高效液相色谱-分段检测法同时测定烟草中14种多酚类化合物
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ｍｅｔｈｏｄ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ａｐｐｌｉｅｄ ｔｏ ｔｈｅ ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｖａｒｉｅｔｙ ｏｆ ｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌｓ ｉｎ ｔｏｂａｃｃｏ ａｎｄ
ｃｉｇａｒｅｔｔｅｓ ｗｉｔｈ ｇｏｏｄ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙꎬ ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｃｏｖｅｒｙ.
豆素( 纯度 ９９ ５％ ꎬ 美国 ＣｈｅｍＳｅｒｖｉｃｅ 公司) 、 芦丁( 三水合物ꎬ 纯度 ９６ ６％ ꎬ 德国 Ｄｒ Ｅｈｒｅｎｓｔｏｒｆｅｒ 公
司) 、 槲皮素( 二水合物ꎬ 纯度 ９７ ０％ ꎬ 德国 ＨＷＩ Ａｎａｌｙｔｉｋ ＧＭＢＨ 公司) ꎻ 甲醇( 纯度 ９９ ９％ ꎬ 色谱纯ꎬ
４１２
芸香苷和莨菪亭是烟草中最主要的酚类物质ꎬ 绿原酸占总多酚的 ７５％ ~ ９５％
质的前体物
第 ４０ 卷
分析测试学报
[３ － ４]
[２]
ꎬ 其为烟草特征香味物
ꎮ 其他含量低的多酚类化合物在烟草品质鉴定与改善方面也有辅助影响ꎮ 另一方面ꎬ
卷烟烟气中含有的简单酚( 如儿茶酚、 对苯二酚等二羟基苯化合物) [５] 也属于多酚ꎬ 对卷烟烟气有害成
烟草中有些多酚的分子量较大且不易挥发ꎬ 常采用高效液相色谱( ＨＰＬＣ) 进行测定ꎬ 检测器多选择
紫外检测器( ＵＶ) 、 二极管阵列检测器( ＤＡＤ) 或三重四极杆质谱仪( ＭＳ / ＭＳ) [１３ － １６] ꎮ 其中ꎬ ＵＶ 检测器
的灵敏度较好ꎬ 但无法灵活地实现多个化合物在不同波段下的检测ꎻ ＨＰＬＣ － ＭＳ / ＭＳ 法的灵敏度高ꎬ
但需使用同位素内标ꎬ 提高了实验成本ꎻ ＨＰＬＣ － ＤＡＤ 法的实验成本较低ꎬ 且便于在各化合物的较大吸
收处进行检测ꎬ 获得较佳的检测灵敏度ꎮ
国内外应用 ＨＰＬＣ 检测烟草中多酚类物质已多有报道ꎬ 检测指标以绿原酸、 芸香苷和莨菪亭等含
量高的多酚化合物为主 [１７ － １８] ꎮ 近几年报道的方法逐步将新绿原酸、 隐绿原酸、 七叶亭、 咖啡酸、 山奈
法ꎬ 为同时检测烟叶中多种多酚类化合物提供方法参考ꎮ
１ 实验部分
１ １ 仪器与试剂
Ａｇｉｌｅｎｔ １２００ 高效液相色谱仪、 Ａｇｉｌｅｎｔ ＳＢ － Ｃ１８ 柱(３ ０ ｍｍ × １５０ ｍｍ × １ ８ μｍꎬ 美国 Ａｇｉｌｅｎｔ 公司) ꎻ
ＢＴ２５Ｓ 电子天平( 感量: ０ ０１ ｍｇꎬ 最大量程: ２１ ｇꎬ 德国赛多利斯科学仪器有限公司) ꎮ
隐绿原酸、 东莨菪苷、 咖啡酸、 七叶亭、 对香豆酸、 阿魏酸、 莨菪亭、 ７￣羟基香豆素、 芦丁、 槲皮苷、 山奈
酚￣３￣Ｏ￣芸香糖苷和槲皮素 １４ 种多酚化合物的方法ꎮ 称取 ０ ０２ ｇ 烟末ꎬ 加入 ５ ｍＬ ５０％ 甲醇ꎬ 超声萃取 ３０
ｍｉｎꎬ 取上清液过水相滤膜后ꎬ 采用 Ａｇｉｌｅｎｔ ＳＢ － Ｃ１８ 柱(３ ０ ｍｍ × １５０ ｍｍꎬ １ ８ μｍ) 进行分离ꎬ 以 ０ ０５ ｍｏｌ / Ｌ
槲皮苷( 纯度 ９６ ０％ ) 、 山奈酚￣３￣Ｏ￣芸香糖苷( 纯度≥９８ ０％ ) ( 美国 Ｓｉｇｍａ － Ａｌｄｒｉｃｈ 公司) ꎻ 东莨菪苷
( 纯度 ９９ ８％ ꎬ 美国 Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ 公司) ꎻ 阿魏酸( 纯度 ９８ ０％ ꎬ 加拿大 ＴＲＣ 公司) 、 ７￣羟基香
