海水养殖贝类中四种常见微生物疾病研究概述

中国动物保健2022.02
科研动态
海水养殖贝类中四种常见微生物疾病研究概述
倪妍，王梦轩，王丽君，贺君，曲江勇，王绪敏，刘秀梅*
（烟台大学生命科学学院山东烟台264005
）
海水贝类养殖产业在海水养殖总产量中名列前茅。

在贝类养殖业不断发展的过程中，贝类常受到严重的病害影响，导致贝类养殖过程中发生大批的死亡，制约着贝类养殖业的发展。

在贝类的养殖中，常见的微生物疾病种类包括四类：细菌性、病毒性、真菌性、原核生物样微生物疾病。

本文分别对四类疾病中的典型疾病副溶血弧菌病、牡蛎疱疹病毒病、壳病以及立克次体样微生物导致的疾病进行介绍。

殖贝类；副溶血弧菌；牡蛎疱疹病毒；壳病；立克次体样微生物
近年来，海水养殖贝类的规模逐渐扩大，但由各种微生物疾病所致的贝类死亡，每年都造成重大的经济损失。

据统计，2001年福建安海湾南岸滩涂养殖的贝类发生大面积死亡。

其中泥蚶的养殖面积约为37.5hm 2，但死亡面积却高达26.67hm 2[1]。

1995年，仅长海县海水养殖的各种贝类死亡，直接经济损失达1亿元人民币[2]。

1989年七月下旬至八月初，庄河海洋村滩涂文蛤发生大规模死亡，仅几日文蛤损失200～300t ，折合人民币150万～200万元[3]。

从现有资料可知，大多数养殖贝类死亡都是由微生物性病原体引起的，特别是一些长期存在的或呈周期性暴发的流行性疾病。

其中常见的微生物性疾病种类包括如下：细菌性、病毒性、真菌性和原核生物样微生物疾病。

1细菌性疾病——
—副溶血弧菌病副溶血弧菌病，作为养殖贝类中最常见的致病性弧菌病，其致病菌副溶血弧菌是一种革兰氏阴性嗜盐无芽孢细菌，天然存在于
沿海水域，是海产品携带细菌性疾病的主要来源，会导致养殖贝类的大批死亡，如：副溶血弧菌病导致广西沿海文蛤大规模死亡[4]；
鲍鱼感染副溶血弧菌病时会出现萎凋综合征的症状（图1）[5]。

温度、
盐度都会对副溶血弧菌产生影响，如：当温度在≤5℃时可以控制浙生牡蛎中副溶血弧菌的危害[6]；感染了副溶血弧菌的牡蛎分别被转移到高盐度和中等盐度中，发现与中等盐度相比，高盐度可使副溶血性弧菌在牡蛎中的总密度和致病性密度降低[7]。

江海洋等[8]对海水检出副溶血弧菌量与海水相关指标进行多因素回归分析，回归方程为：Ｙ海水弧菌＝0.240×盐度+0.050×表面水温-5.841，表明海水的表面温度和盐度是影响海水中副溶血弧菌含量的主要因素。

抗生素疗法是控制副溶血性弧菌等弧菌属成员引起的感染的主要治疗方法，而抗生素耐药性可能是针对这些病原体治疗的一
个严重问题。

由于贝类养殖产业的迅猛发展，副溶血弧菌病的暴发日趋严重，但近年来为了防治这种养殖病害大量地使用抗生素，使得副溶血弧菌的耐药种类变得越来越多。

将佐治亚州和南卡罗来纳州大西洋沿岸的水和沉积物中分离出的副溶血性弧菌进行了24种抗生素的敏感性测试，24%的分离株对10种或更多的药物表现出抗药性，很大一部分分离株对不同的β-内酰胺类、氨基糖苷类和其他类抗生素具有耐药性[9]。

副溶血弧菌病不仅对贝类养殖产生影响，同时也会对人类的身体健康带来威胁。

人类接触副溶血性弧菌的主要途径是食用被该细菌污染的生的或未煮熟的贝类。

副溶血性弧菌致病菌株感染可引起急性胃肠炎，临床症状为腹泻、腹部痉挛、恶心、呕吐、头痛、发烧和发冷等症状[10]。

因此，研究贝类中的副溶血弧菌病对贝类养殖业和人体健康都有重要意义。

2病毒性疾病———牡蛎疱疹病毒病
1972年Farley [11]等在美国马里兰州的一批实验用养殖美洲牡蛎中首次发现疱疹病毒，这也是无脊椎动物感染疱疹病毒的首例。

