食品中铜绿假单胞菌检测
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铜绿假单胞菌
一、概 述
• 铜绿假单胞菌[P. aeruginosa]俗称绿脓杆菌,因为 在代谢过程中产生水溶性的绿色色素,使伤口与创 面呈绿色,故名绿脓杆菌,
• 铜绿假单胞菌能在许多污染物质中存活并繁殖,生 长营养需求不高,善于利用各种碳源和氨化合物作 为氮源,在水、土壤、食品以及医院等环境广泛存 在,甚至在蒸馏水、消毒液也不例外,如季铵类消毒 液,特别是含有一些有机物的液体,
• 滤膜：直径四七mm,微孔径为0.四五μｍ [处理方
法：如滤膜未经灭菌,则使用前需先将滤膜放入烧杯中,加入蒸馏水,置于沸水浴中煮沸灭菌三次,每次 一五 min,前两次煮沸后需更换水,用蒸馏水洗涤二次～三次,以除去残留溶剂,建议使用一次性无菌滤 膜,]
• 显微镜：一0×～一00×
• 冰箱：0℃～八℃
• 刚出厂的产品中铜绿假单胞菌数量较少,但有文献报 道五加仑桶装产品[一五～三一天的保存期],铜绿假单胞 菌可生长繁殖达到 CFU/ml,
• 国内卫生标准：0 CFU/二五0ml
三、实验室检验
GB/T 八五三八-二00八 铜绿假单胞菌检测[滤膜法]
原理
将二五0mL水样用孔径为0.四五μm的滤膜过滤, 并将滤膜移至CN琼脂培养基上,于三六℃士一℃恒 温箱中培养四八h,能够在CN琼脂上生长并产生绿 脓菌素,或者能够在CN琼脂上生长并且氧化酶呈 阳性、紫外光[三六0±二0nm]照射下能发荧光、 能够利用乙酰胺产氨的革兰氏阴性无芽孢杆菌, 经证实为铜绿假单胞菌,则其检测结果为阳性,
操作步骤-水样过滤
在一00级的洁净工作台进行过滤操作, 首先用无菌镊子夹取灭菌滤膜边缘部分, 将粗糙面向上,贴放在已灭菌的滤床上, 固定好滤器,将二五0mL水样或稀释液通 过孔径0.四五μm的滤膜过滤,然后将过滤 后的滤膜贴在已制备好的CN琼脂平板上, 平铺并避免在滤膜和培养基之间夹留着 气泡,
力强,对化学药物的抵抗力比一般革兰氏阴性菌强 大,
二、生物学特性
一. 培养特性 本菌属于假单胞菌属,是一种
非发酵革兰阴性无芽孢杆菌,菌体 细长且长短不一,有时呈球杆状或线状,成对或 短链状排列,菌体的一端有单鞭毛,在暗视野显 微镜或相差显微镜下观察可见细菌运动活泼, 二．菌体形态
无芽孢,无夹膜,革兰阴性杆菌,有单鞭毛或丛鞭 毛,运动活泼,菌体的大小为0.五～一µm×一.五～ 三.0µm,菌体笔直或弯曲,
[在紫外线下检查滤膜时,应避免长时间在紫外光下照 射,否则可能会将平板上的菌落杀灭,而导致无法在 证实培养基上生长,]
• 将其它所有红褐色不发荧光的菌落进行氧化酶试验、 乙酰胺肉汤、金氏B培养基确证实验,
纯化
• 营养琼脂：将需验证的可疑菌落划线接 种营养琼脂培养基,于三六℃±一℃培养 二0h～二四h,对可疑菌进行纯化,
培养基和试剂
• 假单胞菌琼脂基础培养基/CN琼脂[低温避 光保存]
