高效液相色谱法测定食品中苏丹红的方法优化

doi:10.16736/41-1434/ts.2021.01.055
高效液相色谱法测定食品中苏丹红的方法优化Optimization of Method for Determination of Sudan in Food by HPLC
◎ 陈伟洁，陆溶艳，聂　丹，莫志斌
（梧州海关，广西　梧州　543002）
CHEN Weijie, LU Rongyan, NIE Dan, Mo Zhibin
（Wuzhou Customs, Wuzhou　543002, China）
摘　要：目的：优化高效液相色谱法测定食品中的苏丹红Ⅰ～Ⅳ。

方法：样品经固相萃取柱净化后，以乙腈和水为流动相按95%∶5%的比例进行洗脱，经C18柱分离，于500 nm波长下检测。

结果：苏丹红Ⅰ～Ⅳ在0.1～2.4μg·mL-1范围内线性良好，相关系数均大于0.999；苏丹红Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ的方法检出限（MDL）分别为0.04μg·mL-1、0.05μg·mL-1、0.05μg·mL-1和0.05μg·mL-1。

在添加浓度为0.4～1.6μg·mL-1的加标试验中，辣椒粉、辣椒油、辣椒酱和腊肠中苏丹红Ⅰ～Ⅳ回收率分别为87.5%～97.5%、90.0%～98.1%、90.0%～98.1%和87.5%～96.9%。

结论：优化后的方法方便快捷，稳定性好，灵敏度高，重现性好，适用于实验室日常检测。

关键词：高效液相色谱；固相萃取；苏丹红；食品检测
Abstract：Objective: Optimize the determination of Sudan Ⅰ～Ⅳ in food by HPLC. Method: After the samples are purified by solid phase extraction with acetonitrile and water as mobile phase by 95%∶5% of the proportion of elution，separated by C18 column, detected at 500 nm wavelengths. Results: Sudan Ⅰ～Ⅳ has a good linear relationship in 0.1～2.4μg·mL-1, and the correlation coefficients were all greater than 0.999. The detection limits of Sudan Ⅰ～Ⅳ are 0.04μg·mL-1, 0.05μg·mL-1, 0.05μg·mL-1, 0.05μg·mL-1. When the addition amount is 0.4～1.6μg·mL-1, the recovery of Sudan Ⅰ～Ⅳ in chili powder, chili oil, chili sauce and sausage are 87.5%～97.5%, 90.0%～98.1%, 90.0%～98.1% and 87.5%～96.9%. Conclusion: The optimized method is convenient and fast, stable, sensitive and reproducible, and it is suitable for routine resting in lab.
Keywords：HPLC; SPE; Sudan; food detection
中图分类号：O657.72
1　材料与方法
1.1　材料与试剂
试验用水为超纯水。

辣椒粉、辣椒酱、辣椒油和腊肠样品，均购自当地超市。

100μg·mL-1苏丹红Ⅰ标准溶液、100μg·mL-1苏丹红Ⅱ标准溶液、100μg·mL-1苏丹红Ⅲ标准溶液，20μg·mL-1苏丹红Ⅳ标准溶液，均购于农业农村部环境保护科研监测所。

甲醇、乙腈、正己烷、二氯甲烷，均为色谱纯，购自Fisher Chemical公司。

1.2　仪器与设备
LC-20A型高效液相色谱仪（岛津公司），配SPD-M20A型光电二极管阵列检测器和LCsolution工作站；SB25-120型超声波清洗机（宁波新芝生物科技股份有限公司）；TDL-40B型离心机（上海安亭科学仪器厂）；I-8-UV型超纯水机（赛多利斯）；EFAA-AC-02型氮吹仪（上海安谱实验科技股份有限公司）；涡旋仪；ME204型电子天平（梅特勒-托利多）；苏丹红专用固相萃取柱（上海安谱实验科技股份有限公司）。

