包埋法蛋白质分子印迹的材料和洗脱方式

其分子量范围从六千道尔顿到几百万道尔顿 ， 如此大的分子量阻碍了蛋白质在聚合物中的自由 物大分子 ， 进出 ， 同时蛋白质表面还存在 着 大 量 的 结 合 位 点 和 官 能 团 ， 增加了蛋白质与 Ｍ Ｉ Ｐ ｓ之 间 相 互 识 别 的 复 杂 性， 导致聚合物具有较差的选择性和反应 活 性 。 另 外 ， 目前用来合成大部分 Ｍ 而 Ｉ Ｐ ｓ的 溶 剂 为 有 机 溶 剂 ， 与有机溶剂不相容 ， 在有机溶剂环境中容易 导 致 蛋 白 质 变 性 、 构象变化乃 大部分蛋白质是属于水溶性的 ， 至凝结 ， 因此 ， 蛋白质分子印迹最好是在水溶液中进行 ， 这大大限制了功 能 单 体 与 交 联 剂 的 选 择 。 尽 管 蛋 但研究者们仍不断努力 ， 摸索解决蛋白质分子印迹中遇到的各种问题和探求制备 白质分子印迹困难重重 ，
包埋法蛋白质分子印迹的材料和洗脱方式
李雨亭 ，郑晶晶 ，方桂杰 ，谢卫红 ＊
（ ） 湖北工业大学生物工程学院 ， 发酵工程教育部重点实验室 ， 湖北武汉 ４ ３ ０ ０ ６ ８ 摘 要： 本文总结了蛋白质分子印迹技术中包埋法常用印迹材料的特点 ， 及各种洗脱方 式在分子印迹技术中的应用情况 。 引用文献 ６ ３篇。 关键词 ： 蛋白质分子印迹 ； 包埋印迹法 ； 洗脱 中图分类号 ： Ｏ ６ ５ ７． １ 文献标识码 ： Ａ
包埋印迹是蛋白质印迹方法中最简单的一种 ， 其优点是模板蛋白能整体被印迹 ， 所形成的印迹孔穴能 完整地反映模板分子的结构特征 。 另外 ， 包埋法所产生的印迹孔穴不只局限在聚合物表面 ， 所以较其他两 种方法制备的分子印迹聚合物有更高的识别能力和吸附量 。 由于包埋法采用的是模板分子和功能单体在
２ ０ １ １ ０ ４ ２ ７ ２ ０ １ １ ０ ７ １ ８ 收稿日期 ： － － 修回日期 ： － － ／ ） ； ） 基金项目 ：国家自然科学基金 （ 湖北省教育厅重大研究项目 （ Ｎ ｏ ． ２ ０ ８ ７ ５ ０ ２ ４ Ｂ ０ ５ ０ ９ Ｎ ｏ ． Ｚ ２ ０ ０ ８ １ ４ ０ ２ 女， 博士 ， 教授 ， 从事蛋白质分子印迹研究 ． ＊ 通讯作者 ：谢卫红 ，
［ ２ ７］ 子印迹凝胶对目标蛋白具有一定的选择性 。Ｐ ｉ ｌ ｅ ｔ ｓ ｋ ｅ ｌ Ｂ ｏ ｎ ｄ Ｐ ＡＧ 支持膜上利用丙烯酰胺 制 备 － － ｙ等 在 Ｇ
了厚度仅为 ０． 并研究 了 蛋 白 分 子 在 该 印 迹 膜 上 的 电 迁 移 性 质 。 本 实 验 室 ５ｍｍ 的牛血清白蛋白印迹膜 ， 采用丙烯酰胺作为功能单体 ， Ｎ， Ｎ ′ － 亚甲 基 双 丙 烯 酰 胺 作 为 交 联 单 体 在 盖 玻 片 表 面 制 备 了 对 血 红 蛋 白 具
胺凝胶中分别加入 ３ 异丁烯酰胺 ） 丙基三甲基铵 （ 作为阳离子单体和 ２ ＭＡ Ｐ ＴＡ Ｃ） ２ －（ － 丙烯酰氨基－ － 甲基丙 ） 作为阴离子单体 ， 研究了电荷密 度 对 分 子 印 迹 凝 胶 识 别 性 能 的 影 响 。 研 究 结 果 表明 负 电 烷磺酸 （ ＡＭＰ Ｓ
