，（3）抗原强阳性，抗原过量，（4）抗原强阳性
第八章放射免疫分析
本章考点
1.概述
2.放射免疫分析
3.免疫放射分析
4.应用
第一节概述
放射免疫分析是利用放射性核素可探测的灵敏性、精确性和抗原抗体反应特异性相结合的一种免疫技术。

此技术灵敏度高（可检测到ng、pg水平）、特异性强、重复性好、样品及试剂用量小是其优点，但核素的放射性，对工作人员和环境易造成危害或污染，是其缺点。

放射免疫分析常用的放射性核素有：125I、130I、3H、14C等。

放射免疫分析基本类型有：放射免疫分析（RIA）、免疫放射分析（IRMA）。

广义上还应包括放射受体分析及放射配体结合分析。

第二节放射免疫分析（RIA）
1.放射免疫分析（RIA）基本原理：其原理为标记抗原（Ag*）和非标记抗原（Ag）对有限量特异性抗体竞争性结合反应。

Ag*是试剂成分，而Ag是待测抗原，Ab也是试剂中成分。

Ag*和Ab的量是固定微量的，而待测的Ag 量是不固定的。

解释：如果将Ag*-Ab复合物与游离（剩余的）Ag*分开，分别测定它们的放射性，就可算出结合态的标记抗原（B： Ag*-Ab复合物中的Ag*）与游离态的标记抗原（F：单独、剩余的Ag*）的比值（B/F），或算出结合率[B/（B+F）]，它们与待测Ag量呈函数关系（反比关系）。

2.剂量反应曲线：剂量反应曲线又称标准曲线，即用标准物浓度（Ag）对结合率[B/（B+F）]作图。

在
RIA中被测定物质的浓度（量）可从标准曲线上查得；同时标准曲线又是验证方法的灵敏度、检验抗血清质量和鉴定标准品纯度的主要依据。

随着计算机的普及，可通过计算机的放免处理程序来绘制标准曲线。

3.测定方法：RIA测定方法分三个步骤即：①待测标本中未标记抗原，标记抗原和抗体进行竞争抑制反应；②将标记抗原和抗体相结合的复合物（B）和未结合的标记抗原（F）的分离（分离方法有第二抗体法、聚乙二醇沉淀法、PR法、活性炭吸附法等）；③对B进行放射性强度的测定（B为标记抗原抗体复合物，F 为游离标记抗原）。

根据标准曲线查得待测抗原浓度。

说明：此辅导中图片均引自陶义训主编：免疫学和免疫学检验，人民卫生出版社，1995年9月第1版第4次印刷（版权归原作者，此处仅为授课之用，不作为出版物）
第三节免疫放射分析（IRMA）
免疫放射分析（IRMA）是从RIA基础上发展起来的核素标记免疫测定。

其特点是用核素标记的抗体直接与受检抗原反应并用固相免疫吸附剂作为B或F的分离手段。

1.基本原理：IRMA属于非竞争性免疫结合反应，是将放射性核素标记抗体，用过量的标记抗体（Ab*）与待测抗原反应（反应式为Ag+Ab*=Ag-Ab*+Ab*）。

待充分反应后，除去游离的标记抗体，Ag-Ab*+Ab*结合物的放射性强度与待测抗原呈正比关系
2.IRMA与RIA的异同点见表4-8-1。

表4-8-1IRMA与RIA的异同点
RIA IRMA
标记物质核素标记抗原核素标记抗体
反应速度较慢较快
反应模式竞争抑制非竞争结合
标准曲线的工作浓度
针对多克隆抗体特异性较
低
针对单克隆抗体特异性较强
标准曲线的工作浓度2～3数量级3个数量级以上分析误差加样误差严重影响结果较小
其他
可测大分子量与小分子量
的物质
只能测定在分子上具有2个以
上抗原表位物质
标记物限量过量
第四节放射免疫分析在医学中的应用
放射免疫分析由于敏感度高、特异性强、精密度高，并可测定小分子量和大分子量物质，所以在医学检验中应用广泛，常用于测定各种激素（如甲状腺素、性激素、胰岛素等）、微量蛋白质、肿瘤标志物（如AFP、CEA、CAl25、CAl99等）和药物（如巴比妥、氨丙嗪）等。

