HK2、STAT3在病毒性肝炎诱发肝癌中的组织芯片研究

HK2、STAT3在病毒性肝炎诱发肝癌中的组织芯片研究李嫚;张铁英;晋瑞;刘正稳
【摘要】目的探讨已糖激酶2(hexokinase 2,HK2)、转录激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)在病毒性肝炎诱发肝癌中的机制.方法应用组织芯片技术和免疫组织化学方法检测在肝炎病毒感染、肝癌和肝纤维化组织中HK2和STAT3的表达,并对二者的表达进行相关性分析,同时我们还根据肝癌细胞的分化对HK2和STAT3的表达和分布进行了统计学相关分析研究.结果通过计数细胞阳性率,发现乙肝病毒感染的肝癌组织中HK2的表达强度与STAT3的表达强度一致(P=0.141).乙肝病毒感染的肝癌组织中HK2表达上调(约50％),显著高于肝癌(30％)、丙肝(10％)、肝纤维化(乙肝病毒感染)(30％)以及正常组织(20％)(P＜0.05).STAT3在乙肝病毒感染肝癌组织中主要分布于细胞浆和胞核(90％),显著高于肝癌(65％)、丙肝(40％)、肝纤维化(乙肝病毒感染)(30％)以及正常组织(30％)(P＜0.05).HK2与STAT3表达的相关性分析结果显示,在同一乙肝病毒感染的肝癌组织中STAT3的表达强度与HK2的表达强度一致;肝癌、丙肝、肝纤维化组织中STAT3的表达强度与HK2的表达强度差异具有统计学意义(P＜0.05).HK2的高表达与肝癌的分化无显著相关性.结论 HK2和STAT3的活化与乙肝病毒感染的肝癌发生和发展相关,在乙肝促肝癌的过程中HK2起到了重要作用,而STAT3被活化后定位于细胞核中,极有可能促进了HK2的表达.本研究提示HK2和STAT3在肝癌和乙肝病毒感染肝细胞的恶性转化过程中可能发挥重要作用,为肝癌的发生机制提出新的理论和作用靶位.
【期刊名称】《标记免疫分析与临床》
【年(卷),期】2018(025)008
【总页数】5页(P1218-1222)
【关键词】肝癌;病毒性肝炎;转录激活因子3 (STAT3);己糖激酶2(HK2)
【作者】李嫚;张铁英;晋瑞;刘正稳
【作者单位】西安市第三医院内科,陕西西安710018;西安市第三医院内科,陕西西安710018;西安交通大学医学院第二附属医院放射科,陕西西安710004;西安交通大学医学院第一附属医院传染科,陕西西安710061
【正文语种】中文
我国每年因肝癌死亡人数超过30万，占世界肝癌死亡人数的44%［1］。

乙型和丙型肝炎病毒的慢性感染是肝癌发生的重要因素［2］。

流行病学研究表明，乙型肝炎患者发生肝癌的危险性显著上升［3］。

近年来大量文献已证实，转录激活因子3（Signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）参与调控肿瘤的增殖、耐药等多种致病环节［4-5］。

已糖激酶2（Hexokinase 2，HK2）是肿瘤糖代谢研究领域的热点问题，可能受到STAT3相关信号转导通路中有关分子的调控［6］。

且HK2的表达与活性变化在病毒性肝炎和肝癌细胞中不仅改变了细胞有关糖代谢途径，并且该蛋白还有可能参与了细胞的增殖以及抗凋亡过程［6］。

但病毒性肝炎以及肝癌细胞中HK2与STAT3之间的表达分布关系及调控机制尚未经证实，本研究通过免疫组化方法探讨HK2、STAT3在病毒性肝炎和肝癌中组织中的表达分布状况，通过二者表达量的相关性分析，推导其在病毒性肝炎诱发肝癌中的可能机制。

材料与方法
1 组织芯片资料
组织芯片（厚度为4μm）为美国Biomax公司提供（LV801），肝硬化组织10例、正常肝组织10例，乙型病毒性肝炎所致肝癌10例和丙型病毒性肝炎所致肝
癌10例，以上共40例。

（注：乙肝和丙肝病例均为肝癌病例，肝纤维化病例为
乙肝病毒感染病例）。

2 免疫组织化学染色
兔抗人HK2抗体和小鼠抗人STAT3抗体均购自美国SANTA CRUZ公司。

主要免疫组化步骤：组织石蜡标本常规脱蜡水化，以0.01mol／L柠檬酸缓冲液（pH6.0）高压2min修复抗原，3%H202-甲醇封闭内源性过氧化物酶10min，PBS缓冲液振洗，加兔抗人HK2抗体（1∶100）或小鼠抗人STAT3抗体（1∶100），湿盒4℃冰箱过夜。

