细丝蛋白A抑制人结肠癌SW480细胞体外侵袭转移能力

细丝蛋白A抑制人结肠癌SW480细胞体外侵袭转移能力史建伟;于跃明;王士杰;杨珊;孔繁龙;张娟;王贵英
【摘要】Objective To explore the inhibitory effect of Filamin A(FLNa) on invasion and metastasis of human colon carcinoma cell line SW480 and investigate its mechanisms.Methods Expressing vector pcDNA3.1/V5-His-TOPO/FLNa was transfected into SW480 cells by lipofectamine protocols.After G418 selection, the SW480/FLNa cells expressing FLNa stably were obtained.Expression of FLNa in tumor cells was confirmed by RT-PCR and Westem blot.RT-PCR assay and Western blot were also employed to detect the expression of matrix metalloproteinases9(MMP-9).Cell proliferationin vitro was assessed by MTT assay.Inhibitory effect of filamin A on SW480 cells was observed by Wound healing assay,Transwell chamber experiment, and Matrigel invasion assay.Results The results of RT-PCR and Western blot demonstrated that the recombinant vector was transfected into SW480 cells by liposome.The expressions of MMP-9 mRNA and protein were lower in the SW480/FLNa cells than that in the wild SW480 cells; The inhibitory effect of FLNa on invasion and metastasis of SW480 cells was proved by wound healing assay,Transwell chamber experiment and matrigel invasion assay.Conclusion FLNa has significant inhibitory effect on the invasion and metastasis of human colon carcinoma cell line SW480.The mechanism might be explained by suppressive effect of MMP-9.%目的研究细丝蛋白A(FLNa)对人结肠癌SW480细胞侵袭转移行为的影响,并初步探讨其抑癌的机制.方法将FLNa基因质粒载体pcDNA3.1/V5-His-
TOPO/FLNa,以脂质体介导方式转染SW480细胞.经G418筛选,获得FLNa基因稳定表达的SW480/FLNa细胞.反转录聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot检测FLNa基因导入;RT-PCR和Western blot检测细胞中基质金属蛋白酶-
9(MMP-9)的表达;MTT法检测细胞的增殖能力;划痕损伤实验、Transwell小室和Matrigel侵袭模型评价FLNa对细胞侵袭和转移能力.结果在SW480细胞
中,FLNa的表达载体pcDNA3.1/V5-His-TOPO/FLNa获得稳定表
达,SW480/FLNa细胞FLNa的mRNA和蛋白的表达水平均较SW480细胞高,分别为[(1.27±0.03)vs(0.14±0.02),P<0.01]和
[(1.18±0.03)vs(0.25±0.02),P<0.05];SW480/FLNa细胞MMP-9的mRNA和蛋白表达水平均低于SW480细胞,分别为[(0.19±0.02)vs(1.63±0.04),P<0.05]和[(0.12±0.02)vs(0.79±0.04),P<0.05].结论 FLNa抑制SW480细胞的侵袭和转移能力,其机制可能与降低MMP-9的表达有关.
【期刊名称】《基础医学与临床》
【年(卷),期】2011(031)009
【总页数】6页(P1000-1005)
【关键词】结肠肿瘤;细丝蛋白A;侵袭;转移
【作者】史建伟;于跃明;王士杰;杨珊;孔繁龙;张娟;王贵英
【作者单位】河北大学,附属医院,肿瘤外科,河北,保定,071000;河北医科大学,第四医院外二科,河北,石家庄,050011;河北医科大学,第四医院外二科,河北,石家
庄,050011;河北医科大学,第四医院肿瘤研究所,河北,石家庄,050011;河北医科大学,第四医院外一科,河北,石家庄,050011;山西医科大学,临床二系07级,山西,太
原,030001;河北医科大学,第四医院外二科,河北,石家庄,050011;河北医科大学,第四医院外二科,河北,石家庄,050011
【正文语种】中文
【中图分类】R735.35
细丝蛋白(filamin)属非肌性肌动蛋白结合蛋白家族，分A、B和C 3个亚型。