［ ３ ０］ 荷的引入降低了印迹聚合物的识别能力 ； 而正电荷增强了印迹聚合物的分子识别性能 。 Ｈ ｕ ａ ｎ ｇ等 采用
］ １－４ 。 蛋白质分子识别涉及生物 医 学 、 放等领域 ［ 生物诊断和食品安全等诸多领域， 因 此， 发展具有蛋白质
识别功能的分子印迹聚合物的制备技术成为近年来分子印迹领域的研究热点 ， 特别是与生物分析和生物
５］ 。 然而蛋白质的自然属性却是影响这项技术发展的瓶颈 。 蛋白质是生 传感器相结合的研究和技术开发 ［
第６期
分 析 科 学 学 报
第２ ７卷
［１］ ， 等以 Ｎ 丙烯酰胺 和 衣 康 酸 （ 为 功 能 单 体， 制备了血红蛋白分子印迹 Ｕ ｓ ａ ｌ４ Ｔ Ｂ Ａ） Ｉ Ａ） － 叔丁基丙烯酰胺 （ ｙ ［２］ 探讨了 ｐ 水凝胶 。 通过改变缓冲溶液的 ｐ Ｈ 值， Ｈ 对水凝胶的吸附效率和选择识别性的影响 。 Ｈ ｕ ａ等 ４ 以Ｎ 甲基丙烯酰胺 （ 和Ｎ 在硅胶 ３ ＤＭＡ ＰＭＡ） －（ － 二甲氨基丙基 ） － 异丙基丙烯酰胺为功能单体和协助单体 ，
３ １］ 等［ 通过引入具有能产生静电作用的甲基丙烯酸 （ 制备了牛血清白蛋白丙烯酰胺分子印迹凝胶微 ＭＡＡ）
球， 甲基丙烯酸的加入增加了聚合物与模板蛋白之间的相互作用 。 除在丙烯 酰 胺 凝 胶 中 加 带 电 荷 的 功 能 单体以改善分子印迹聚合物对模板蛋白的亲和力 ， 一些研究小组通过在丙烯酰 胺 凝 胶 中 添 加 其 他 功 能 单 如丙烯酰胺 的 衍 生 物 或 使 用 辅 助 识 别 高 分 子 链 以 提 高 印 迹 聚 合 物 对 蛋 白 的 亲 和 力 和 识 别 性 。Ｆ 体， ｕ
３ ２］ 等［ 以丙烯酰胺和 Ｎ 为功能单体制备了血红蛋白和溶菌酶的分子印迹 ３ ＡＡ Ｐ Ｂ Ａ） － 丙烯酰－ － 氨基苯硼酸 （ ［３－３ ］ ６ 研究发现印迹聚合物的专 一 性 结 合 随 ＡＡ 为增加印迹聚合物对 聚合物 ， Ｐ Ｂ Ａ 的 增 加 而 增 加。Ｍ ｉ等 ３ ， ， 模板蛋白的专一性吸附 在制备蛋白分子印迹聚合物时 除使用丙烯酰胺作 为 功 能 单 体 之 外 ， 还采用了高
本实验室采用丙烯酰胺作为功能单体亚甲基双丙烯酰胺作为交联单体在盖玻片表面制备了对血红蛋白具有选择性吸附能力的分子印迹薄膜这种印迹膜可进一步发展成用于检测血红蛋白的检测元件28丙烯酰胺在水溶液中呈中性主要以氢键的形式与蛋白分子进行相互作用形成识别位点为增强模板蛋白与印迹孔穴的作用可在丙烯酰胺凝胶中加入可产生静电作用的功能单体
］ ６－１ ４ 。 蛋白质分子印迹聚合物的方法 ， 并且取得了相当的研究进展 ［ １ ５］ １ ６］ １ ７］ 、 。 包埋印 蛋白质分子印迹聚合物的制备方法一般分为三类 ： 包埋印迹 ［ 表面印迹 ［ 和表位印迹 ［