作者简介：陈伟洁（1993—），女，本科，助理工程师；研究方向为食品添加剂、生物毒素等。

1.3　标准溶液的制备
准确移取苏丹红Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ标准品各1 mL，准确移取苏丹红Ⅳ标准品5.0 mL，用乙腈定容至10 mL，配成浓度10μg·mL-1的苏丹红Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ标准溶液。

1.4　高效液相色谱工作条件
采用SHIMADZA VP-ODS色谱柱（4.6 mm×250 mm，4.6μm），柱温为35℃；进样量为20μL；流动相为乙腈∶水（95%∶5%）；流速为1 mL·min-1；波长为500 nm。

1.5　样品前处理
1.5.1　辣椒粉
称取1 g样品于50 mL离心管中，加入20 mL正己烷，超声5 min，4000 r·min-1离心5 min，取上清液至平底蒸发瓶中，重复加入10 mL正己烷超声离心至洗出液为无色，合并上清液，氮吹浓缩至5 mL以下，待过柱净化。

1.5.2　辣椒油
称取0.5 g油样，加入3 mL正己烷涡旋混合震荡溶解10 s，待过柱净化。

1.5.3　辣椒酱
称取1 g样品于50 mL离心管中，加入10 mL正己烷，涡旋2 min，4000 r·min-1离心5 min，取上清液至平底蒸发瓶中，用重复加入10 mL正己烷涡旋提取至洗出液为无色，合并上清液，氮吹浓缩至5 mL以下，待过柱净化。

1.5.4　腊肠
称取1 g粉碎样品于50 mL离心管中，加入10 mL 正己烷涡旋混合振荡5 min，4000 r·min-1离心5 min，取上清液至平底蒸发瓶中，重复加入10 mL正己烷涡旋提取至洗出液为无色，合并上清液，氮吹浓缩至5 mL 以下，待过柱净化。

1.5.5　SPE操作过程
依次用5 mL二氯甲烷，5 mL正己烷活化柱子；将待净化样液转移到柱子中，再用2 mL正己烷润洗样品瓶，润洗液一并转移至柱子中；用5 mL正己烷淋洗柱子，用5 mL二氯甲烷洗脱并收集，将收集液在40℃下氮吹近干，用1 mL乙腈定容，超声1 min，再涡旋混合10 s，过0.45μm有机滤膜，待上机分析。

2　结果与讨论
2.1　检测波长的选择
分别取苏丹红Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ标准溶液于180～800 nm波长范围内进行扫描，结果表明苏丹红Ⅰ在波长478 nm处有最大吸收峰，苏丹红Ⅱ在波长485 nm处有最大吸收峰，苏红Ⅲ在波长506 nm处有最大吸收峰，苏丹红Ⅳ在波长510 nm处有最大吸收峰，进行综合考虑，选择500 nm作为试验的检测波长[4]。

2.2　标准曲线与检出限
将苏丹红Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ标准溶液用乙腈依次稀释成
0.1μg·mL-1，0.2μg·mL-1，0.4μg·mL-1，0.8μg·mL-1，
1.6μg·mL-1和
2.4μg·mL-1的混合标准溶液系列，在仪器工作条件下测定，以苏丹红质量浓度为横坐标，其对应的色谱峰面积为纵坐标绘制标准曲线，线性范围为0.1～2.4μg·mL-1，线性回归方程和相关系数见表1。

以3倍信噪比计算方法的检出限（3S/N），结果见表1。

表1　苏丹红Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ的线性回归方程、相关系数和检出限表
化合物线性回归方程相关系数检出限/μg·mL-1苏丹红Ⅰy=1.686491e-005x+6.105407e-0030.99940.04
苏丹红Ⅱy=1.473104e-005x+7.310919e-0030.99940.05
苏丹红Ⅲy=1.020693e-005x+1.528249e-0030.99930.05
苏丹红Ⅳy=1.00148e-005x+1.979844e-0030.99940.05
2.3　精密度试验
按照仪器工作条件，对0.8μg·mL-1的苏丹红Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ混合标准溶液进行6次重复测定，以测定值的相对标准偏差（RSD）计算方法精密度，苏丹红Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ的RSD分别为1.7%、2.3%、2.6%、1.9%，具体结果见表2。