在20世纪90年代末，中国北方养殖栉孔扇贝因感染牡蛎疱疹病毒（ostrei d herpesvirus-1,OsHV-1）暴发大规模死亡。

这种病害在其他国家也频繁发生，引起贝类的大规模死亡，成为近年来威胁全
球贝类养殖产业健康发展的主要疫病[12]。

OsHV-1属于软体疱疹病毒科，该病毒为正二十面体有囊膜的病毒，其组成从外到内依次是囊膜、核衣壳及双链DNA 形成的病毒核心，是牡蛎等双壳类的致死性病毒，对贝类幼虫及稚贝的致死率达40%～100%[13]。

OsHV-1病毒的感染部位广泛地分布于各器
基金项目：烟台市“双百计划”人才项目（2320004）；烟台大学拔尖人才项目（2219013）；山东省自然科学基金面上项目（ZR2020MD002）；烟台大学博士启动基金（2219008）；山东省大学生创新创业训练计划（S202011066014）
作者简介：倪妍，第一作者。

*通讯作者
doi:10.3969/j.issn.1008-4754.2022.02.069
图1患副溶血弧菌病的杂色鲍[5]
. All Rights Reserved.
官的结缔组织，如外套膜、鳃、性腺等。

截止目前，已在全球17个国家检测到OsHV-1，感染病例遍布于除非洲和南极洲之外的各大洲[12]。

该病毒已在世界范围内造成软体动物类群的大规模死亡，特别是在高温季节。

温度被认为是在牡蛎中引发OsHV-1流行病的最重要的环境因素之一。

Pernet等[14]发现与21℃相比，在13℃持续养殖的太平洋牡蛎幼体死亡率显著降低。

但OsHV-1在处于13℃的牡蛎体内持续培养几十天后，当温度上升到21℃时病毒又被重新激活。

当培养温度从29℃降至21℃时，OsHV-1的复制未能重新激活，与温度从13℃升至21℃时的结果相反，死亡率没有额外提升。

牡蛎在14℃没有感染OsHV-1疾病，在18℃比在22℃需要更高剂量的Os-HV-1才能引发病毒感染[15]。

在养殖方舟蛤中发现低温能有效地抑制OsHV-1在幼仔体内的复制，但不能根除OsHV-1[16]。

因此可以通过提高温度以降低牡蛎对OsHV-1的易感性。

OsHV-1感染的传统诊断可采用组织病理和透射电镜诊断技术。

在光镜下，若观察到样本的结缔组织中出现大量细胞浸润，成纤维细胞和血细胞出现染色质边集或核浓缩等现象，则为疑似Os-HV-1感染[12]。

图二为OsHV-1感染魁蚶细胞核中观察到的疱疹样病毒[12]。

现代诊断技术可采用基于PCR法的诊断[17]，目前常用的OsHV-1PCR检测法为使用C9/C10的SYBR Green法和使用OsHV1BF/B4引物及对应探针的TaqMan探针法[18]。

OsHV-1的检测方法还可以采用原位杂交技术，有由3对引物(A5/A6、C1/C6和C2/C6)扩增产生的3种大小相似的探针可供选择，引物的特定寡核苷酸序列见表1[19]。

3真菌性疾病——
—壳病
到目前为止，有关贝类真菌性的疾病报道还比较少，壳病的病原菌为绞扭伤壳菌（ostracoblabe implexa），系藻菌纲真菌[20]。

早在二十世纪50年代和70年代，人们先后从欧洲扁牡蛎病贝的病损部位分离出了这种海洋真菌。

该菌的菌丝上有卵形或球形的膨大体，膨大体肿胀形成多层厚壁，为厚壁孢子。

该菌无有性生殖，被归为藻状菌。

疾病的初期症状是菌丝体将壳穿孔，在闭壳肌上尤为严重，导致壳的内壁出现云雾状的白色区域。

随后白色区域会形成疣状突起，突起会高出壳面2～4mm，继而变成黑色、微棕色或淡绿色，严重的区域会出现大片的壳基质沉淀。

这种壳基质的沉淀程度与真菌的侵染强度有关。

在合浦珠母贝发生壳病时，会沉淀出含有不均匀碳酸钙的棕色沉积物（图3b）[21]。

该病的诊断方法可根据壳的病理变化做初步诊断，例如可通过取病灶在15℃培养3～4周能否得出相应菌丝来确诊。

该致病菌在持续处在温度高于22℃的状态下两周后，侵染程度会加重[20]。

4原核生物样微生物疾病——
—立克次体样微生物疾病
1997年首次发现了海洋贝类的立克次体样微生物（rickettsi-a-like organisms,RLO）。