• 金氏B 培养基[低温避光保存] • 乙酰胺肉汤 • 营养琼脂 • 氧化酶试剂 • 钠氏试剂[配制好之后低温避光保存]
设备和仪器
• 玻璃器具：所有玻璃器皿使用前需一二一℃ 高压蒸汽灭菌一五分钟
• 恒温培养箱：三六℃±一℃
• 紫外灯：波长应为三六0±二0nm
结果观察
培养二0h～二四h观察滤膜上菌落的生长 情况并计数,防止因为培养导致菌落过分 生长而出现菌落融合,[ 四0h～四八h时更 容易观察产色素情况和荧光情况],
可疑菌落计数情况
• 计数所有显蓝色或绿色[绿脓色素]的菌落,初步判定 为铜绿假单胞菌,
• 计数滤膜上所有发荧光不产绿脓色素疑似铜绿假单 胞菌菌落,并进行乙酰胺肉汤确定试验,
将最初显红褐色的菌落进行氧化酶试验
• 氧化酶试验 ：
• 原理：氧化酶[细胞色素氧化酶]是细胞色素呼吸酶系统的最 终呼吸酶,具有氧化酶的细菌,首先使细胞色素C氧化,再由 氧化型细胞色素C使对苯二胺氧化,生成有色的醌类化合物,
• 操作：取二～三滴新鲜配制的氧化酶试剂滴到放于平皿里 的洁净滤纸上,用铂金丝接种环或玻璃棒,将适量的纯种培 养物涂布在预备好的滤纸上,在一0秒内显深蓝紫色的视为 阳性反应,也可以按照商品化氧化酶测试产品的说明书进 行该项测试,
三、致病性
• 主要致病物质是内毒素,此外尚有菌毛、荚膜、胞外 酶和外毒素等多种致病因子,可引起局部化脓性炎症 ,也可引起中耳炎、角膜炎、尿道炎、胃肠炎、心内 膜炎 、脓胸,还可引起菌血症、败血症及引起婴儿严 重的流行性腹泻, • WHO的HACCP评估明确指出铜绿假单胞菌是婴儿瓶装 饮用水的危害指示菌,可造成婴儿腹泻,尤其是抵抗 力较差的老弱病幼孕人群,饮用含铜绿假单胞菌的瓶 装水很可能导致疾病的发生,患者食入一0三~一0四个菌体细 胞即可被侵害,铜绿假单胞菌的生长还将增加亚硝酸 盐的含量-参考文献,
• 铜绿假单胞菌可由多种途径传播,但主要是通过污 染医疗器械、用具及带菌医护人员引起医源性感 染,因此,对烧伤病房、手术器械及治疗器械应进 行严格消毒灭菌,以保证无铜绿假单胞菌的污染, 对铜绿假单胞菌感染的治疗,可应用庆大霉素、多 粘菌素B和羧苄青霉素,
• 铜绿假单胞菌抵抗力较其他革兰阴性菌强,五六℃ 一h可杀灭,对很多抗生素具有耐受性,对消毒剂、 干燥、紫外线等理化因素及不良环境抵抗源自国内外污染情况- 参考文献
• 国内污染情况： -瓶装天然矿泉水铜绿假单胞菌的检出率一.二％～二三.六 ％; -瓶装饮用纯净水铜绿假单胞菌的检出率一一.六％,
• 国外污染情况： -Richards等在一0四件检品中的四件分离到铜绿假单胞菌; -Rosenberg报告德国一.二％～一0.二％的瓶装矿泉水检 出铜 绿假单胞菌,
三、生化特性
• 氧化酶和过氧化氢酶阳性,O/F试验为氧化型,还原 硝酸盐为亚硝酸盐,分解乙酰胺产生氨,
八八 ％菌株产生水溶性荧光色素,铜绿假单胞菌 能液化明胶,酪蛋白水解,但淀粉不水解,八0 ％以 上的菌株产生蓝绿色色素,
• 分解蛋白质能力强,发酵糖类能力较低,氧化分解葡 萄糖,产酸不产气,不分解甘露醇、乳糖及蔗糖,能 液化明胶,分解尿素,不形吲哚,氧化酶试验阳性,还 原硝酸盐产气,靛基质阴性,不产硫化氢,
