急性白血病病人WT1 mRNA表达及临床意义

精准医学杂志２０１８年１０月第３３卷第５期㊀JP r e c i sM e d ,O c t o b e r ２０１８,V o l ．３３,N o ．５
d o i :１０．１３３６２/j ．j p
m e d ．２０１８０５０１８㊀㊀文章编号:２０９６Ｇ５２９X (２０１８)０５Ｇ０４４４Ｇ０３[收稿日期]２０１８Ｇ０７Ｇ２２;㊀[修订日期]２０１８Ｇ０９Ｇ２７[基金项目]湖南省卫计委科研项目(C ２０１５Ｇ０７５)[通讯作者]胡国瑜,E m a i l :d o c t o r h g y
＠１６３．c o m 急性白血病病人WT １m R N A 表达及临床意义
谭奎１㊀沈婵娟２㊀袁朝晖２㊀胡国瑜２
(株洲市中心医院,湖南株洲㊀４１２００７㊀１㊀血液科实验室;㊀２㊀血液科)
[摘要]㊀目的㊀研究肾母细胞瘤基因１(WT １)m R N A 在急性白血病(A L )
病人骨髓中的表达及其临床意义.方法㊀采用R Q ＧP C R 方法检测６５例初治A L 病人骨髓中WT １m R N A 的相对表达量,并随访观察其中５３例病人疾病不同阶段骨髓中WT １m R N A 表达水平.结果㊀６５例A L 病人中,７８．５％的病人骨髓中WT １m R N A 表达阳性,急性淋巴细胞白血病(A L L )和急性髓系白血病(AM L )病人骨髓中WT １m R N A 阳性表达率分别为６２．５％和
８０．４％.初诊组㊁复发组㊁未缓解(N R )组病人骨髓中WT １m R N A 相对表达量显著高于完全缓解(C R )组(Z ＝－６．０８９~－５．４５０,P ＜０．０１);WT １m R N A 阳性组病人的C R 率明显低于阴性组病人(P ＝０．０１２).结论㊀A L 病人WT １m R N A 表达水平与疾病的发生发展密切相关,
可作为临床疗效评估㊁预后判断及微小残留病检测的指标.[关键词]㊀白血病;急性病;基因,肾母细胞瘤;R N A ,信使;聚合酶链式反应[中图分类号]㊀R ７３３．７１㊀㊀㊀㊀[文献标志码]㊀A
E X P R E S S I O NO
F W T １m R N AI N P A T I E N T S W I T H A C U T E L E U K E M I A A N DI T SC L I N I C A LS I
G N I F I C A N C E ㊀T A N K u i ,
S H E N C h a n j u a n ,Y U A N Z h a o h u i ,HUG u o y u ㊀(D e p a r t m e n t o fH e m a t o l o g y L a b o r a t o r y ,Z h u z h o uC e n t r a lH o s p i t a l ,Z h u z h o u ４１２００７,C h i n a
)[A B S T R A C T ]㊀O b j
e c t i v e ㊀T o s t u d y t h e e x p r e s s i o no fW i l m s t u m o r g e n e１(WT １)m R N Ai nt h eb o n em a r r o wo
f p a t i e n t s w i t h a c u t e l e u k e m i a (A L )a n d i t s c l i n i c a l s i
g n i f i c a n c e ．㊀M e t
h o d s ㊀T h e r e l a t
i v e e x p
r e s s i o no fWT １m R N Ai n t h e b o n em a r r o wo f ６５p a t i e n t sw i t hn e w l y d i a g n o s e dA Lw a sm e a s u r e d b y R Q ＧP C R．T h e e x p
r e s s i o no fWT １m R N A i n t h e b o n em a r r o ww a s o b s e r v e d f o r ５３o f t h e s e p a t i e n t s a t d i f f e r e n t s t a g e s o f d i s e a s e ．㊀R e s u l t s ㊀T h e e x p r e s s i o no fWT １m R N Ai n t h e b o n em a r r o w w a s p o s i t i v e i n７８．５％o f t h e ６５A L p a t i e n t s ．T h e p o s i t i v e e x p r e s s i o nr a t e so fWT １m R N Ai n p a t i e n t sw i t ha c u t e l y m p