2.4　回收试验
取有代表性的4种阴性食品类样品，按照《实验室质量控制规范食品理化检测》（GB 27404—2008）标准规定，分别添加0.4μg·mL-1、0.8μg·mL-1、1.6μg·mL-1浓度水平的苏丹红Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ标准溶液，每个浓度水平进样3次，取平均值计算回收率，用于验证方法的准确性，试验结果见表3。

由表3可知，4种食品的回收率为87.5%～98.1%。

2.5　重现性试验
以辣椒粉为基底，添加0.4μg·mL-1的苏丹红Ⅰ、
Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ混合标准溶液，按照试验方法进行测定，连续重复进样6次，计算测定值的RSD，苏丹红Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ的RSD分别为2.4%、1.5%、2.0%和2.2%，说明该方法具有良好的重现性，见表4。

表2　精密度试验结果表
添加浓度
测定值/μg·mL-1
苏丹红Ⅰ苏丹红Ⅱ苏丹红Ⅲ苏丹红Ⅳ
0.8μg·mL-10.750.760.790.77 0.760.750.780.79 0.750.780.760.76 0.780.790.740.78 0.770.780.750.80 0.750.750.780.79
平均值/μg·mL-10.760.770.770.78 RSD/%1.72.32.61.9
表3　回收率试验结果表
名称
本底值
/μg·mL-1
加标量
/μg·mL-1
测定值/μg·mL-1回收率/%
辣椒粉辣椒油辣椒酱腊肠辣椒粉辣椒油辣椒酱腊肠
苏丹红Ⅰ00.40.360.360.360.3590.090.090.087.5
00.80.760.760.760.7495.095.095.092.5
01.61.551.541.551.5396.996.396.995.6
苏丹红Ⅱ00.40.370.380.370.3692.595.092.590.0
00.80.760.780.760.7695.097.595.095.0
01.61.561.571.561.5497.598.197.596.3
苏丹红Ⅲ00.40.360.350.370.3890.087.592.595.0
00.80.770.760.760.7796.395.095.096.3
01.61.561.561.571.5597.597.598.196.9
苏丹红Ⅳ
00.40.350.370.380.3587.592.595.087.5
00.80.770.770.780.7696.396.397.595.0
01.61.561.541.551.5597.596.396.996.9
表4　以辣椒粉为基底的重现性试验结果表
添加浓度
测定值/μg·mL-1
苏丹红Ⅰ苏丹红Ⅱ苏丹红Ⅲ苏丹红Ⅳ
0.4μg·mL-10.360.360.370.37 0.360.350.360.37 0.380.360.380.36 0.370.350.370.38 0.370.350.370.36 0.380.360.380.36
平均值/μg·mL-10.370.360.370.37 RSD/%2.41.52.02.2
3　结论
本试验对高效液相色谱法检测苏丹红的方法进行了优化，优化后的方法采用乙腈和水按95%∶5%的比例洗脱，大大缩短了出峰时间，且峰型良好；用SPE小柱代替国标中自制的中性氧化铝小柱，缩短了前处理时间，净化效果显著且回收率有所提高；优化
后的方法具有灵敏度高、精密度好，重现性高和易于操作的优点[5]，适用于食品中苏丹红含量的日常检测。