一、概 述
• 铜绿假单胞菌[P. aeruginosa]俗称绿脓杆菌,因为 在代谢过程中产生水溶性的绿色色素,使伤口与创 面呈绿色,故名绿脓杆菌,
• 铜绿假单胞菌能在许多污染物质中存活并繁殖,生 长营养需求不高,善于利用各种碳源和氨化合物作 为氮源,在水、土壤、食品以及医院等环境广泛存 在,甚至在蒸馏水、消毒液也不例外,如季铵类消毒 液,特别是含有一些有机物的液体,
• 滤膜：直径四七mm,微孔径为0.四五μｍ [处理方
法：如滤膜未经灭菌,则使用前需先将滤膜放入烧杯中,加入蒸馏水,置于沸水浴中煮沸灭菌三次,每次 一五 min,前两次煮沸后需更换水,用蒸馏水洗涤二次～三次,以除去残留溶剂,建议使用一次性无菌滤 膜,]
• 显微镜：一0×～一00×
• 冰箱：0℃～八℃
• 刚出厂的产品中铜绿假单胞菌数量较少,但有文献报 道五加仑桶装产品[一五～三一天的保存期],铜绿假单胞 菌可生长繁殖达到 CFU/ml,
• 国内卫生标准：0 CFU/二五0ml
三、实验室检验
GB/T 八五三八-二00八 铜绿假单胞菌检测[滤膜法]
原理
将二五0mL水样用孔径为0.四五μm的滤膜过滤, 并将滤膜移至CN琼脂培养基上,于三六℃士一℃恒 温箱中培养四八h,能够在CN琼脂上生长并产生绿 脓菌素,或者能够在CN琼脂上生长并且氧化酶呈 阳性、紫外光[三六0±二0nm]照射下能发荧光、 能够利用乙酰胺产氨的革兰氏阴性无芽孢杆菌, 经证实为铜绿假单胞菌,则其检测结果为阳性,
操作步骤-水样过滤
在一00级的洁净工作台进行过滤操作, 首先用无菌镊子夹取灭菌滤膜边缘部分, 将粗糙面向上,贴放在已灭菌的滤床上, 固定好滤器,将二五0mL水样或稀释液通 过孔径0.四五μm的滤膜过滤,然后将过滤 后的滤膜贴在已制备好的CN琼脂平板上, 平铺并避免在滤膜和培养基之间夹留着 气泡,
力强,对化学药物的抵抗力比一般革兰氏阴性菌强 大,
二、生物学特性
一. 培养特性 本菌属于假单胞菌属,是一种
非发酵革兰阴性无芽孢杆菌,菌体 细长且长短不一,有时呈球杆状或线状,成对或 短链状排列,菌体的一端有单鞭毛,在暗视野显 微镜或相差显微镜下观察可见细菌运动活泼, 二．菌体形态
无芽孢,无夹膜,革兰阴性杆菌,有单鞭毛或丛鞭 毛,运动活泼,菌体的大小为0.五～一µm×一.五～ 三.0µm,菌体笔直或弯曲,
[在紫外线下检查滤膜时,应避免长时间在紫外光下照 射,否则可能会将平板上的菌落杀灭,而导致无法在 证实培养基上生长,]
• 将其它所有红褐色不发荧光的菌落进行氧化酶试验、 乙酰胺肉汤、金氏B培养基确证实验,
纯化
• 营养琼脂：将需验证的可疑菌落划线接 种营养琼脂培养基,于三六℃±一℃培养 二0h～二四h,对可疑菌进行纯化,
培养基和试剂
• 假单胞菌琼脂基础培养基/CN琼脂[低温避 光保存]
• 金氏B 培养基[低温避光保存] • 乙酰胺肉汤 • 营养琼脂 • 氧化酶试剂 • 钠氏试剂[配制好之后低温避光保存]
设备和仪器