家族成员的共同点是具有连续串联的重复β-折叠结构。

细丝蛋白A(filamin A，FLNa)基因结构高度保守，表达广泛，对哺乳动物的生长发育具有重要的作用。

最新研究表明，FLNa在肿瘤细胞的血管重塑和侵袭转移中发挥重要作用［1］。

有关FLNa 基因在结肠癌发生发展中的作用国内外尚未见报道。

本研究将FLNa基因真核表达载体导入结肠癌SW480细胞，检测该基因干预前后细胞体外侵袭转移能力的变化，并初步探讨其机制。

1 材料与方法
1.1 材料
重组质粒pcDNA3.1/V5-His-TOPO/FLNa和脂质体转染试剂LipofectamineTM2000(Invitrogen公司);总RNA提取试剂和RIPA试剂(Solarbio公司);引物由上海生工生物工程公司合成;反转录试剂盒和SDS-PAGE标准指示剂(Fermentas公司); PCR试剂盒(Promga公司);兔抗人FLNa单克隆一抗(Epitomics公司);鼠抗人MMP-9单克隆一抗和兔抗人GAPDH多克隆一抗(Santa Crue公司);ECL化学发光液(Pierce公司);Transwell侵袭小室(Coster公
司);Matrigel胶(BD公司);SW480细胞由我院科研中心保存。

1.2 方法
1.2.1 细胞培养:SW480细胞用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100
μg/mL链霉素的RPMI-1640培养基，于37℃5%CO2培养箱中培养，以0.25%的胰蛋白酶消化细胞传代，取对数生长期细胞用于实验。

1.2.2 重组质粒转染SW480细胞:转染前将细胞接种于24孔板，待每孔细胞生长
汇合度达70%～ 80%后，按LipofectamineTM2000说明书进行转染。

同时以不含FLNa cDNA的pcDNA3.1/V5-His-TOPO质粒作为空载体转染对照组细胞。

经G418筛选，获得稳定表达FLNa的细胞克隆。

1.2.3 RT-PCR检测细胞FLNa和MMP-9基因的表达:检测3组细胞:未转染组野生型细胞(SW480)、转染空载体组细胞(SW480/pcDNA3.1)和转染FLNa cDNA组SW480细胞(SW480/FLNa)。

使用总RNA提取试剂抽提细胞中的总RNA，测定浓度。

根据GenBank中人源FLNa、MMP-9和GAPDH的cDNA全长设计引物。

FLNa的上游引物5'-AGCCT CCACGAGACATCATC-3'，下游引物5'-CCAGTGTGT ACTCCCCCTTG-3';MMP-9上游引物5'-TGGAGTCA CTGTACACCCTC-3'，下游引物5'-CGGACATCCGCT AAACAGG T-3';内参照GADPH的上游引物5'-GA AGGTGAAGGTCGGAGTC-3'，下游引物5'-GAAGAT GGTGATGGGATTTC-3'。

取总RNA 1 μg，加入随机引物1 μL，5×RT-PCR缓冲液4 μL，RNA酶抑制剂1 μL，dNTP 2 μL，反转录酶1 μL，加DEPC处理的水
至总体积20 μL。

30℃10 min，45℃5 min，反应结束后，95℃5 min。

取cDNA 2 μL，上、下游引物各1 μL，10×PCR缓冲液2.5 μL，Taq DNA聚合酶0.2 μL，dNTP 0.5 μL，加DEPC处理的水至总体积25 μL。