h o b l a s t i c l e u k e m i aa n d t h o s ew i t ha c u t em y e l o i d l e u k e m i aw e r e ６２．５％a n d ８０．４％,r e s p e c t i v e l y ．T h e r e l a t i v e e x p r e s s i o no fWT １m R N A i n t h e b o n em a r Ｇr o w w a s s i g n i f i c a n t l y h i g h e r i nt h en e w l y d i a g n o s e d ,r e l a p s e d ,a n dn o n Ｇr e m i s s i o n g r o u p s t h a ni nt h ec o m p
l e t er e m i s s i o n (C R )g r o u p (Z ＝－６．０８９－－５．４５０,P ＜０．０１);t h e r a t e o f C R i n t h eWT １m R N A Ｇp o s i t i v e g r o u p w a s s i g n i f i c a n t l y l o w e r t h a n t h a t i n t h e WT １m R N A Ｇn e g a t i v e g r o u p (P ＝０．０１２)．㊀C o n c l u s i o n ㊀T h e e x p r e s s i o no fWT １m R N Ai nA L p a t i e n t s i s c l o s e l y a
s s o c i a t e dw i t h t h e d e v e l o p m e n t a n d p r o g r e s s i o no f t h e d i s e a s e ．I t c a nb e u s e d a s a n i n d i c a t o r o f c l i n i c a l o u t c o m e ,p r o g n o s i s ,a n dm i n i m a l r e s i d u a l d i s e a s e ．
[K E Y W O R D S ]㊀L e u k e m i a ;A c u t e d i s e a s e ;G e n e s ,w i l m s t u m o r ;R N A ,m e s s e n g e r ;P o l y
m e r a s e c h a i n r e a c t i o n ㊀㊀肾母细胞瘤基因１(WT １)基因最早于１９９０年
由C A L L 从儿童肾母细胞瘤中分离并鉴定出来[１]
,定位于人染色体１１p １３.研究证实其编码的锌指蛋白具有转录激活和抑制双重功能,在调控细胞的生长和分化中发挥着重要作用[
２]
.本研究通过对我院初治急性白血病(A L )病人治疗各阶段骨髓中WT １
m R N A 表达水平检测,进一步探讨其表达水平与病人病程及预后关系.现将结果报告如下.１㊀资料与方法
１．１㊀一般资料
选取２０１４年２月 ２０１６年１２月于我院就诊的初诊为A L 病人６５例,其中男４０例,女２５例;平均年龄(５１．３ʃ１８．５)
岁.所有病人均经骨髓细胞学㊁流式免疫分型㊁染色体以及融合基因检测确诊,按照F A B 标准进行分型:急性淋巴细胞白血病(A L L )８例,急性髓系白血病(AM L )５４例(
其中M ２２２例,M ３１４例,M ５１８例),急性混合细胞性白血病(AM L L )１例,骨髓增生异常综合征急变M ２１例,慢性粒细胞白血病急变M ２１例.同期选择健康志愿者１０例和再生障碍性贫血１０例作为对照组.初诊A L 病人及治疗各阶段所取标本均为骨髓
标本,对照组中健康志愿者为外周血标本,再生障碍性贫血为骨髓标本.
１．２㊀仪器与试剂
红细胞裂解液(天根生化科技有限公司),WT １m R N A 检测试剂盒(
上海源奇生物医药科技有限公司),A B I ７３００荧光定量P C R 仪(美国A B I 公司).１．３㊀研究方法
１．３．１㊀细胞总R N A 的提取㊀取E D T A 抗凝的病人骨髓或外周血适量,加入２倍体积的红细胞裂解 ４４４
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液与之混匀,置４ħ冰箱１０m i n(红细胞破裂,呈红色透明状),后以５０００r/m i n离心２~４m i n,弃上清液保留沉淀(可再清洗１次),在沉淀中加入适量D E P CＧH２O,制成细胞悬液.取１００μL细胞悬液,加入３倍体积T r i z o l,彻底混匀,采用T r i z o l法提取细胞总R N A,４ħ保存R QＧP C R待用.１．３．２㊀WT１m R N A表达的检测㊀采用R QＧP C R 一步法检测病人骨髓或外周血中WT１m R N A的表达,以A B L为内参基因.目的基因(或内参基因)反应体系:目的基因(或内参基因)反应液８μL＋酶液２μL＋R N A１５μL,总体积为２５μL.反应条件为:４２ħ３０m i n;９４ħ预变性５m i n;然后９４ħ１５s,６０ħ１m i n,共进行４０个循环.获得扩增曲线,得到WT１基因及A B L基因检测浓度.WT１m R N A 相对表达量＝(WT１基因检测浓度/A B L基因检测浓度)ˑ１００％.以骨髓中WT１m R N A的相对表达量＞０．５５％为阳性,外周血中WT１m R N A相对表达量＞０为阳性.
