定量核磁共振波谱法测定葡萄糖酸钙原料药的绝对含量

中国医药生物技术2020年2月第15卷第1期Chin Med Biotechnol, February 2020, V ol. 15, No. 1 71 DOI: 10.3969/j.issn.1673-713X.2020.01.014·
技术与方法·定量核磁共振波谱法测定葡萄糖酸钙
原料药的绝对含量
李怡然，朱明慧，朱志玲，姚静，山广志
葡萄糖酸钙作为临床常用药物，主要起降低毛细血管渗透性的作用。

适用于过敏性皮肤病，如荨麻疹、湿疹、皮肤瘙痒症、接触性皮炎等。

作为产后出血的辅助用药使用，能够减少心血管不良反应[1-3]，同时也是一种膳食补充剂，用于儿童、孕妇、老年人钙的补充[4]。

葡萄糖酸钙的制备方法有电解氧化法、溴化法、金属催化合成法、发酵法等。

发酵法因工艺稳定，成本低廉，被多数厂家应用。

发酵法是以黑曲霉为生产菌种，经菌种逐级培养，发酵代谢的酶将葡萄糖氧化生成葡萄糖酸，再经碳酸钙中和精制而成[5]。

《中国药典》2015 年版采用EDTA 滴定法测定葡萄糖酸钙制剂中钙的含量[6]，对葡萄糖酸基仅采用鉴别反应进行考察，未对其含量进行控制。

有文献采用HPLC 法[7]或离子色谱法[8]测定葡萄糖酸钙的含量，但由于葡萄糖酸在水溶液中存在糖酸和内酯的转化，容易造成测量误差。

自1963 年qNMR 法[9]应用于定量分析以来，其应用范围日益广泛，各国药典均收载了该方法。

qNMR 技术的优势在于不需要对照品，仅以已知含量的核磁对照品作为内标，扫描待测物的共振峰面积直接计算H 的个数，对化合物进行绝对含量的测定[10]，适用于无对照品原料药的首次定量。

本文采用qNMR 技术，利用无水氘代溶剂，排除了水分和残留溶剂及其他无机物干扰，准确测定了葡萄糖酸钙原料的绝对含量。

1 材料与方法
1.1 仪器与试剂
Bruker Avance III HD 600 MHz 核磁共振波谱仪（BBO 探头）购自德国布鲁克公司；Mettler Toledo MS105 电子分析天平购自瑞士梅特勒-托利多公司；氘代DMSO（批号：PR-28072/07206DM1）购自美国Cambridge Isotope Laboratories 公司；葡萄糖酸钙（批号：LC80Q34）购自北京百灵威科技有限公司；顺丁烯二酸（批号：BCBM8127V，NMR对照品级，纯度：99.94%）购自美国Sigma-Aldrich 公司。

1.2 方法
1.2.1 供试品溶液的制备精密称取葡萄糖酸钙和内标物顺丁烯二酸各10 mg，置离心管中，加入 1 ml 氘代DMSO，超声5 min 使全部溶解，取0.6 ml 置5 mm核磁管中备用。

1.2.2实验方法采用600 MHz 核磁共振波谱仪，探头为BBO，软件为Topspin3.6.0。

实验温度T = 25℃；弛豫时间D1 = 20 s；采集时间AQ = 2 s；采集次数NS = 32 次；脉冲序列为zg30。

1.2.3 计算方法核磁共振波谱法采用绝对定量的方式，本试验采用顺丁烯二酸作为内标，直接检测葡萄糖酸钙的含量，计算公式[11]如下：
A1n1m1n1W1/M1
A2
=
n2m2
=
n2W2/M2
式中m1、m2分别为化合物1 和化合物2 的分子个数；n1、n2分别为相应官能团中的质子数；W1、W2分别为其质量；M1、M2分别为其分子量。