参考文献：
[1]罗美中，李碧芳，何小青，等.高效液相色谱-二极管阵列法测定食品中苏丹红（Ⅰ）着色剂[J].现代科学仪器，2005（5）：57-59.
[2]胡寅瑞，梁力源，王苏楠.UPLC-MS/MS法测定辣椒油（酱）中苏丹红染料的研究[J].海峡预防医学杂志，2018，24（1）：71-73.[3]国家质量监督检验检疫总局.食品中苏丹红染料的检测方法高效液相色谱法：GB/T 19681—2005[S].北京：中国标准出版社，2005.
[4]于林，孟冰冰，杨桂玲.辣椒制品中的苏丹红检测方法的优化[J].中国调味品，2014，39（7）：123-125.
[5]许秦，唐一秋，郑世妍.高效液相色谱法测定辣椒油中苏丹红的含量[J].粮食科技与经济，2020，45（4）：101-102.
（上接第185页）
常温贮藏过程中，各组樱桃样品的感官评分下降迅速，在贮藏的第2 d冰水组感官评分下降最快，各项指标均下降到了7左右，臭氧化冰水处理组果实褐变程度和果柄干缩程度以及果柄干枯程度评分介于冰水组和风冷组之间。

贮藏到第4 d，冰水组果实除颜色与果皮光泽度外，其他指标已经下降到了感官接受点6分左右。

臭氧化冰水组各项指标分值为7左右，而风冷组感官品质分值稍高，在7～8。

到了保藏的第6 d，各组樱桃感官品质已经低于可接受值，完全失去了食用价值。

总体而言，风冷处理的样品常温货架期最长可以达到4 d，臭氧化冰水处理组稍短，而冰水处理组最短。

3　结论
甜樱桃的消费者可接受性和市场价格主要与大小、表皮颜色、风味、甜度、酸度、糖酸比、硬度和果柄颜色有关[5-7]。

果柄是影响甜樱桃可接受程度的重要部分，尽管樱桃的果柄不被食用，但是消费者会将果柄的状态作为樱桃是否新鲜的评价标准[6]。

结果表明，与风冷处理相比，冰水和臭氧化冰水处理均不利于红玛瑙樱桃冷藏以及常温贮藏时鲜红颜色的维持。

本研究测定的红玛瑙樱桃硬度相对较高，这与其初始果胶水解度较低有关。

随着贮藏时间的推迟，在20 d，冰水处理组使果实硬度提高，而臭氧化冰水处理使得果实硬度降低。

推测冰水处理可能抑制了果胶降解酶，同时增加了果胶甲基酯酶（PME）的活性，导致果实硬度提高。

臭氧化冰水处理似乎引起了果实的软化，推测本研究中臭氧化冰水降低了冷藏期间樱桃果实的硬度，不排除臭氧直接作用于细胞壁结构，也有可能是臭氧通过某种途径激发了果胶的分解，从而引起果实的软化。

参考文献：
[1]李咏富，哈益明，李伟明，等.不同处理方式对甜樱桃冰温贮藏效果影响的研究[J].核农学报，2013，27（11）：1675-1680.
[2]张倩，辛力，亓雪龙，等.肉桂精油对甜樱桃果实品质和货架期的影响[J].核农学报，2015，29（9）：1737-1742.
[3]Mozetic B，Trebse P，Hribar J.Determination
a n d q u a n t i t a t i o n o f a n t h o c y a n i n s a n d hydroxycinnamic acids in different cultivars of sweet cherries（Prunus avium L.）from Nova Gorica Region（Slovenia）[J].Food Technology & Biotechnology，2002，40（3）：207-212.
[4]CHEN Ming，JIANG Qian，YIN Xueren，et al.Effect of hot air treatment on organic acid- and sugar-metabolism in Ponkan（Citrus reticulata）fruit[J].Scientia Horticulturae，2012，147：118-125.
[5]刘璐，鲁晓翔，陈绍慧，等.低温驯化对冰温贮藏樱桃品质的影响[J].食品工业科技，2015，36（5）：301-305.
[6]王维海，李源钊，吴先辉，等.气调包装微环境对樱桃品质的影响[J].热带生物学报，2018，9（1）：101-108.
[7]李文生，王宝刚，侯玉茹，等.物流环境对樱桃品质影响研究[J].包装工程，2016，37（7）：36-39，91.。