95℃预变性5 min，94℃ 30 s，64℃ 30 s，72℃ 30 s进行35个循环，于72℃延伸7 min。

PCR产物上样于2%琼脂糖凝胶，电泳，FLNa、MMP-9和GAPDH的PCR产物分别为310、400和220 bp。

于紫外线灯下观察结果。

以GAPDH作内参照，以
FLNa/GAPDH、MMP-9/GAPDH值来定量。

1.2.4 〛Western blot检测细胞FLNa和MMP-9蛋白的表达:检测同上分为3组
SW480细胞。

使用RIPA试剂提取细胞中的总蛋白，定量。

取蛋白样品50 μg，
加入5×上样缓冲液(体积比4∶1)，煮沸5 min后上样。

经SDS-PAGE电泳、转膜，将蛋白质转至PVDF膜。

将膜置于含5%脱脂奶粉的TBST液中，室温封闭1 h，加入特异性的一抗－4℃孵育过夜，次日用TBST液洗膜3次，每次10 min。

二抗37℃孵育1 h。

化学发光法(ECL法)检测条带。

以GAPDH作内参照，以FLNa/GAPDH、MMP-9/GAPDH值来定量。

1.2.5 MTT法测定细胞增殖反应性并绘制细胞生长曲线:取对数生长期的3组
SW480细胞，分组如上，常规消化。

调整细胞浓度，接种于96孔培养板中，
1×104个/孔(200 μL/孔)，每种细胞设21个复孔，置于37℃、5%CO2的培养箱中培养。

每天随机选择3种细胞的3个复孔进行测量，每孔加入MTT (5 g/L)20
μL，继续培养4 h，弃上清，每孔加入二甲基亚砜(DMSO)150 μL，振荡10 min，充分溶解结晶。

在酶联免疫检测仪、492 nm波长测定各孔吸光度(A)值，连续检
测7 d。

以培养时间为横轴(X轴)，吸光度值为纵轴(Y轴)，绘制细胞生长曲线。

1.2.6 划痕损伤实验:取对数生长期的3组细胞，以5×105个/mL浓度接种于6孔培养板中，每种细胞设2个复孔，置于37℃、5%CO2的培养箱中培养，待完全
汇合时，用200 μL移液器头在每孔单层细胞呈“一”字划痕，造成培养细胞伤口模型，用PBS清洗，加入含10%胎牛血清的RPMI1640培养基2 mL，置于37℃、5%CO2的培养箱中继续培养24 h，观察并照像。

1.2.7 细胞迁移和侵袭能力测定:取对数生长期的3组细胞，常规消化，用无胎牛血清的RPMI1640培养基清洗细胞，配制细胞悬液，调整浓度为5×105个/mL。

于Transwell小室的上室分别加入3组细胞悬液200 μL。

下室加入含10%胎牛血清的RPMI1640培养基600 μL。

置于37℃、5%CO2的培养箱中培养24 h。

取出Transwell小室，PBS清洗2遍，棉拭子擦去上面残留的细胞，HE染色并计数穿
膜细胞，作为迁移细胞的数目。

将Matrigel胶铺在Transwell小室的聚碳酸酯膜
上层，余下操作同上。

以穿过Matrigel胶的细胞数量评价细胞侵袭能力。

实验结果重复3次。

1.3 统计学分析
数据以均数±标准差(s)表示，应用SPSS13.0统计软件，多组比较采用单因素方差分析，两两比较采用Dunnett－t检验。

2 结果
2.1 RT-PCR检测细胞的FLNa和MMP-9表达结果
转染FLNa cDNA的细胞(SW480/FLNa)的FLNa mRNA表达水平显著高于未转染的细胞(SW480)(P＜0.01);SW480/FLNa细胞的MMP-9 mRNA的表达水平却低于SW480细胞(P＜0.05) (图1)。

2.2 Western blot检测细胞的FLNa和MMP-9表达结果
SW480/FLNa细胞的FLNa蛋白表达水平高于SW480细胞(P＜
0.05);SW480/FLNa细胞的MMP-9蛋白表达水平却低于SW480细胞(P＜
0.05)(图2)。

图1 RT-PCR检测不同组SW480细胞FLNa和MMP-9基因的表达Fig 1 Expression of FLNa and MMP-9 in different SW480 cells detected by RT-PCR1.SW480 cells;2.SW480/pcDNA3.1 cells;3.SW480/FLNa cells*P＜0.05 compared with SW480 cells;＊＊P＜0.01 compared with SW480 cells
图2 Western blot检测不同组SW480细胞的FLNa和MMP-9蛋白表达Fig 2 Expression of FLNa and MMP-9 in different SW480 cells detected by Western blot1.SW480 cells;2.SW480/pcDNA3.1 cells;3.SW480/FLNa cells*P ＜0.05 compared with SW480 cells
2.3 MTT检测细胞增殖能力结果
3组细胞 (SW480、SW480/pcDNA3.1和SW480/FLNa)在连续培养7 d过程
中，3组间每24 h的吸光度值无差异，细胞生长曲线基本重叠，增殖能力无差异(图3)。