由于核素的放射性对人体有一定的危害性，必须加以防护，核素实验室的建设须经防疫部门的监督，操作人员亦须经过特殊训练。

核素有半衰期，试剂盒的货存期较短，因而放射免疫分析在应用中有诸多不便之处。

近年来标记免疫分析技术如酶免疫分析、发光免疫分析等在技术上有飞跃的进展，高级仪器的自动化程度已可与生化自动分析仪相媲美，因此从长远前景看，放射免疫分析仪有被取代的趋势。

习题40 在RIA检测中，其结合率用于B/B+F表示，其意义是
A.结合态的标记抗原与总的标记抗原之比
B.结合态的标记抗原与游离的标记抗原之比
C.总标记抗原与抗原抗体复合物之比
D.结合态抗原与总抗体之比
E.结合态抗原与总抗原之比
[答疑编号5]
『正确答案』A
『答案解析』结合态的标记抗原（B： Ag*-Ab复合物中的Ag*）与游离态的标记抗原（F：单独、剩余的Ag*）的比值（B/F），或算出结合率[B/（B+F）]
习题41 关于RIA原理，正确的是当Ag增多时
A.B/F值增大
B.B/（B+F）值减少
C.B增多
D.B+F减少
E.F减少
[答疑编号5]
『正确答案』B
『答案解析』B为结合态标记抗原，F为游离态标记抗原。

B+F为总标记抗原（结合态+游离态）。

B/B+F为结合率，结合率与待测抗原量成反比。

习题42 下列有关放射免疫分析（RIA）的叙述中，错误的是
A.以放射性核素作为标记物
B.是一种定量检测技术
C.主要用于检测抗原
D.最后形成的免疫复合物中的放射性强度与标本中待测物质含量呈正比
E.定量分析时需先做标准曲线
[答疑编号5]
『正确答案』D
『答案解析』成反比关系。

习题43 用RIA检测某种激素在血清中的浓度时，其抗原抗体复合物中放射性强度越大，表明
A.该激素在血清中浓度越高
B.该激素在血清中浓度越低
C.游离的标记激素的浓度越高
D.对这种激素的特异性抗体浓度越高
E.该激素及游离的标记激素的浓度越高
[答疑编号5]
『正确答案』B
习题44 目前，RIA在下列哪项检测上使用较少
A.内分泌激素
B.药物监测
C.肿瘤标记物
D.细菌抗原
E.微量蛋白质
[答疑编号5]
『正确答案』D
习题45 RIA中标记的鉴定指标是
A.放射性碘的含量
B.放射性游离碘的含量
C.标记前的免疫活性
D.标记后的免疫活性
E.放射性比度
[答疑编号5]
『正确答案』B、D、E
习题46 用125I标记抗原，不正确的是
A.直接标记法仅用于含酪氨酸的化合物
B.间接标记法可标记缺乏酪氨酸的肽类及某些蛋白
C.T氯胺标记法是最常用的直接标记法
D.间接法标记蛋白质的比较放射性高于直接法
E.间接标记法对蛋白质的损伤较小
[答疑编号5]
『正确答案』D（见解析）
『答案解析』用放射性同位素125I标记抗原有直接法和间接法两种方法。

直接法最常用的是T氯胺标记法，标记率高低与抗原分子中酪氨酸含量及酪氨酸暴露程度有关。

间接法是先将T氯胺与一种物质结合，然后再标记抗原。

间接法优点是避免放射性物质对抗原的损伤，但是间接法标记蛋白质的放射性显著低于直接法。

习题47 免疫放射测定（IRMA）和RIA的区别中，错误的是
A.RIA使用标记抗原，IRMA使用标记抗体
B.RIA检测抗原，IRMA检测抗体
C.RIA中抗体结合标记抗原的量与被测抗原浓度成反比，而IRMA中成正比
D.RIA中需对B、F分别作放射强度测定，IRMA只测上清液的放射强度
E.IRMA为非竞争结合，RIA为竞争抑制
[答疑编号5]
『正确答案』B（见对比表）。