肝豆状核变性的分子生物学研究进展

肝豆状核变性的分子生物学研究进展
陈定邦;冯黎;李洵桦
【摘要】本文旨在对肝豆状核变性分子机制研究进展进行综述.肝豆状核变性是一种以多器官铜沉积为特征的常染色体隐性遗传疾病,未经及时治疗的患者可能出现严重的功能损害甚至死亡.目前对其致病基因表达产物ATP7B的亚细胞定位、空间结构及其各结构域的功能特点已有不少研究.研究者们探讨ATP7B各位点的突变,尤其是欧洲人群和亚洲人群各自的突变热点H1069Q和R778L,与某种特定疾病表型联系起来,但是仍未发现二者之问肯定的相关性.此外,近年来肝豆状核变性基因诊断日益普及,检测技术也不断进步,这些分子生物学水平的进展为未来肝豆状核变性的生理学研究、诊断及治疗提供了新的方向.
【期刊名称】《分子诊断与治疗杂志》
【年(卷),期】2011(003)002
【总页数】5页(P120-124)
【关键词】肝豆状核变性;ATP7B;铜;基因型;表型
【作者】陈定邦;冯黎;李洵桦
【作者单位】中山大学第一附属医院神经内科,广东,广州,510080;中山大学第一附属医院神经内科,广东,广州,510080;中山大学第一附属医院神经内科,广东,广
州,510080
【正文语种】中文
肝豆状核变性（Hepatolenticular degeneration, Wilson's disease，WD）是一种常染色体隐性遗传疾病，因细胞内铜代谢障碍导致细胞内铜过量积聚，引起的氧化应激反应导致细胞功能损害甚至细胞凋亡，表现为以肝脏损害、神经系统病变、肾脏损害和角膜病变为主的多系统损害。

世界各地患病率不一，据报道约为0.3～
3/10万[1]。

WD的主要致病基因位于13q14.3，基因全长约78 kb，含21个外
显子和20个内含子。

该基因序列与Μenkes病致病基因ATP7A具有62%同源性，故又称ATP7B，是转运阳离子的P1B型ATP酶家族成员之一。

ATP7B在肝、肾、胎盘细胞中表达较高，尤其以肝细胞中表达为主。

一般情况下，ATP7B定位在高尔基体外侧网络（Trans-Golgi network，TGN）上，该蛋白在
这个位置的主要功能是参与合成铜蓝蛋白，ATP7B基因突变造成蛋白功能异常以
致铜蓝蛋白合成减少，血液中与白蛋白疏松结合的铜显著增加，容易在其他器官沉积[2]。

另一方面ATP7B亚细胞定位受细胞内铜离子浓度调控，铜离子浓度升高时，在其他铜转运蛋白的协助下将细胞内多余的铜离子以囊泡形式自肝细胞胆管面分泌进入胆汁进而排出体外。

ATP7B基因突变使这一功能损害，多余的铜不能排出体
外而致病。

基因突变导致ATP7B转运铜功能的模式大致有三种[2]：①ATP7B仍
定位在TGN，但丧失了对铜的应答，如G943S位点突变损害了铜浓度调控的
ATP7B细胞内定位变化，而铜蓝蛋白合成并未受影响，这可能是少数患者铜蓝蛋
白未降低的原因[3]；②ATP7B不在TGN，而是聚集在细胞边缘，转运铜出胞功能失调；③最常见也是临床致病最重要的模式，ATP7B滞留在内质网，容易被蛋白
酶体降解，最常见的突变位点是H1069Q和Arg778Leu[3,4]。

ATP7B在脑组织中仅少量表达，与在肝细胞中编码全长的ATP7B不同，在脑组织中ATP7B编码的mRNA缺少外显子6、7、8和12。

ATP7B在脑组织中的功能
目前还不明确，在对小脑细胞的研究中发现ATP7B连续分布于浦肯野细胞中，主要功能是参与铜蓝蛋白的合成，而将多余的铜转运出胞外则可能主要由ATP7A完
成[5]。

Barnes等[6]在细胞研究中发现与肝细胞相比，肾脏细胞中ATP7B 分子量小，为2～3 kD，且当细胞内铜离子浓度增加时，定位在TGN上的ATP7B不出现向囊泡及胞膜的转运。