０ ７０％ ~ ３ ６％ ꎬ 日间 ＲＳＤ 为 ４ ０％ ~ ６ ４％ ꎬ 加标回收率为 ９５ ２％ ~ １０９％ ꎮ 该方法具有良好的灵敏度、 精密
度和回收率ꎬ 适合于烟草样品中多种多酚类化合物的同时测定ꎮ
关键词: 高效液相色谱ꎻ 二极管阵列检测器ꎻ 分段检测ꎻ 烟草ꎻ 多酚
中图分类号: Ｏ６５７ ７ꎻ ＴＳ４１ 文献标识码: Ａ 文章编号: １００４ － ４９５７(２０２１)０３ － ０４１１ － ０６
磷酸二氢钾水溶液和甲醇为流动相ꎬ 采用分段式检测ꎬ 获得 １４ 种多酚类化合物在各自最佳检测波长下的信
号ꎬ 实现了良好分离ꎮ 结果表明ꎬ １４ 种多酚类化合物的色谱峰面积与其质量浓度呈良好的线性关系ꎬ 相关系
数 ｒ２ > ０ ９９９ ７ꎬ 检出限为 ０ ０１ ~ ０ １５ μｇ / ｍＬꎬ 定量下限为 ０ ０３ ~ ０ ５０ μｇ / ｍＬꎬ 日内相对标准偏差( ＲＳＤ) 为
高效液相色谱 － 分段检测法同时测定烟草中
１４ 种多酚类化合物
欧阳璐斯ꎬ 赖燕华ꎬ 王 予ꎬ 陶 红ꎬ 黄翼飞 ∗
( 广东中烟工业有限责任公司技术中心ꎬ 广东 广州 ５１０３８５)
摘 要: 利用高效液相色谱 － 二极管阵列检测器( ＨＰＬＣ － ＤＡＤ) ꎬ 建立了同时分析烟草中新绿原酸、 绿原酸、
ｒｕｒｉｃ ａｃｉｄꎬ ｓｃｏｐｏｌｅｔｉｎꎬ ７￣ｈｙｄｒｏｘｙｃｏｕｍａｒｉｎꎬ ｒｕｔｉｎꎬ ｑｕｅｒｃｉｔｒｉｎꎬ ｋａｅｍｐｆｅｒｏｌ ３￣Ｏ￣β￣ｒｕｔｉｎｏｓｉｄｅ ａｎｄ
ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ. ０ ０２ ｇ ｔｏｂａｃｃｏ ｐｏｗｄｅｒ ｓａｍｐｌｅ ｗａｓ ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃａｌｌｙ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ｗｉｔｈ ５ ｍＬ ｏｆ ５０％ ｍｅｔｈａｎｏｌ ｆｏｒ
第 ４０ 卷 第 ３ 期
分析测试学报
Ｖｏｌ ４０ Ｎｏ ３
２０２１ 年 ３ 月
ＦＥＮＸＩ ＣＥＳＨＩ ＸＵＥＢＡＯ( Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ)
４１１ ~ ４１６
ｄｏｉ: １０ ３９６９ / ｊ ｉｓｓｎ １００４ － ４９５７ ２０２１ ０３ ０１８
Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ Ｆｏｕｒｔｅｅｎ Ｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌｓ ｉｎ Ｔｏｂａｃｃｏ ｂｙ Ｐｉｅｃｅｗｉｓｅ
Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｂａｓｅｄ ｏｎ Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ
ＯＵＹＡＮＧ Ｌｕ￣ｓｉꎬ ＬＡＩ Ｙａｎ￣ｈｕａꎬ ＷＡＮＧ Ｙｕꎬ ＴＡＯ Ｈｏｎｇꎬ ＨＵＡＮＧ Ｙｉ￣ｆｅｉ ∗
酚￣３￣芸香糖等作为分析指标ꎬ 但仍有一些质量分数较低的多酚类物质被忽略ꎮ 由于烟草中某些多酚化
合物含量低ꎬ 易受其他物质干扰ꎬ 因此选择各目标物的最大吸收波长作为ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ测波长ꎮ ＤＡＤ 检测器可实
现多个化合物在不同波段下的检测ꎬ 而且可以更直观地呈现各目标物在最佳检测波长下的色谱峰ꎬ 大
大提高工作效率ꎮ 本研究采用 ＨＰＬＣ － ＤＡＤ 分段式检测建立了烟草中 １４ 种多酚类物质的同时测定方
ｍＬꎬ ｗｈｉｌｅ ｔｈｅ ｉｎｔｒａ￣ｄａｙ ａｎｄ ｉｎｔｅｒ￣ｄａｙ ｒｅｌａｔｉｖｅ ｓｔａｎｄａｒｄ ｄｅｖｉａｔｉｏｎｓ( ＲＳＤ) ｗｅｒｅ ０ ７０％ － ３ ６％ ａｎｄ