２㊀结㊀㊀果
２．１㊀对照组及A L组WT１m R N A的表达
６５例A L病人５１例骨髓中WT１m R N A表达阳性,阳性表达率为７８．５％;其中８例A L L病人中５例表达阳性,阳性表达率为６２．５％;５６例AM L病人中４５例表达阳性,阳性表达率为８０．４％,该基因在A L L及AM L骨髓中表达比较差异无统计学意义(P＞０．０５).１例AM L L病人骨髓中WT１m RＧN A相对表达量为２７２．３％.对照组骨髓和外周血中均未检测到WT１m R N A的表达.AM L中M２㊁M３㊁M５亚型病人骨髓中WT１m R N A相对表达量中位数分别为５０．６５％㊁１６２．２％㊁３９．２９％,初诊A L 病人各亚型间(排除AM L L)骨髓中WT１m R N A 相对表达量差异有显著性(χ２＝４３３．８７８,P＜０．０１); M２㊁M５亚型病人WT１m R N A的相对表达量均明显低于M３亚型病人(Z＝－１５．２６６㊁－１９．１４７,P＜０．０１);M２亚型病人WT１m R N A相对表达量明显高于M５亚型病人(Z＝－４．５１８,P＜０．０１).２．２㊀WT１m R N A表达与病人预后的关系
经标准方案化疗后,随访观察１２个月,排除死亡及脱访者,动态监测５３例A L病人WT１m R N A 的表达,其中４０例达到C R,５例N R,８例复发,其中４例WT１m R N A已转阴的病人在临床提示C R 时WT１m R N A转为阳性,而此时血常规及形态学均提示C R,比形态学确认的临床复发提前了平均(６８ʃ１８．６７)d.根据病人的疗效,将其分为初诊组㊁复发组㊁N R组㊁C R组.初诊组㊁复发组㊁N R组㊁C R 组WT１m R N A相对表达量中位数分别为３４．５％㊁５９．４％㊁７９．６％㊁０.初诊组㊁复发组㊁N R组WT１m R N A的相对表达量均显著高于C R组,差异有显著性(Z＝－６．０８９~－５．４５０,P＜０．０１);初诊组㊁复发组与N R组WT１m R N A相对表达量比较差异无统计学意义(P＞０．０５).
初诊时WT１m R N A阳性的３９例病人中获得完全缓解２６例,复发８例,C R率为６６．６７％,复发率为２０．５％,WT１m R N A阴性的１４例病人中获得完全缓解１４例,C R率为１００％,复发率为０,两者C R 率比较差异有统计学意义(P＝０．０１２),两者复发率比较差异无统计学意义(P＞０．０５).
３㊀讨㊀㊀论
大量研究表明,WT１基因是抑癌基因,同时又发挥癌基因样作用,在血液系统恶性疾病中起非常重要的作用[３Ｇ４].本研究发现,WT１m R N A在A L 的骨髓中有较高表达,在正常人的骨髓或外周血中未检测到其表达,与文献报道的在白血病细胞中高表达,在正常成熟细胞中无表达或者极微量表达一致[５Ｇ６],说明WT１基因与A L的发生发展有关,可能参与了白血病细胞的分化[７Ｇ８].本研究结果显示, A L L㊁AM L病人骨髓中WT１m R N A表达阳性率分别为６２．５％和８０．４％,两组阳性率比较差异无统计学意义,这与国内外相关研究结果一致[５,９Ｇ１０].在AM L各亚型中,M３组WT１m R N A相对表达水平最高,其次是M２,再次是M５,这也与相关文献报道的结果一致[１１Ｇ１２].国内外学者研究结果[３,５Ｇ６]和本研究结果均证明WT１m R N A在A L中过表达,且具有较高的阳性率,提示WT１m R N A检测可具有更广泛的临床应用价值,尤其是对于无特异分子学标记的A L.