立克次体是专门寄生于真核细胞内部的革兰氏阴性的一类原核微生物。

立克次体侵入器官组织后，可引起细胞的肿胀、增生甚至坏死，导致微循环障碍。

贝类的高死亡率与该病息息相关，如山东沿海栉孔扇贝1998年以来发生大规模的死亡可能是因为感染了立克次氏体[22]。

此外，南方海区杂色鲍的溃疡病及北方皱纹盘鲍的死亡也与立克次氏体有关[23]。

我国目前已明确的有三种立克次氏体种类。

它们主要会导致贝类多个器官组织的病损，造成贝类大片组织细胞坏死，从而引起贝类群体高死亡率。

1983年Morrison等[24]在扇贝的肾脏上皮细胞发现碱性包涵体（图4），这些细胞中有许多含有结核的空泡。

立克次氏体显然是在宿主细胞质中单独的膜限制液泡中发育的，并二次分裂繁殖以填充大部分宿主细胞，导致宿主细胞被破坏，立克次体得以进入到肾腔内。

这些立克次体或多或少呈圆形，中央核区密度较低，内含细丝，可能是DNA。

周边充满核糖体样颗粒，通常在立克次体中心有一个电子致密的颗粒状核团，每个立克次体由两个三层的膜包围。

RLO是珍珠贝最严重的流行病，可使幼虫或幼苗的死亡率高达97%[25]。

患病大珍珠母贝的外套膜表皮细胞以及肝胰腺腺上皮
细胞图3正常和患病的合浦珠母贝[21]
（a）正常的合浦珠母贝，P为棱柱层；N为珍珠层（b）患病的合浦珠母
贝
图2OsHV-1感染魁蚶细胞核中观察到的疱疹样病毒[12]
白箭头：空衣壳；黑箭头：核衣壳
C15′TTCCCCTCGAGCTAGTTTT 3′
C65′GTGCACGGCTTACCATTTTT 3′
表1 OsHV-1的特定检测引物
111
. All Rights Reserved.
中国动物保健2022.02
科研动态
的细胞核核膜溶解破裂，会形成明显的核浓缩，在病变细胞的细胞核中会出现核仁的消失，其各种细胞器如线粒体、内质网、溶酶体等都会出现明显的病理改变。

贝类立克次体的传统检测方法为在光学显微镜下观察，可见嗜碱性包涵体，HE 染色包涵体呈不同程度的兰色或兰紫色，内部可见嗜碱性颗粒。

也可用现代生物学的监测方法，如Mialhe [26]从海湾扇贝鳃中分离纯化立克次体及制备单克隆抗体，为病原菌的特异性诊断提供了一种有效的方法。

Antonio 等[27]制备了地高辛标记的分子探针，并应用原位杂交技术可对早期感染的立克次体致黑鲍鱼萎缩病进行诊断。

Le Gall 等[28]采用立克次体鼠抗血清对不同地区扇贝个体病原菌进行了检测。

5结语
近几年贝类养殖的面积大范围增加，贝类的死亡率亦明显上升，养殖贝类的大规模死亡已经成为一个严重的问题。

贝类死亡的原因大致归类于细菌性、病毒性、真菌性和原核生物样微生物疾病四类，今后有必要在病原生物学、宿主范围、感染的组织病理学变化等方面进行更深入的研究，以便对此类生物的流行病学有更全面的了解，尽量避免可能的危害，减少经济损失。