４ ０％ － ６ ４％ ꎬ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ. Ｔｈｅ ｓｐｉｋｅｄ ｒｅｃｏｖｅｒｉｅｓ ｒａｎｇｅｄ ｆｒｏｍ ９５ ２％ ｔｏ １０９％ . Ｔｈｅ ｐｒｏｐｏｓｅｄ
量瓶中ꎬ 用水稀释至刻度ꎬ 作为系列混合标准溶液ꎮ
１ ３ 样品处理
准确称取 ０ ０２ ｇ 烟末( 精确至 ０ ０００ １ ｇ) ꎬ 置于 １０ ｍＬ 具塞玻璃管中ꎬ 加入 ５ ｍＬ ５０％ 甲醇ꎬ 超声
新绿原酸( 纯度 ９９ ２％ ) 、 隐绿原酸( 纯度 ９９ ５％ ) ( 德国 Ｐｈｙｔｏｌａｂ 公司) ꎻ 绿原酸( 纯度≥９５ ０％ ) 、
咖啡酸( 纯度 ９８ ０％ ) 、 七叶亭( 纯度 ９８ ０％ ) 、 对香豆酸( 纯度≥９８ ０％ ) 、 莨菪亭( 纯度≥９９ ０％ ) 、
( Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｅｎｔｒｅꎬ Ｃｈｉｎａ Ｔｏｂａｃｃｏ Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｃｏ. Ｌｔｄ. ꎬ Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ ５１０３８５ꎬ Ｃｈｉｎａ)
Ａｂｓｔｒａｃｔ: Ａ ｈｉｇｈ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｗｉｔｈ ｄｉｏｄｅ ａｒｒａｙ ｄｅｔｅｃｔｏｒ( ＨＰＬＣ － ＤＡＤ) ｗａｓ
ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ １４ ｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌｓꎬ ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｎｅｏｃｈｌｏｒｏｇｅｎｉｃ ａｃｉｄꎬ
ｃｈｌｏｒｏｇｅｎｉｃ ａｃｉｄꎬ ｃｒｙｐｔｏｃｈｌｏｒｏｇｅｎｉｃ ａｃｉｄꎬ ｓｃｏｐｏｌｉｎꎬ ｃａｆｆｅｉｃ ａｃｉｄꎬ ｅｓｃｕｌｅｔｉｎꎬ ｐ￣ｃｏｕｍａｒｉｃ ａｃｉｄꎬ ｆｅｒ￣
ｍｍ × １５０ ｍｍꎬ １ ８ μｍ) ꎬ ｗｉｔｈ ０ ０５ ｍｏｌ / Ｌ ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｄｉｈｙｄｒｏｇｅｎ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ａｑｕｅｏｕｓ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ａｎｄ
ｍｅｔｈａｎｏｌ ａｓ ｍｏｂｉｌｅ ｐｈａｓｅｓ. Ｔｈｅｒｅ ｅｘｉｓｔｅｄ ｇｏｏｄ ｌｉｎｅａｒ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ ｂｅｔｗｅｅｎ ｐｅａｋ ａｒｅａｓ ａｎｄ ｍａｓｓ ｃｏｎ￣
２０ ｍｇ 咖啡酸、 ３３ ｍｇ 莨菪亭、 ４５０ ｍｇ 芦丁、 ２０ ｍｇ 山奈酚￣３￣Ｏ￣芸香糖苷以及 １０ ｍｇ 的七叶亭、 对香豆
酸、 阿魏酸、 槲皮苷、 ７￣羟基香豆素和槲皮素ꎬ 置于 ５０ ｍＬ 棕色容量瓶中ꎬ 加入 ５０％ 甲醇溶解并定容
至刻度ꎬ 作为混合标准储备液ꎮ
系列混合标准溶液: 分别准确移取 ５０、 １００、 ２００、 ４００、 ８００ μＬ 混合标准储备液至 １００ ｍＬ 棕色容
德国 Ｍｅｒｃｋ ＫＧａＡ 公司) ꎻ 磷酸二氢钾( 美国 Ａｌａｄｄｉｎ 试剂公司) ꎻ Ｍｉｌｌｉ￣Ｑ 超纯水( 由 Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ 超纯水机