迹又被称为三维 （ 印迹 ， 是指在印 迹 过 程 中 整 个 蛋 白 质 分 子 被 包 埋 和 印 迹 于 聚 合 物 中 ， 印迹孔穴多分 ３ Ｄ） 布于分子印迹聚合物内部 。 表面印迹又 被 称 为 二 维 （ 印 迹 ，是 指 模 板 蛋 白 的 一 部 分 被 印 迹 于 聚 合 物 ２ Ｄ） 中， 识别和结合位点位于分子印迹聚合物的表面 。 在表面印迹过程中 ， 模 板 分 子 通 常 被 固 定 在 一 定 基 质，
２ ８］ 。 有选择性吸附能力的分子印迹薄膜 ， 这种印迹膜可进一步发展成用于检测血红蛋白的检测元件 ［
丙烯酰胺在水溶液中呈中性 ， 主要以氢键的形式与蛋白分子进行 相 互 作 用 ， 形 成 识 别 位 点， 为增强模
［９］ 板蛋白与印迹孔穴的作用 ， 可在丙烯酰胺凝胶中加入可产生静电作用的功能单体 。Ｊ 往丙烯酰 ａ ｎ ｉ ａ ｋ等 ２
阳离子功能单体 Ｎ， 和阴离子功能单体２ Ｎ， Ｎ ３ ２ １ ＭＡ Ｐ ＴＡ Ｃ） － 三甲基－ －（ － 甲基烯丙酰氨基 ） － － 氯化丙铵 （ －丙 。实 验 发 现 电 荷 离 子 的 加 入 能 增 强 水 凝 胶 的 溶 胀 性 和 吸 附 选 择 性。 烯酰胺基－ ２ ＡＭＰ Ｓ） － 甲基 丙 磺 酸 （ ７ ８ ６
甲基丙烯酰胺 （ 和丙烯酸 （ 共聚 ， 制备了同时带有正负电荷的蛋 白 Ｎ ３ ＭＡ ＰＭＡｍ） ＭＡＡ） －（ － 二甲氨基丙基 ） 质分子印迹聚合 物 ， 发 现 多 重 静 电 作 用 可 增 强 分 子 印 迹 聚 合 物 与 蛋 白 分 子 间 的 亲 和 力。 类 似 地， Ｐ ａ ｎ ｇ
［７］ 制备了一系列具有抗体功能的多肽纳米分子印迹聚合物 。 本实验室在制备血红蛋白 丙 该方法 Ｓ ｈ ｅ ａ等 ３
烯酰胺分子印迹薄膜的过程中 ， 在聚合物液中添加适量的甲基丙稀酸甲酯 ， 降低丙烯酰胺在聚合物膜中的 以减少由于过量丙烯酰胺引起的对蛋白分子产生的非特异性吸附 。 实验结果显示 ， 含脂的分子印迹 配比 ，
［９－２ ］ ６ 为主要功能单体制备的 。 具有代表性的工作有 Ｈ 的以蛋白质为模板 ， 丙烯酰胺为功能单体制备 ｅ ｒ ｔ ｅ ｎ等 １ ｊ
装柱 ， 洗脱模板蛋白后 ， 将混合有模板蛋白的样品加入色谱柱中 ， 评价印迹 分子印迹凝胶 。 将印迹凝胶过筛 、 材料对模板蛋白的选择性吸附 。 他们使用该方法对一系列蛋白 ： 牛血红蛋白 、 细胞色素 Ｃ、 铁传递蛋白 、 人类 核糖核酸酶 、 肌红蛋白进行了印迹 。 研究结果表明 ， 利用丙烯酰胺作为功能单体制备的蛋白质分 生长激素 、
［９］ ３］ 。Ｌ ， 及传感器等方面 ［ 以Ｎ 甲基丙烯酸和丙烯酰胺为功能 单 体 ， ｉ等 ３ Ｎ Ｉ Ｐ Ａ） Ｎ， Ｎ － 异丙基丙烯酰胺 （ －亚
制备溶菌酶分子印迹水凝胶 ， 并研究了温度和盐离子浓度对蛋白质印迹水凝胶 甲基双丙烯酰胺为交联剂 ，
［０］ 在聚丙烯酰胺水凝胶中按不同的比例加入 溶胀性质以及对模板蛋白溶菌酶 重 结 合 的 影 响 。Ｄ ａ ｎ ｉ ｅ ｌ等 ４