█
参考文献：
[1]阮金山,李秀珠,林克冰,等.安海湾南岸滩涂养殖贝类死亡原因调查分析[J].福建水产,2005(4):27-30.
[2]梁玉波,杨波,王立俊,等.辽宁黄海沿岸水域增养殖贝类病害发生机理和防治对策[J].海洋环境科学,2000(1):5-10.
[3]韩家波,薛克,吕建发,等.辽宁沿海滩涂贝类死亡调查[J].水产科学,1994(6):12-13.
[4]刘军义.广西沿海文蛤及其生境中细菌类群的初步调查[J].水产科技情报,1996,23(2):80-83.
[5]Liu P C,Chen Y C,Huang C Y,et al.Virulence of Vibrio para-haemolyticus isolated from cultured small abalone,Haliotis diversi-color supertexta ,with withering syndrome [J].Letters in Applied Mi-crobiology,2000,31(6):433-437.
[6]Shen X S,Cai Y Q,Liu C C,et al.Effect of temperature on uptake and survival of Vibrio parahaemolyticus in oysters (Cras-sostrea pli-catula)[J].International Journal of Food Microbiolo-Gy,2009,136(1):129-132．
[7]Parveen ,Jahncke M,Elmahdi S,et al.High salinity relaying to re-duce Vibrio parahaemolyticus and Vibrio vulnificus in Chesapeake
bay oysters (Crassostrea virginica)[J].Journal of Food Science,2017,82(2):482-491.
[8]江海洋,李磊,莫宝庆,等.贝类污染副溶血性弧菌与海水水质相关性研究[J].中国卫生检验杂志,2008,18(12):2502-2504.
[9]Baker-austin C,Mcarthur J V,Tuckfield R C,et al.Antibiotic resis-tance in the shellfish pathogen Vibrio parahaemo-lyticus isolated from the coastal water and sediment of Georgia and South Caroli-na,USA[J].Journal of Food Protection,2008,71(12):2552-2558．
[10]Baker-Austin C,Trinanes J,Gonzalez-Escalona N,et al.Non-Choler-a Vibrios:The Microbial Barometer of Climate Change [J].Trends in Microbiology,2017,25(1):76-84.
[11]Farley C A,Banfield W G,Kasnic-Jr G,et al.Oyster herpes-type virus[J].Science,1972,178(4062):759-760.
[12]白昌明,辛鲁生,王崇明.软体动物疱疹病毒及其对贝类养殖产业的危害[J].渔业科学进展,2021,42(1):214-226.
[13]胡宗福,任绍杰,李树国.牡蛎疱疹病毒(OsHV-1)研究进展[J].水产科技情报,2017,44(5):259-264+267.
[14]Pernet F,Tamayo D,Petton B.Influence of low temperatures on the survival of the Pacific oyster (Crassostrea gigas )infected with ostreid herpes virus type 1[J].Aquaculture,2015(445):57-62.
[15]Kantzow M D,Hick P,Becker J A,et al .Effect of water tempera-ture on mortality of Pacific oysters Crassostrea gigas associated with microvariant ostreid herpesvirus 1(OsHV-1μVar)[J].Aquaculture En-vironment Interactions,2015(8):419-428.
[16]Xin S H,Wei Z X,Bai C M,et al.Influence of temperature on the pathogenicity of Ostreid herpesvirus-1in ark clam,Scapharca broughtonii[J].Journal of Invertebrate Pathology,2020(169).
[17]Renault T,Arzul I.Herpes-like virus infections in hatchery reared bi-valve larvae in Europe:Specific viral DNA detection by PCR[J].Jour-nal of Fish Diseases,2001,24(3):161-167.
[18]Martenot C,Oden E,Travaill éE,et parison of two re-al-time PCR methods for detection of Ostreid herpesvirus 1in the Pa-cific oyster Crassostrea gigas [J].Journal of Virological Methods,2010,170(1-2):86-89.
[19]Lipart C,Renault T.Herpes-like virus detection in infected Cras-sostrea gigas spat using DIG-labelled probes [J].Journal of Virologi-cal Methods,2002,101(1):1-10.
[20]陈皓文,陈阳.牡蛎的微生物疾病[J].水产科学,2007(9):531-534.
[21]Huang J L,Liu C,Xie L P,et al.Amorphous calcium carbonate:A precursor phase for aragonite in shell disease of the pearl oyster[J].Biochemical and Biophysical Research Communications,2018,497(1):102-107.
[22]王运涛,相建海.栉孔扇贝大规模死亡的原因探讨[J].海洋与湖沼,1999(6):770-774.
[23]陆彤霞,王国良,尤仲杰,等.我国海洋养殖贝类病害研究概况及防治对策[J].浙江海洋学院学报:自然科学版,2002(2):154-159.
[24]Morrison C,Shum G.Rickettsias in the kidney of the bay scallop,Argopecten irradians (Lamarck)[J].Journal of Fish Diseases,1983,6(6):537-541.
[25]王斌,王翔,王莉明.我国主要养殖贝类微生物性疾病研究进展[J].海洋环境科学,2002(3):76-80.
[26]Mialhe E,Viviane B ,Henri G ,et al.Monoclonal antibodies:a tool for molluscan pathology [J].American Fisheries Society Special Publi-cation,1988:310-315.
[27]Antonio D B,Andree K B,Moore J D,et al ．Detection of Rick-ettsiales-like Prokaryotes by in Situ Hybridization in Black Abalone,Haliotis cracherodii,with withering Syndrome [J].Journal Invertebrate Pathology,2000,75(2):180-182.
[28]Gyslaine L G ,Eric M .Purification of Rickettsiales-like organisms associated with Pecten maximus (Mollusca:Bivalvia):Serological and biochemical characterization [J].Diseases of Aquatic Organ-isms,1992,12(3):215-220.
图4海湾扇贝肾脏上皮细胞中的碱性包涵体[24]
. All Rights Reserved.。