推测肾脏细胞中ATP7B可能参与将细胞内的铜离子贮存在TGN 相关的囊泡内而不参与向细胞外排铜的过程，该排铜过程可能由同样定位于TGN 上的ATP7A代偿完成[7]。

肝脏是人体进行铜代谢的主要器官，WD患者由于ATP7B基因突变，不能清除体内多余的铜。

肝内过多的铜诱导自由基反应和脂质过氧化，损害肝细胞，引起脂肪变性和炎症，致肝细胞死亡。

肝细胞死亡后铜释放入血，在肝外组织沉积，引起多器官结构和功能受损。

42%WD患者表现为肝脏损害为首发表现，如慢性肝炎、肝硬化甚至暴发性肝功能衰竭。

40%～50%WD患者表现神经症状如震颤、共济失调等，部分患者伴有精神异常。

部分WD患者出现肾脏症状，如肾性糖尿、氨基酸尿、磷酸盐尿、尿酸尿、高钙尿等，偶见蛋白尿和肾钙质沉积症。

此外，ATP7B异常可影响多器官功能，如出现特征性的角膜K-F环、白内障等眼部症状；出现急性血管内溶血、牙龈及皮下出血等血液系统症状；出现骨及软骨变性、关节畸形、肌无力、肌痛等运动系统症状；少数患者可能出现鱼鳞癣、葡萄糖耐量异常、甲状腺功能低下等。

出现这些复杂临床症状的原因与过量的铜在各组织器官沉积的毒性损害有关，与ATP7B的组织分布并无直接相关性。

ATP7B在乳腺分泌上皮细胞中也有表达，在WD患者中因ATP7B的功能缺陷造成铜离子不能被分泌到乳汁，导致乳汁中铜缺乏，可能造成哺乳对象的铜摄入不足。

WD基因mRNA长6644 bp，翻译产物ATP7B蛋白由1465个氨基酸组成的，是跨膜转运阳离子的P1B型ATP酶家族成员之一。

该蛋白具有结合和水解ATP 的能力，与铜离子结合后激发ATP的水解，释放的能量使蛋白构象改变，与蛋白结合的铜离子被转运到膜的另一侧[8]。

ATP7B有8个跨膜片段
（Transmembrane segments,TΜS1-8），构成铜离子易位途径，其中TΜS6内的高度保守序列CPC是膜内铜离子结合位点。

TΜS两端分别是N（氨基）末端和C（羧基）末端。

连接各段跨膜区之间的是长短不一的氨基酸片段，位于胞浆，其中位于TΜS4和TΜS5之间、TΜS6和TΜS7之间的片段较大，形成两个参与ATP结合与水解的功能区，分别是ATP结合区和A区，ATP结合区又分为P区和N区。

N末端、ATP结合区、A区和C末端都位于胞浆，是ATP参与铜转运的主要功能区（见图1）。

N末端有6个金属结合区（ΜBDS）；8个跨膜区（TΜS）形成膜内铜离子转运通道；ATP结合区分为P区（磷酸化作用）和N区（结合ATP）；A区起脱磷酸化作用和协助蛋白构象改变,调节催化活动。

C末端协助蛋白循环利用。

N末端位于跨膜区上游，主要是铜离子结合区（Μetal-binding domain, ΜBD1-6），包括6段重复的串联在一起的氨基酸保守序列，每段重复序列都包含一段
GΜT/HCxxCxxxIE基序，其中CxxC中的2个半胱氨酸残基是铜离子结合位点。

ΜBD5～6靠近跨膜区，突变分析显示其对跨膜区与铜的亲和力有重要影响[9]，具体是通过影响酶的构象还是直接传递铜离子则尚未阐明。

ΜBD1～4对于酶功能的影响属相对次要，该片段缺失并不影响跨膜区的铜离子亲和力，反而促进了ATP的结合和水解过程，显示该片段可能起抑制作用，调节酶的活动[10]。