１ ６］ １ ８］ 、 如硅球 ［ 盖玻片 ［ 的表面 ， 印迹聚合物在这些基质的表面形成 。 表位印迹则是以多肽作为模板 ， 制备具
包埋法是分子印迹的传统方法 ， 常以水溶性功能 有对整个蛋白质具有识别功能的分子印迹聚合物 。 其中 ， 单体作为制备分子印迹聚合物的材料 。
２ 包埋印迹法常用的印迹材料
１ 前言
， ）是人工合成的 ， 分子印迹聚合物 （ 对目标分子具有特异识别和 Ｍ ｏ ｌ ｅ ｃ ｕ ｌ ａ ｒ Ｉ ｍ ｒ ｉ ｎ ｔ ｉ ｎ Ｐ ｏ ｌ ｍ ｅ ｒ ｓ Ｍ Ｉ Ｐ ｓ ｐ ｇ ｙ 吸附作用的高分子材料 ， 具备与天然受体和抗体类似的分子识别功能 。 由于 高 分 子 聚 合 物 具 有 制 备 过 程 简单 、 结构稳定和可重复利用等优点 ， 分子印迹聚合物被广泛应用于分离 、 检测 、 类酶催化和药物合成与释
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２ ０ １ １年１ ２月 Ｄ ｅ ｃ ． ２ ０ １ １
（ ） 文章编号 ： １ ０ ０ ６ ６ １ ４ ４ ２ ０ １ １ ０ ６ ０ ７ ８ ５ ０ ６ － － －
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， 一定溶剂中混合并进行聚合的方式 ， 为使印迹过程中模板蛋白分子保持其自然状态 （ 结构不发生变化 ） 常 相应地功能单体则选择水溶性的功能单体 ， 如丙烯酰胺 、 多糖 、 使用水溶液作为印迹的介质 ， ３ － 氨基苯基硼 酸和硅烷化试剂等 。 ２． １ 丙烯酰胺 丙烯酰胺（ 是一种可溶于水溶液的功能单体 ， 常与 Ｎ， 共聚用于蛋白质 Ａ Ａ） Ｎ ′ Ｍ Ｂ Ａ） － 亚甲基双丙烯酰胺 （ 电泳膜的制备 ， 与蛋白质分子具有较好的相容性 。 已报道的蛋白质分子印迹聚合物大部分是以丙烯酰胺作
３ ８］ 。 膜较不含酯的印迹膜具有更高的印迹效率 ， 对模板蛋白具有更专一的选择性 ［
以丙烯酰胺作为主体功能单体制备的蛋白质分子印迹聚合物多具有水凝胶的特性 。 水凝胶是一种具 有三维网状结构的亲水性聚合物 ， 又叫做刺激 －响应凝胶 ， 通过改变 ｐ 温 度、 离 子 强 度、 电场和浓度等外 Ｈ、 部条件 ， 可使凝胶产生体积上的可逆膨胀行为 。 水凝胶常被用于制药领 域 中 药 物 、 多 肽、 蛋白质的释放以
分子低聚物作为辅助识别功能链 ， 增加印迹孔穴里对目标蛋白的识别位点 。 结果表明 ， 辅助识别聚合物链 的加入大大提高了分子印迹聚合物对模板蛋白的专一性吸附 。 采用这种思路制备的分子印迹聚合物可用 于对低丰度蛋白的识别和吸附 ， 是一种非常有效的提高分子印迹聚合物专 一 识 别 和 吸 附 的 方 法 。 根 据 蛋 白质多肽的氨基酸组成 ， 建立功能单体库 ， 并设计分子印迹聚合物的功能单 体 组 合 ， 制备一系列分子印迹 聚合物 ， 根据印迹聚合物对模板蛋白的吸附效率 ， 可筛选制备分子印迹聚合物的最佳功能单体组合 。 采用