2 结果
2.1 方法的选择
2.1.1溶剂的选择葡萄糖酸钙易溶于水，但实验发现葡萄糖酸钙在水中形成葡萄糖酸钙和葡萄糖内酯的混合物。

本试验选用氘代DMSO 作为溶剂，使葡萄糖酸钙保持稳定状态（图1）。

2.1.2 内标物的选择内标应有较高的纯度，含有多个质子。

顺丁烯二酸理化性质稳定，不与溶剂和待测物反应，在1H-NMR 谱图中仅存在一组共振峰，是选用较多的定量核磁内标物质。

选取该物质 2 个烯质子的单峰为定量峰，该峰的化学位移（δ = 6.2），与葡萄糖酸钙共振峰之间无干扰（图2）。

2.1.3定量峰的选择葡萄糖酸钙化学位移归属见表1，本试验选择葡萄糖酸钙上δ =
3.9 处的双二重峰为定量峰，该峰与其他峰完全分离，不受其他峰干扰。

2.1.4 弛豫时间通常延迟弛豫时间不小于T1 的5 倍。

通过反转恢复实验对所有质子的共振谱线的T1 值分别进行测试，最大纵向弛豫时间为
3.95 s，因此实验选择D1 为20 s。

基金项目：十三五国家科技重大专项“重大新药创制”（2017ZX 09101001、2018ZX09711001）；中国医学科学院医学与健康科技创新工程系统创新团队基金（2016-12M-3-010）
作者单位：100050 北京，中国医学科学院北京协和医学院医药生物技术研究所分析测试中心（李怡然、朱明慧、朱志玲、山广志）；100050 北京，中国食品药品检定研究院抗肿瘤与放射药品室（姚静）
通信作者：姚静，Email：yaojh@；山广志，Email：shanguangzhi@
收稿日期：2019-09-16
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A
B
C
图 1葡萄糖酸钙和葡萄糖内酯在水中相互转换示意图[A：葡萄糖内酯（DMSO）；B：葡萄糖酸钙（DMSO）；C：葡萄糖酸钙（DMSO + H2O）]
图 2供试品氢谱
表 1化学位移归属
化学位移（δ）归属质子数裂分/耦合常数
6.2 顺丁烯二酸1,2-CH 2 s
5.1 葡萄糖酸钙6-OH 2 -
4.5 葡萄糖酸钙4-CH 2 -
4.1 葡萄糖酸钙2-CH 2 d J = 3.7 Hz
3.9 葡萄糖酸钙2-OH 2 dd J = 3.1,3.1 Hz
3.6 葡萄糖酸钙3-CH2,5,6-CH 8 m
3.4 葡萄糖酸钙5-CH,5-OH 4 m
2.5 DMSO 5
2.1.5扫描次数设置扫描次数分别为8、16、32、64 次
进行试验，为了满足信噪比的要求（S/N ≥ 250），本实验扫
描次数设置为32 次。

2.2 方法学验证
2.2.1精密度试验取供试品溶液，连续测定 6 次，对葡
萄糖酸钙δ = 3.9 处共振峰和顺丁烯二酸δ = 6.2 处共振峰
分别进行积分，计算定量峰与内标峰面积的比值。

6 次测定
结果的相对标准偏差为0.46%，方法精密度良好。

2.2.2重复性试验制备葡萄糖酸钙供试品溶液 6 份，分
别测定核磁共振氢谱，计算葡萄糖酸钙的含量。

6 次测定结
果的平均值为99.47%，RSD = 0.43%，方法的重复性良好
（表2）。

2.2.3稳定性试验制备葡萄糖酸钙供试品溶液，分别在
室温放置0、2、4、8 h 后进行测定，计算样品和内标定量
峰面积比值。

4 次测定结果的相对标准偏差为0.63%，表明
该样品在室温条件下8 h 内保持稳定。

2.2.4 线性方程精密称取葡萄糖酸钙8.20、10.07、
12.64、13.75、16.23 mg，内标称样量约为10 mg，依法测
定。

以葡萄糖酸钙与内标的质量比（X）为横坐标，以葡萄
糖酸钙与内标定量峰面积的比值（Y）为纵坐标，进行线性
回归，得回归方程Y = 0.2933X – 0.0246，相关系数r=
0.9997（n = 5）。

结果表明，当内标物质量为10 mg 时，葡
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表 2含量测定
样品积分峰内标H 数样品量（mg）内标量（mg）含量（%）平均含量（%）RSD
1 0.5338
2 10.94 11.04 99.81
2 0.5364 2 10.60 10.58 99.20
3 0.573
4 2 10.47 9.83 99.75
4 0.5530 2 9.88 9.60 99.56
5 0.5518 2 10.38 10.13 99.78
6 0.5555 2 10.5
7 10.14 98.74
99.47 ± 0.43 0.43
萄糖酸钙在8.20 ~ 16.23 mg 范围内线性关系良好。

2.3 定量结果
利用质量平衡法[12]按下式计算葡萄糖酸钙的含量。

含量=（100% – 干燥失重）× HPLC 纯度× 100%
该样品干燥失重结果为0.37%，HPLC 纯度为99.96%，质量平衡法测得含量为99.60%，与核磁定量结果（99.47%）一致。

3 讨论
本实验优化了1H-NMR 测定条件，选取氘代DMSO 作为溶剂，以顺丁烯二酸为内标，建立了葡萄糖酸钙绝对含量测定方法。

研究结果表明，葡萄糖酸钙的qNMR 法测定与质量平衡法定值结果基本一致。

qNMR 方法所需样品量少，不需要特定对照品，避免原料中未知成分对测定的干扰。

采用qNMR 法对该化合物进行含量测定，操作简便，方法专属、快速、可靠，结果准确。

随着核磁技术发展和新式探头的出现，计算机和软件的升级换代，定量核磁共振波谱技术将在药物质量评价领域提供更广泛的应用。

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