本研究跟踪随访５３例A L病人,对其不同转归进行分组,比较他们之间的WT１m R N A表达水平,初诊组㊁复发组㊁N R组病人的WT１m R N A表达水平显著高于C R组.提示WT１m R N A的表达水平可作为评估疾病疗效㊁预测疾病转归的有效指标之一,特别是对于无特异性基因标志的白血病病人.有学者分析AM L病人WT１m R N A的表达,结果显示WT１高表达组治疗后１年C R率低于WT１低表达组,而两组复发率比较差异无显著性[１３Ｇ１４],这与本研究结果基本一致.而陆丽娜等[１５]对AM L病
５４４
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人预后研究显示,WT１增高组比WT１正常组复发率更高,差异有统计学意义,但是与本研究结果有一定差异,可能与治疗方案及疾病结构组成不同有关.
A L是血液系统常见的恶性肿瘤之一,目前随着治疗方法和药物的更新,缓解率已经得到了很大提高,但是白血病易复发仍是治疗中难以攻克的难题,微小残留病灶(M R D)是导致复发的直接原因,与病人预后密切相关,动态监测M R D能有助于监测治疗效果以及早期预测血液学复发情况[１６Ｇ１８].本研究动态观察WT１m R N A不同疾病阶段的表达,结果显示初诊WT１m R N A阳性表达病人随着治疗的好转WT１m R N A表达水平逐渐下降直至转阴, WT１m R N A已转阴的病人随着病情的复发WT１m R N A可转阳,并且可早于临床指标提示的复发, WT１m R N A表达阳性且未达到C R的病人WT１m R N A表达持续阳性,WT１m R N A阳性表达组具有更低的缓解率.提示WT１m R N A可作为评估治疗效果㊁判断预后㊁预测复发及M R D监测的临床指标之一.这与国内相关研究结果一致[１９Ｇ２０],与国外学者认为WT１可以作为一种新的泛白血病基因用于M R D的监测以及预测复发的结论也是一致的[１８,２１].
综上所述,应用R QＧP C R一步法可以高效快速地检测A L病人WT１m R N A表达水平,具有重要的临床价值,对A L病人疾病的进展㊁疗效的监测㊁判断预后㊁预测复发及M R D的监测均有重要意义,尤其是对于无特异性分子学标志物的白血病,为临床个体化精准治疗提供更可靠的依据.
[参考文献]
[１]C A L LK M,G L A S E R T,I T O C Y．e t a l．I s o l a t i o na n dc h aＧr a c t e r i z a t i o no faz i n cf i n g e r p o l y p e p t i d e g e n ea tt h eh u m a n
c h r o m o s o m e l１W i l m s t u m o r l o c u s[J]．C e l l,１９９０,６０(３):５０９Ｇ
５２０．
[２]S U G I Y AMA H．WT１(W i l m s t u m o r g e n e１):B i o l o g y a n d
c a n c e r i mm u n o t h e r a p y[J]．J p n J C l i nO n c o l,２０１０,４０(５):３７７Ｇ
３８７．
[３]武双双,薛露,马翠,等．WT１基因在急性白血病中的表达及其意义[J]．中国医药指南,２０１６,１４(２２):１１５Ｇ１１６．[４]S C H A R N H O R S T V,V A N D E R E B AJ,J O C H E M S E N A G．WT１p r o t e i n s:F u n c t i o n s i n g r o w t h a n d d i f f e r e n t i a t i o n[J]．
G e n e,２００１,２７３(２):１４１Ｇ１６１．
[５]I N O U E K,S U G I Y AMA H,O G AWA H,e ta l．WT１a sa n e w p r o g n o s t i c f a c t o ra n dan e w m a r k e r f o r t h ed e t e c t i o no f m i n i m a l r e s i d u a l d i s e a s e i n a c u t e l e u k e m i a[J]．B l o o d,１９９４,８４
(９):３０７１Ｇ３０７９．[６]M E N S S E N H D,R E N K L HJ,R O D E C K U,e t a l．D e t e c t i o n
b y m o n o
c l o n a l a n t i b o
d i
e s o
f t h eW i l m s＇t u m o r n u c l e a r p r o t e i n i n
p a t i e n t sw i t ha c u t e l e u k e m i a[J]．I n tJC a n c e r,１９９７,７０(５):５１８Ｇ５２３．
[７]V A ND R I E S S C H EA,B E R N E MA NZN,V A NT E N D E L O O V F．A c t i v es p e c i f i ci mm u n o t h e r a p y t a r g e t i n g t h e W i l m s t u m o r p r o t e i n１(WT１)f o r p a t i e n t sw i t hh e m a t o l o g i c a lm a l i gＧn a n c i e s a n d s o l i d t u m o r s:L e s s o n s f r o me a r l y c l i n i c a l t r i a l s[J]．O n c o l o g i s t,２０１２,１７(２):２５０Ｇ２５９．