制备) ꎮ
１ ２ 溶液配制
混合标准储备液: 称量约 １２０ ｍｇ 新绿原酸、 ８００ ｍｇ 绿原酸、 １８０ ｍｇ 隐绿原酸、 １００ ｍｇ 东莨菪苷、
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ: ｈｉｇｈ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙꎻ ｄｉｏｄｅ ａｒｒａｙ ｄｅｔｅｃｔｏｒꎻ ｐｉｅｃｅｗｉｓｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎꎻ
ｔｏｂａｃｃｏꎻ ｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌｓ
多酚是烟草中一类重要的化合物ꎬ 含量高达 ５％
[１]
ꎮ 多酚类物质在烟草中以糖苷和酯的形式存在ꎬ
ｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｔｈｅ ａｎａｌｙｔｅｓꎬ ｗｉｔｈ ｔｈｅｉｒ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔｓ( ｒ２ ) ｌａｒｇｅｒ ｔｈａｎ ０ ９９９ ７. Ｔｈｅ ｌｉｍｉｔｓ ｏｆ
ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｌｉｍｉｔｓ ｏｆ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ ｗｅｒｅ ｉｎ ｔｈｅ ｒａｎｇｅｓ ｏｆ ０ ０１ － ０ １５ μｇ / ｍＬ ａｎｄ ０ ０３ － ０ ５０ μｇ /
主要分为单宁类( 绿原酸) 、 香豆素类( 莨菪灵、 莨菪亭、 七叶亭) 和黄酮类( 芸香苷) 等ꎬ 其中绿原酸、
收稿日期: ２０２０ － ０６ － ３０ꎻ 修回日期: ２０２０ － ０８ － ０３
基金项目: 广东中烟工业有限责任公司资助项目( 粤烟工 [２０１７] 科字第 ９ 号)
∗通讯作者: 黄翼飞ꎬ 硕士ꎬ 高级工程师ꎬ 研究方向: 烟草化学ꎬ Ｅ － ｍａｉｌ: ｈｕａｎｇｙｆ＠ ｇｄｚｙｇｙ ｃｏｍ
分释放量有显著影响ꎮ 多酚化合物含量受烟叶的种类、 成熟度和加工方法等因素的影响 [６] ꎮ 因此ꎬ 多
酚化合物 对 烟 草 的 生 长 发 育、 调 制 特 性、 烟 叶 色 泽、 烟 气 香 吃 味 和 烟 气 生 理 强 度 等 起 着 重 要 作
用 [７ － １２] ꎮ 烟草多酚类物质的准确测定ꎬ 对评价烟草品质、 指导卷烟配方设计具有重要意义ꎮ
３０ ｍｉｎꎬ ａｎｄ ｔｈｅｎ ｔｈｅ ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ ｗａｓ ｐｕｔ ｔｏ ｐａｓｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ａｎ ａｑｕｅｏｕｓ ｐｈａｓｅ ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ ｍｅｍｂｒａｎｅ. １４
ｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌｓ ｗｅｒｅ ｓｅｐａｒａｔｅｄ ａｔ ｔｈｅｉｒ ｏｐｔｉｍａｌ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈｓ ｏｎ ａｎ Ａｇｉｌｅｎｔ ＳＢ － Ｃ１８ ｃｏｌｕｍｎ(３ ０
ｃｉｇａｒｅｔｔｅｓ ｗｉｔｈ ｇｏｏｄ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙꎬ ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｃｏｖｅｒｙ.
豆素( 纯度 ９９ ５％ ꎬ 美国 ＣｈｅｍＳｅｒｖｉｃｅ 公司) 、 芦丁( 三水合物ꎬ 纯度 ９６ ６％ ꎬ 德国 Ｄｒ Ｅｈｒｅｎｓｔｏｒｆｅｒ 公
司) 、 槲皮素( 二水合物ꎬ 纯度 ９７ ０％ ꎬ 德国 ＨＷＩ Ａｎａｌｙｔｉｋ ＧＭＢＨ 公司) ꎻ 甲醇( 纯度 ９９ ９％ ꎬ 色谱纯ꎬ
４１２
芸香苷和莨菪亭是烟草中最主要的酚类物质ꎬ 绿原酸占总多酚的 ７５％ ~ ９５％
质的前体物
第 ４０ 卷
分析测试学报
[３ － ４]
[２]
ꎬ 其为烟草特征香味物
ꎮ 其他含量低的多酚类化合物在烟草品质鉴定与改善方面也有辅助影响ꎮ 另一方面ꎬ
卷烟烟气中含有的简单酚( 如儿茶酚、 对苯二酚等二羟基苯化合物) [５] 也属于多酚ꎬ 对卷烟烟气有害成
烟草中有些多酚的分子量较大且不易挥发ꎬ 常采用高效液相色谱( ＨＰＬＣ) 进行测定ꎬ 检测器多选择
紫外检测器( ＵＶ) 、 二极管阵列检测器( ＤＡＤ) 或三重四极杆质谱仪( ＭＳ / ＭＳ) [１３ － １６] ꎮ 其中ꎬ ＵＶ 检测器
的灵敏度较好ꎬ 但无法灵活地实现多个化合物在不同波段下的检测ꎻ ＨＰＬＣ － ＭＳ / ＭＳ 法的灵敏度高ꎬ
但需使用同位素内标ꎬ 提高了实验成本ꎻ ＨＰＬＣ － ＤＡＤ 法的实验成本较低ꎬ 且便于在各化合物的较大吸
收处进行检测ꎬ 获得较佳的检测灵敏度ꎮ
国内外应用 ＨＰＬＣ 检测烟草中多酚类物质已多有报道ꎬ 检测指标以绿原酸、 芸香苷和莨菪亭等含
量高的多酚化合物为主 [１７ － １８] ꎮ 近几年报道的方法逐步将新绿原酸、 隐绿原酸、 七叶亭、 咖啡酸、 山奈
法ꎬ 为同时检测烟叶中多种多酚类化合物提供方法参考ꎮ
１ 实验部分
１ １ 仪器与试剂
Ａｇｉｌｅｎｔ １２００ 高效液相色谱仪、 Ａｇｉｌｅｎｔ ＳＢ － Ｃ１８ 柱(３ ０ ｍｍ × １５０ ｍｍ × １ ８ μｍꎬ 美国 Ａｇｉｌｅｎｔ 公司) ꎻ
ＢＴ２５Ｓ 电子天平( 感量: ０ ０１ ｍｇꎬ 最大量程: ２１ ｇꎬ 德国赛多利斯科学仪器有限公司) ꎮ
隐绿原酸、 东莨菪苷、 咖啡酸、 七叶亭、 对香豆酸、 阿魏酸、 莨菪亭、 ７￣羟基香豆素、 芦丁、 槲皮苷、 山奈
酚￣３￣Ｏ￣芸香糖苷和槲皮素 １４ 种多酚化合物的方法ꎮ 称取 ０ ０２ ｇ 烟末ꎬ 加入 ５ ｍＬ ５０％ 甲醇ꎬ 超声萃取 ３０
ｍｉｎꎬ 取上清液过水相滤膜后ꎬ 采用 Ａｇｉｌｅｎｔ ＳＢ － Ｃ１８ 柱(３ ０ ｍｍ × １５０ ｍｍꎬ １ ８ μｍ) 进行分离ꎬ 以 ０ ０５ ｍｏｌ / Ｌ
槲皮苷( 纯度 ９６ ０％ ) 、 山奈酚￣３￣Ｏ￣芸香糖苷( 纯度≥９８ ０％ ) ( 美国 Ｓｉｇｍａ － Ａｌｄｒｉｃｈ 公司) ꎻ 东莨菪苷
( 纯度 ９９ ８％ ꎬ 美国 Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ 公司) ꎻ 阿魏酸( 纯度 ９８ ０％ ꎬ 加拿大 ＴＲＣ 公司) 、 ７￣羟基香
０ ７０％ ~ ３ ６％ ꎬ 日间 ＲＳＤ 为 ４ ０％ ~ ６ ４％ ꎬ 加标回收率为 ９５ ２％ ~ １０９％ ꎮ 该方法具有良好的灵敏度、 精密
度和回收率ꎬ 适合于烟草样品中多种多酚类化合物的同时测定ꎮ
关键词: 高效液相色谱ꎻ 二极管阵列检测器ꎻ 分段检测ꎻ 烟草ꎻ 多酚
中图分类号: Ｏ６５７ ７ꎻ ＴＳ４１ 文献标识码: Ａ 文章编号: １００４ － ４９５７(２０２１)０３ － ０４１１ － ０６
磷酸二氢钾水溶液和甲醇为流动相ꎬ 采用分段式检测ꎬ 获得 １４ 种多酚类化合物在各自最佳检测波长下的信