• 玻璃器具：所有玻璃器皿使用前需一二一℃ 高压蒸汽灭菌一五分钟
• 恒温培养箱：三六℃±一℃
• 紫外灯：波长应为三六0±二0nm
结果观察
培养二0h～二四h观察滤膜上菌落的生长 情况并计数,防止因为培养导致菌落过分 生长而出现菌落融合,[ 四0h～四八h时更 容易观察产色素情况和荧光情况],
可疑菌落计数情况
• 计数所有显蓝色或绿色[绿脓色素]的菌落,初步判定 为铜绿假单胞菌,
• 计数滤膜上所有发荧光不产绿脓色素疑似铜绿假单 胞菌菌落,并进行乙酰胺肉汤确定试验,
将最初显红褐色的菌落进行氧化酶试验
• 氧化酶试验 ：
• 原理：氧化酶[细胞色素氧化酶]是细胞色素呼吸酶系统的最 终呼吸酶,具有氧化酶的细菌,首先使细胞色素C氧化,再由 氧化型细胞色素C使对苯二胺氧化,生成有色的醌类化合物,
• 操作：取二～三滴新鲜配制的氧化酶试剂滴到放于平皿里 的洁净滤纸上,用铂金丝接种环或玻璃棒,将适量的纯种培 养物涂布在预备好的滤纸上,在一0秒内显深蓝紫色的视为 阳性反应,也可以按照商品化氧化酶测试产品的说明书进 行该项测试,
三、致病性
• 主要致病物质是内毒素,此外尚有菌毛、荚膜、胞外 酶和外毒素等多种致病因子,可引起局部化脓性炎症 ,也可引起中耳炎、角膜炎、尿道炎、胃肠炎、心内 膜炎 、脓胸,还可引起菌血症、败血症及引起婴儿严 重的流行性腹泻, • WHO的HACCP评估明确指出铜绿假单胞菌是婴儿瓶装 饮用水的危害指示菌,可造成婴儿腹泻,尤其是抵抗 力较差的老弱病幼孕人群,饮用含铜绿假单胞菌的瓶 装水很可能导致疾病的发生,患者食入一0三~一0四个菌体细 胞即可被侵害,铜绿假单胞菌的生长还将增加亚硝酸 盐的含量-参考文献,
• 铜绿假单胞菌可由多种途径传播,但主要是通过污 染医疗器械、用具及带菌医护人员引起医源性感 染,因此,对烧伤病房、手术器械及治疗器械应进 行严格消毒灭菌,以保证无铜绿假单胞菌的污染, 对铜绿假单胞菌感染的治疗,可应用庆大霉素、多 粘菌素B和羧苄青霉素,
• 铜绿假单胞菌抵抗力较其他革兰阴性菌强,五六℃ 一h可杀灭,对很多抗生素具有耐受性,对消毒剂、 干燥、紫外线等理化因素及不良环境抵抗源自国内外污染情况- 参考文献
• 国内污染情况： -瓶装天然矿泉水铜绿假单胞菌的检出率一.二％～二三.六 ％; -瓶装饮用纯净水铜绿假单胞菌的检出率一一.六％,
• 国外污染情况： -Richards等在一0四件检品中的四件分离到铜绿假单胞菌; -Rosenberg报告德国一.二％～一0.二％的瓶装矿泉水检 出铜 绿假单胞菌,
三、生化特性
• 氧化酶和过氧化氢酶阳性,O/F试验为氧化型,还原 硝酸盐为亚硝酸盐,分解乙酰胺产生氨,
八八 ％菌株产生水溶性荧光色素,铜绿假单胞菌 能液化明胶,酪蛋白水解,但淀粉不水解,八0 ％以 上的菌株产生蓝绿色色素,
• 分解蛋白质能力强,发酵糖类能力较低,氧化分解葡 萄糖,产酸不产气,不分解甘露醇、乳糖及蔗糖,能 液化明胶,分解尿素,不形吲哚,氧化酶试验阳性,还 原硝酸盐产气,靛基质阴性,不产硫化氢,