胞质蛋白的提取

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1,弃去培养基用PBS洗2次后,加入冷的裂解液,裂解液配方:50 mM Hepes, 150 mM NaCl, 3 mM MgCl2, 调整pH至7.5, 根据需要加入蛋白酶抑制剂,有钱可以买pierce的蛋白酶抑制剂鸡尾酒(英文好像是cocktail)。

2,在裂解液中用细胞刮子收集所有细胞,转移裂解液至EP管,用21号针头反复吹打裂解细胞。

3,1000g*3min离心,将上清转移至另一EP管(A管),沉淀用适量含1%SDS的裂解液(上述裂解液加入SDS)溶解即可得到核蛋白。

4,将A管上清21460g*1h 4 °C离心,即可得到胞浆蛋白(上清)和胞膜/骨架蛋白(沉淀)。

对于沉淀根据需要有两种处理,
A, 将沉淀用含SDS的裂解液溶解,即可得到溶于SDS的胞膜/骨架蛋白。

B, 将沉淀用含TritonX-100裂解液(100 mM phosphate buffer, 150 mM NaCl, measured pH 8, 1.5% TritonX-100, 10% glycerol, plus inhibitors)溶解,即可得到溶于Triton X-100(Sol)的胞膜/骨架蛋白,转移上清后剩下沉淀使用含SDS裂解液溶解,即可得到不溶于Triton X-100(Insol)的胞膜/骨架蛋白。

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