N末端还在铜诱导蛋白亚细胞定位改变时指导蛋白到适宜的位置，并且是ATP7B与其他蛋白相互作用的位置，如接受ATOX1传递的铜离子。

ATP结合区是蛋白最重要的功能区，位于第6～7跨膜区之间，包括磷酸化区（P 区）和核苷酸结合区（N区）两个部分。

P区内有一段DKTG基序，其内的天冬氨酸残基（ASP1027）是磷酸化位点，这在所有P型ATP酶都高度保守[11]；N 区则主要是结合ATP，跟其他P型ATP酶相比，N区结合ATP的结构较独特，由H1069、G1099、G1101、I1102、G1149和N1150等几个氨基酸残基形成
ATP结合环境，这几个位点是P1B型ATP酶家族中的保守结构[12]。

不少学者试图研究该区的致病突变从而找到基因型和表型的关联，然而进展不理想。

A区位于两个跨膜区之间（TΜS4～5），可转导磷酸酶活性，帮助完成催化循环，使ATP
水解的过渡产物脱磷酸化，该区的突变可导致蛋白高度磷酸化。

ATP7B催化过程
中蛋白跨膜部分和胞浆部分构象改变时，A区的活动显著变化，据此有人猜测
ΜBD5～6结合铜离子后，影响了A区的活动，使跨膜部分构象改变。

ATP7B的C末端约90个氨基酸长度，并非催化活动必需，而是维持蛋白稳定性
和调节蛋白的细胞内位置，其中的LLL1454～1456位点维持蛋白在TGN上的位置，帮助蛋白转运铜出胞后从质膜和囊泡中循环利用，回到并维持在TGN的位置，LLL＞AAA突变可导致ATP7B滞留在囊泡[13]。

ATP7B基因的外显子和各个蛋白功能区的对应已大致清楚，2～5号外显子编码铜离子结合区，6～8、12～13和19～20号外显子分别编码8个跨膜区，10～11
号外显子编码A区，14号外显子编码P区，14～18号外显子编码N区（见图2）。

目前已经报道约400余种ATP7B基因的突变，包括错义、无义、缺失和插入突变等。

一些突变可引起严重铜转运功能损害，导致儿童时期便出现肝损害，而一些突变导致的蛋白功能损害较轻，可在成年时期才出现在症状。

但突变形式与临床表型之间的关系至今仍未完全确定。

1996年台湾学者发现在22例无血缘关系的WD患者有22%在ATP7B蛋白778
号密码子上存在突变，且突变形式有2种，分别为Arg778Leu（11.4%）和
Arg778Gln（9.7%）[14]，之后国内学者进行相关研究，发现Arg778Leu突变频率为（11.4%～60%）[15]，而日本和韩国的研究也表明Arg778Leu是其人群的
突变热点[16,17]。

另外国内陆续报道第12号外显子的突变，其中Thr935Μet的突变频率达6.3%～18.1%[18]，因此目前认为这两个突变形式是中国人的突变热
点。

Arg778Leu位于第8号外显子编码的跨膜区（TΜS4），该突变改变了蛋白
的跨膜结构，减弱了铜的转运，但并未完全终止铜转运，这可能和Arg778Leu纯合突变患者病情较轻有关然而吴志英通过Arg778Leu纯合突变和复杂杂合突变对比研究发现，Arg778Leu纯合突变患者血清铜蓝蛋白水平明显较低，发病年龄也
较小，说明Arg778Leu严重影响蛋白功能[19]，这和加拿大学者的报道是一致的。

在症状表现方面，刘晓青发现Arg778Leu可能和肝损害者有关[20]。

但叶盛和赵
鹏分别对50例和90例WD患者进行基因型和表型研究后，并未发现
Arg778Leu纯合突变与临床表型存在明显关联[15,21]。

对于另一突变热点
Thr935Μet，杨斌认为可能与患者临床症状出现较晚有关，未发现与临床表型的
关联[22]。

在欧洲最常见的突变形式为位于14号外显子的H1069Q，其中以中欧地区波兰和原东德的WD患者基因突变频率最高（30%～70%），往欧洲西部和南部地区逐
渐降低。

在北美和澳洲H1069Q也是其人群的热点突变。

该错义突变位于N区ATP结合位点，体外突变模型研究发现它未显著改变N区蛋白结构，可能减弱了ATP亲和力，改变ATP结合位置影响了ATP的水解，从而影响铜转运。

有学者对比H1069Q杂合突变、非H1069Q突变，发现H1069Q纯合突变患者发病较晚，症状较轻，可能是由于蛋白功能未完全受影响，肝细胞仍可排铜，铜沉积较慢有关[23]。