图3 MTT检测不同组SW480细胞的增殖曲线Fig 3 Proliferation curves of different SW480 cells detected by MTT assay
2.4 划痕损伤实验结果
SW480/FLNa组细胞缓慢向中央迁移，缺损处修复缓慢，SW480组向划痕处的迁移速度明显快于SW480/FLNa组，而SW480与SW480/pcDNA3.1组间的迁移速度差异不明显(图4)。

2.5 细胞迁移和侵袭能力测定结果
SW480/FLNa组较SW480组穿膜/胶数量明显减少(P＜0.05);SW480/pcDNA3.1组较SW480组穿膜/胶数量无差异(表1)。

3 讨论
图4 划痕损伤实验检测不同组SW480细胞的迁移情况Fig 4 Migratory ability of different SW480 cells detected by scratch damage assay(×200)A.SW480 cells;B.SW480/pcDNA3.1 cells;C.SW480/FLNa cells
FLNa是主要分布在细胞质，属非肌性肌动蛋白结合蛋白，其最初仅被认为参与了细胞骨架的构成。

随着研究的深入发现，FLNa不仅与肌动蛋白结合而影响细胞骨架重塑，在细胞的形态改变中发挥作用，并且与许多组织因子相互作用，促进血管重塑和肿瘤细胞的侵袭转移［2］，与整联蛋白、跨膜受体复合物、接头分子和第二信使相互作用［3］，充当了细胞信号转导中支架蛋白的角色，是细胞运动及信号传导的整合者［4］，参与MAPK/ERK［5－6］、PI3K/Akt［7］、TGF-β信号传导［8］等多条与肿瘤发生发展有关的信号传导通路。

表1 Transwell小室和Matrigel实验检测不同组SW480细胞的迁移和侵袭能力Table 1 Invasion and metastasis of different SW480 cells detected by
Transwell chamber and matrigel invasion assay(s)＊P＜0.05 compared with SW480.group number of migratory cells number of invasive cells SW480 204±15 119±15 SW480/pcDNA3.1 209±18 123±13 SW480/FLNa 82±13* 52±11*
基质金属蛋白酶家族(MMPS)是高度保守的一类酶，主要由内皮细胞、粒细胞及肿瘤细胞等合成和分泌［9］。

MMP-9是该家族中分子量最大的成员，其主要作用底物是Ⅳ、Ⅴ型胶原和明胶，在多种恶性肿瘤组织、培养的肿瘤细胞及癌基因转化细胞中表达增强［10－11］。

Ras/ERK信号通路中ERK激活后，诱使AP-1和ETS家族的转录因子与MMP-9基因的启动子结合［12］。

蛋白特异的鸟嘌呤核苷酸释放因子1(Ras-GRF1)是鸟嘌呤核苷酸交换因子，位于ERK通路的上游，它通过促进GDP的释放而使H-Ras活化。

FLNa可与Ras-GRF1结合，通过泛素化使其降解，抑制了其下游的级联反应，阻遏MMP-9的表达［6］。

本实验结果显示，转染FLNa cDNA的SW480细胞中的MMP-9 mRNA和蛋白的表达水平低于未转染的野生型SW480细胞，提示FLNa的高表达可以降低结肠癌细胞的MMP-9的表达量，减少其对细胞外基质的降解，从而抑制肿瘤细胞的侵袭和转移。

本研究采用的划痕损伤实验借鉴了体外细胞致伤愈合实验模型，用于测定肿瘤细胞的迁移特性。

Transwell小室的穿膜细胞数用于评估细胞的迁移能力。

Matrigel胶是大鼠ESH肉瘤细胞外基质的提取物，与组织基底膜的成分相似，细胞穿胶数量可反映肿瘤细胞的侵袭能力。

实验结果表明，转染FLNa cDNA的SW480细胞的迁移侵袭能力显著低于野生型SW480细胞。

综上所述，FLNa能够抑制结肠癌SW480细胞的迁移侵袭能力，其机制是通过降低MMP-9的表达，抑制肿瘤细胞对基底膜的降解，最终阻遏结肠癌细胞的侵袭转移。

对其机制的深入研究可为抑制肿瘤的侵袭和转移提供新的思路。

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