号ꎬ 实现了良好分离ꎮ 结果表明ꎬ １４ 种多酚类化合物的色谱峰面积与其质量浓度呈良好的线性关系ꎬ 相关系
数 ｒ２ > ０ ９９９ ７ꎬ 检出限为 ０ ０１ ~ ０ １５ μｇ / ｍＬꎬ 定量下限为 ０ ０３ ~ ０ ５０ μｇ / ｍＬꎬ 日内相对标准偏差( ＲＳＤ) 为
高效液相色谱 － 分段检测法同时测定烟草中
１４ 种多酚类化合物
欧阳璐斯ꎬ 赖燕华ꎬ 王 予ꎬ 陶 红ꎬ 黄翼飞 ∗
( 广东中烟工业有限责任公司技术中心ꎬ 广东 广州 ５１０３８５)
摘 要: 利用高效液相色谱 － 二极管阵列检测器( ＨＰＬＣ － ＤＡＤ) ꎬ 建立了同时分析烟草中新绿原酸、 绿原酸、
ｒｕｒｉｃ ａｃｉｄꎬ ｓｃｏｐｏｌｅｔｉｎꎬ ７￣ｈｙｄｒｏｘｙｃｏｕｍａｒｉｎꎬ ｒｕｔｉｎꎬ ｑｕｅｒｃｉｔｒｉｎꎬ ｋａｅｍｐｆｅｒｏｌ ３￣Ｏ￣β￣ｒｕｔｉｎｏｓｉｄｅ ａｎｄ
ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ. ０ ０２ ｇ ｔｏｂａｃｃｏ ｐｏｗｄｅｒ ｓａｍｐｌｅ ｗａｓ ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃａｌｌｙ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ｗｉｔｈ ５ ｍＬ ｏｆ ５０％ ｍｅｔｈａｎｏｌ ｆｏｒ
第 ４０ 卷 第 ３ 期
分析测试学报
Ｖｏｌ ４０ Ｎｏ ３
２０２１ 年 ３ 月
ＦＥＮＸＩ ＣＥＳＨＩ ＸＵＥＢＡＯ( Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ)
４１１ ~ ４１６
ｄｏｉ: １０ ３９６９ / ｊ ｉｓｓｎ １００４ － ４９５７ ２０２１ ０３ ０１８
Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ Ｆｏｕｒｔｅｅｎ Ｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌｓ ｉｎ Ｔｏｂａｃｃｏ ｂｙ Ｐｉｅｃｅｗｉｓｅ
Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｂａｓｅｄ ｏｎ Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ
ＯＵＹＡＮＧ Ｌｕ￣ｓｉꎬ ＬＡＩ Ｙａｎ￣ｈｕａꎬ ＷＡＮＧ Ｙｕꎬ ＴＡＯ Ｈｏｎｇꎬ ＨＵＡＮＧ Ｙｉ￣ｆｅｉ ∗
酚￣３￣芸香糖等作为分析指标ꎬ 但仍有一些质量分数较低的多酚类物质被忽略ꎮ 由于烟草中某些多酚化
合物含量低ꎬ 易受其他物质干扰ꎬ 因此选择各目标物的最大吸收波长作为ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ测波长ꎮ ＤＡＤ 检测器可实
现多个化合物在不同波段下的检测ꎬ 而且可以更直观地呈现各目标物在最佳检测波长下的色谱峰ꎬ 大
大提高工作效率ꎮ 本研究采用 ＨＰＬＣ － ＤＡＤ 分段式检测建立了烟草中 １４ 种多酚类物质的同时测定方
ｍＬꎬ ｗｈｉｌｅ ｔｈｅ ｉｎｔｒａ￣ｄａｙ ａｎｄ ｉｎｔｅｒ￣ｄａｙ ｒｅｌａｔｉｖｅ ｓｔａｎｄａｒｄ ｄｅｖｉａｔｉｏｎｓ( ＲＳＤ) ｗｅｒｅ ０ ７０％ － ３ ６％ ａｎｄ
４ ０％ － ６ ４％ ꎬ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ. Ｔｈｅ ｓｐｉｋｅｄ ｒｅｃｏｖｅｒｉｅｓ ｒａｎｇｅｄ ｆｒｏｍ ９５ ２％ ｔｏ １０９％ . Ｔｈｅ ｐｒｏｐｏｓｅｄ