[８]李行,李晓云,李强,等．WT１基因在慢性粒细胞白血病中表达的相关性研究[J]．哈尔滨医科大学学报,２０１４,４８(３):２２７Ｇ２２９．
[９]聂波,杨弘,武坤,等．WT１基因在白血病患者中的表达及临床意义[J]．昆明医科大学学报,２０１６,３７(４):８０Ｇ８３．
[１０]曾春梅,冉学红,赵莎莎,等．WT１基因在急性白血病患者中的表达及其临床意义[J]．现代医药卫生,２０１１,２７(７):９７４Ｇ９７６．[１１]邓宽国,杨文东．联合检测WT１基因和C O XＧ２基因表达在急性白血病的临床价值[J]．现代检验医学杂志,２０１４,２９(４):３０Ｇ３５．
[１２]郝英婵,徐修才．WT１定量联合F C M在急性髓细胞白血病M R D监测中的临床应用[J]．安徽医科大学学报,２０１７,５２(３)３９２Ｇ３９６．
[１３]戴静．WT１在急性髓系白血病病人骨髓中表达及临床意义分析[J]．齐齐哈尔医学院学报,２０１７,３８(１６):１８６９Ｇ１８７１．[１４]郑玉婷．急性髓系白血病病人骨髓中WT１基因的表达及其对预后的影响和意义[D]．安徽医科大学,２０１６:１Ｇ５９．
[１５]陆丽娜,马梁明．WT１m R N A表达基因与急性髓细胞白血病预后的研究[J]．中国实用医药,２０１４,９(２６):６３Ｇ６４．[１６]A HM E DZA,S HA L K H MS,MO A T T E RT．A s s e s s m e n t o f WT１e x p r e s s i o na sa m a r k e ro f t r e a t m e n to u t c o m e i nk a r y oＧt y p en o r m a l a c u t em y e l o i d l e u k e m i a p a t i e n t s i n p a k i s t a n[J]．J
C o l l P h y s i c i a n s S u r q P a k,２０１６,２６(５):４４１Ｇ４４２．
[１７]Y O O NJH,K I M HJ,KWA K D H,e t a l．H i g h WT１e xＧp r e s s i o n i s a ne a r l yp r e d i c t o r f o r r e l a p s e i n p a t i e n t sw i t ha c u t e p r o m y e l o c y t i c l e u k e m i a i n f i r s t r e m i s s i o nw i t hn e g a t i v eP M LＧR A R aa f t e ra n t h r a c y c l i n eＧb a s e dc h e m o t h e r a p y:As i n g l eＧc e nＧt e r c o h o r t s t u d y[J]．JH e m a t o lO n c o l,２０１７,１０(１):３０．[１８]I S R A Y E L Y A N A,G O L D S T E I NL,T S A IW,e t a l．R e a lＧt i m e
a s s e s s m e n t o f r e l a p s e r i s k
b a s e d o n t h eWT１m R N A m a r k e r i n
a c u t e l e u k e m i aa n d m y e l o d y s p l a s t i cs y n d r o m e p a t i o n t sa f t e r
h e m a t o p o i e t i cc e l lt r a n s p l a n t a t i o n[J]．B o n e M a r r o w T r a n sＧ
p l a n t,２０１５,５０(１):２６Ｇ３３．
[１９]华海应,高华强,朱文艳,等．W i l m s肿瘤基因在骨髓增生异常综合征与急性白血病病人骨髓细胞中的表达及其临床意义
[J]．江苏医药,２０１５,４１(２０):２３９４Ｇ２３９６．
[２０]赵娜,魏辉,王迎,等．WT１基因在急性髓系白血病微小残留病监测中的应用[J]．中华血液学杂志,２０１７,３８(８):６９５Ｇ６９９．[２１]WO E H L E C K E C,W I T T I G S,A R N D T C,e ta l．P r o g n o s t i c
i m p a c t o fWT１m R N Ae x p r e s s i o n p r i o r t oh e m s t o p o i e t i c s t e m
c e l l t r a n s p l a n t a t i o ni nc h i l
d r
e n w i t h m a l i g n a n th e m a t o l o g i c a l
d i s
e a s e s[J]．JC a n c e rR e sC l i nO n c o l,２０１５,１４１(３):５２３Ｇ５２９．
(本文编辑㊀厉建强)
６４４。