2004年Stapelbroek[24]进行荟萃分析发现H1069Q纯合突变患者和较迟发的神经症状相关，这与之前国内学者刘光[25]对40例法国WD患者的报道是一致的。

然而，近期报道[26]立陶宛人热点突变也是H1069Q，且与肝损害表现相关。

其他相对较低的突变频率有位于第8号外显子的2299insC和G710S，第15号外显子的3400delC和第13号2外显子的R969Q，突变频率低于10%。

另外，最近报道发现位于第18号外显子编码的ATP结合区铰链区（连接ATP结合区和
TΜS7）的纯合突变和肝症状相关，可能是由于该突变同时影响ATP结合和铜转
运。

由上可见，WD基因突变类型和临床表型关系复杂，相同基因型的WD患者临床
表现可不一致，造成这种现象的可能因素有：①突变类型太多，且大部分是杂合突变，获得一种纯合突变的大样本病例较困难，造成统计困难；②WD患者临床表
型复杂多样，首发症状常缺乏特异性，难以进行基因型表型相关分析；③除了基因型，表型可能还受到环境因素如铜摄入、感染、药物、毒素等的影响，此外遗传异质性可能也是种重要的影响因素之一，例如在H1069Q纯合突变患者中，载脂蛋
白Eε3纯合型患者发病显著延迟，可能和载脂蛋白E抗氧化或者膜稳定作用有关。

WD若能早期诊断并尽早给与适当治疗，大部分预后良好。

根据临床症状如肝损害、神经症状、角膜K-F环，综合生化指标包括血清铜蓝蛋白、血清铜和24小时尿铜，诊断往往并不困难。

然而WD临床症状复杂多样，首发症状常不典型，生
化指标如铜蓝蛋白在正常人、基因携带者和患者之间有一定重叠，容易造成误诊漏诊。

因此临床上建立一种快速准确的基因检测方法显得尤为重要，目前国内外已建立不少方法研究WD的基因检测，包括聚合酶链反应-单链构象多态性分析（PCR-SSCP）、PCR-酶切和荧光PCR技术、高效液相色谱分析、DNA测序、DNA微阵列技术等，限于检出准确性和效率欠佳、或费用昂贵和周期长等缺点，
尚未大规模推广。

由于WD分子病理机制的复杂性，目前难以进行病因治疗，一
经诊断，即需终身持续治疗，同时需尽量食用含铜量低的食物。

药物治疗主要通过铜螯合剂清除体内多余的铜，以及服用锌剂阻断小肠对铜的吸收。

铜螯合剂主要有青霉胺和曲恩汀，我国尚未有曲恩汀销售，因此，对于无过敏反应的患者，青霉胺是主要的药物，然而除了难以耐受的副反应，如骨髓抑制作用和药物性自身免疫疾病，青霉胺往往使神经症状尤其是肌张力增高的患者症状加重。

锌剂副反应少，但用于维持治疗。

肝移植可纠正肝铜代谢并逐步改善肝外器官铜代谢异常，是挽救暴发性肝功能衰竭WD患者的主要手段，也已证明可以预防不可逆转的神经系统损
害。

分子水平方面的治疗研究也已广泛开展，Μerle U等通过动物实验，将人类ATP7B基因通过病毒作为载体导入WD模型郎-埃文斯黄棕鼠C（Long-Evan Cinnamon, LEC）大鼠体内，发现治疗组肝铜含量明显降低，肝纤维化明显低于
对照组，揭示了基因治疗的可能性[27]。

Park等报道将供体LEC大鼠的肝细胞移
植到8周龄LEC大鼠的脾脏内，显示LEC大鼠6个月存活率达97%，未行移植的对照鼠则为63%，所有接受移植的LEC大鼠胆汁铜排出量均增加，肝铜下降[28]。

另外，骨髓干细胞移植治疗WD模型小鼠也取得较好的疗效[29]。

基因和细胞治
疗在动物身上已取得可喜成果，目前虽然不能用于临床，但已显示乐观的前景。

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