量瓶中ꎬ 用水稀释至刻度ꎬ 作为系列混合标准溶液ꎮ
１ ３ 样品处理
准确称取 ０ ０２ ｇ 烟末( 精确至 ０ ０００ １ ｇ) ꎬ 置于 １０ ｍＬ 具塞玻璃管中ꎬ 加入 ５ ｍＬ ５０％ 甲醇ꎬ 超声
新绿原酸( 纯度 ９９ ２％ ) 、 隐绿原酸( 纯度 ９９ ５％ ) ( 德国 Ｐｈｙｔｏｌａｂ 公司) ꎻ 绿原酸( 纯度≥９５ ０％ ) 、
咖啡酸( 纯度 ９８ ０％ ) 、 七叶亭( 纯度 ９８ ０％ ) 、 对香豆酸( 纯度≥９８ ０％ ) 、 莨菪亭( 纯度≥９９ ０％ ) 、
( Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｅｎｔｒｅꎬ Ｃｈｉｎａ Ｔｏｂａｃｃｏ Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｃｏ. Ｌｔｄ. ꎬ Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ ５１０３８５ꎬ Ｃｈｉｎａ)
Ａｂｓｔｒａｃｔ: Ａ ｈｉｇｈ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｗｉｔｈ ｄｉｏｄｅ ａｒｒａｙ ｄｅｔｅｃｔｏｒ( ＨＰＬＣ － ＤＡＤ) ｗａｓ
ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ １４ ｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌｓꎬ ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｎｅｏｃｈｌｏｒｏｇｅｎｉｃ ａｃｉｄꎬ
ｃｈｌｏｒｏｇｅｎｉｃ ａｃｉｄꎬ ｃｒｙｐｔｏｃｈｌｏｒｏｇｅｎｉｃ ａｃｉｄꎬ ｓｃｏｐｏｌｉｎꎬ ｃａｆｆｅｉｃ ａｃｉｄꎬ ｅｓｃｕｌｅｔｉｎꎬ ｐ￣ｃｏｕｍａｒｉｃ ａｃｉｄꎬ ｆｅｒ￣
ｍｍ × １５０ ｍｍꎬ １ ８ μｍ) ꎬ ｗｉｔｈ ０ ０５ ｍｏｌ / Ｌ ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｄｉｈｙｄｒｏｇｅｎ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ａｑｕｅｏｕｓ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ａｎｄ
ｍｅｔｈａｎｏｌ ａｓ ｍｏｂｉｌｅ ｐｈａｓｅｓ. Ｔｈｅｒｅ ｅｘｉｓｔｅｄ ｇｏｏｄ ｌｉｎｅａｒ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ ｂｅｔｗｅｅｎ ｐｅａｋ ａｒｅａｓ ａｎｄ ｍａｓｓ ｃｏｎ￣
２０ ｍｇ 咖啡酸、 ３３ ｍｇ 莨菪亭、 ４５０ ｍｇ 芦丁、 ２０ ｍｇ 山奈酚￣３￣Ｏ￣芸香糖苷以及 １０ ｍｇ 的七叶亭、 对香豆
酸、 阿魏酸、 槲皮苷、 ７￣羟基香豆素和槲皮素ꎬ 置于 ５０ ｍＬ 棕色容量瓶中ꎬ 加入 ５０％ 甲醇溶解并定容
至刻度ꎬ 作为混合标准储备液ꎮ
系列混合标准溶液: 分别准确移取 ５０、 １００、 ２００、 ４００、 ８００ μＬ 混合标准储备液至 １００ ｍＬ 棕色容
德国 Ｍｅｒｃｋ ＫＧａＡ 公司) ꎻ 磷酸二氢钾( 美国 Ａｌａｄｄｉｎ 试剂公司) ꎻ Ｍｉｌｌｉ￣Ｑ 超纯水( 由 Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ 超纯水机
制备) ꎮ
１ ２ 溶液配制
混合标准储备液: 称量约 １２０ ｍｇ 新绿原酸、 ８００ ｍｇ 绿原酸、 １８０ ｍｇ 隐绿原酸、 １００ ｍｇ 东莨菪苷、
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ: ｈｉｇｈ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙꎻ ｄｉｏｄｅ ａｒｒａｙ ｄｅｔｅｃｔｏｒꎻ ｐｉｅｃｅｗｉｓｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎꎻ
ｔｏｂａｃｃｏꎻ ｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌｓ
多酚是烟草中一类重要的化合物ꎬ 含量高达 ５％
[１]
ꎮ 多酚类物质在烟草中以糖苷和酯的形式存在ꎬ
ｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｔｈｅ ａｎａｌｙｔｅｓꎬ ｗｉｔｈ ｔｈｅｉｒ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔｓ( ｒ２ ) ｌａｒｇｅｒ ｔｈａｎ ０ ９９９ ７. Ｔｈｅ ｌｉｍｉｔｓ ｏｆ
ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｌｉｍｉｔｓ ｏｆ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ ｗｅｒｅ ｉｎ ｔｈｅ ｒａｎｇｅｓ ｏｆ ０ ０１ － ０ １５ μｇ / ｍＬ ａｎｄ ０ ０３ － ０ ５０ μｇ /
主要分为单宁类( 绿原酸) 、 香豆素类( 莨菪灵、 莨菪亭、 七叶亭) 和黄酮类( 芸香苷) 等ꎬ 其中绿原酸、
收稿日期: ２０２０ － ０６ － ３０ꎻ 修回日期: ２０２０ － ０８ － ０３
基金项目: 广东中烟工业有限责任公司资助项目( 粤烟工 [２０１７] 科字第 ９ 号)
∗通讯作者: 黄翼飞ꎬ 硕士ꎬ 高级工程师ꎬ 研究方向: 烟草化学ꎬ Ｅ － ｍａｉｌ: ｈｕａｎｇｙｆ＠ ｇｄｚｙｇｙ ｃｏｍ
分释放量有显著影响ꎮ 多酚化合物含量受烟叶的种类、 成熟度和加工方法等因素的影响 [６] ꎮ 因此ꎬ 多
酚化合物 对 烟 草 的 生 长 发 育、 调 制 特 性、 烟 叶 色 泽、 烟 气 香 吃 味 和 烟 气 生 理 强 度 等 起 着 重 要 作
用 [７ － １２] ꎮ 烟草多酚类物质的准确测定ꎬ 对评价烟草品质、 指导卷烟配方设计具有重要意义ꎮ
３０ ｍｉｎꎬ ａｎｄ ｔｈｅｎ ｔｈｅ ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ ｗａｓ ｐｕｔ ｔｏ ｐａｓｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ａｎ ａｑｕｅｏｕｓ ｐｈａｓｅ ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ ｍｅｍｂｒａｎｅ. １４
ｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌｓ ｗｅｒｅ ｓｅｐａｒａｔｅｄ ａｔ ｔｈｅｉｒ ｏｐｔｉｍａｌ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈｓ ｏｎ ａｎ Ａｇｉｌｅｎｔ ＳＢ － Ｃ１８ ｃｏｌｕｍｎ(３ ０