0.1%Tween-20的PBS振洗，滴加聚合物增强剂，室温孵育
20min。

用含0.1%Tween-20的PBS冲洗3次×5min。

滴加酶标抗鼠／兔聚合
物各室温孵育30min，DAB显色5min，然后用蒸馏水终止显色。

苏木素染色
2～5min，用盐酸酒精分化2s，蒸馏水冲洗10min。

依次70%，80%，90%，100%浓度乙醇梯度各5min，二甲苯2次×5min，晾干后中性树胶封片。

结果判断经过2位病理学专家观察免疫组化病理染色结果，对染色结果进行判断。

HK2和STAT3阳性表达部位位于细胞胞核和胞浆，呈棕黄色。

判断标准：着色肿瘤细胞＜5%为强度弱或阴性（-）；着色肿瘤细胞5% ～25%为染色强度弱或中
等强度（＋）；着色肿瘤细胞25% ～60%为染色强度中等或强（＋＋）；着色肿瘤细胞大于60%为染色强度为中等或强（＋＋＋）。

3 统计学方法
应用SPSS 17.0统计软件进行统计学分析。

不同组间表达率的比较采用Fisher exact Chi-square test，相关性分析采用McNemar，以P＜0.05作为具有统计
学意义。

结果
在乙肝病毒感染的肝癌组织中HK2的表达强度与STAT3的表达强度一致（P＝
0.141），结果显示乙肝病毒感染的肝癌组织中HK2表达上调（约50%染色强度
为＋＋～＋＋＋），显著高于肝癌（30%）、丙肝（10%）、肝纤维化（乙肝病
毒感染）（30%）以及正常组织（20%）（P＜0.05）。

STAT3在肝癌和肝纤维
化组织中表达略高。

免疫组化结果提示STAT3在乙肝病毒感染肝癌组织中主要分
布于细胞浆和胞核（90%），显著高于肝癌（65%）、丙肝（40%）、肝纤维化（乙肝病毒感染）（30%）以及正常组织（30%）（P＜0.05）。

见表1。

结果提示在乙肝病毒感染的肝癌组织中STAT3被活化后定位于细胞核中，极有可能促进
了HK2的表达，该结果与免疫组化染色结果相一致。

如图1所示，STAT3表达于胞浆的肝癌组织中，HK2表达水平较低，而当STAT3表达于胞浆和胞核的肝癌组织中，HK2表达水平则较高。

表1 HK2与STAT3在肝炎病毒感染以及肝癌和纤维化中的表达分析（n）注：* P ＜0.05表达强度 HK2 STAT3 P值肝癌（＋＋～＋＋＋） 6 17 0.001*（-～＋）
14 3乙肝（＋＋～＋＋＋） 5 9 0.141（-～＋） 5 1丙肝（＋＋～＋＋＋） 1 8 0.005*（-～＋） 9 2肝纤维化（＋＋～＋＋＋） 3 9 0.003*（-～＋） 7 1正常（＋＋～＋＋＋） 2 7 0.07（-～＋） 8 3合计60 60
图1 HK2与STAT3在肝癌组织中的表达注：A为肝癌组织中HK2表达于胞浆；B 为与A相同组织中STAT3表达于胞浆和胞核；C为肝癌组织中HK2表达于胞浆；D为与C相同组织中STAT3表达于胞浆
进一步统计分析了HK2与STAT3表达的相关性。

结果显示在同一乙肝病毒感染
的肝癌组织中STAT3的表达强度与HK2的表达强度一致；肝癌、丙肝、肝纤维
化组织中STAT3的表达强度与HK2的表达强度有显著差异（P＜0.05）；正常组织中STAT3的表达强度与HK2的表达强度差异不显著（P＝0.063）。

见表2。

表2 HK2与STAT3在肝炎病毒感染以及肝癌和纤维化中的表达相关性分析（n）
注：* P＜0.05；＆因例数为零无统计结果HK2（-～＋） HK2（＋＋～＋＋＋）
P值肝癌STAT3（-～＋） 3 0 0.001*（＋＋～＋＋＋） 11 6乙肝STAT3（-～＋）1 0 0.125（＋＋～＋＋＋） 4 5丙肝STAT3（-～＋） 2 0 0.016*（＋＋～＋＋＋） 7 1肝纤维化STAT3（-～＋） 0 0 ＆（＋＋～＋＋＋） 7 3正常（-～＋）
3 0 0.063（＋＋～＋＋＋） 5 2合计43 17
通过分析HK2与STAT3在肝癌中的表达及其与肿瘤分化之间的相关性，我们发
现HK2的高表达与肝癌的分化差异无统计学意义。

见表3。

表3 HK2与STAT3在肝癌中的表达及其与肿瘤分化相关性分析注：* P＜0.05肝
癌分化 HK2（＋＋～＋＋＋） P值 STAT3（-～＋）（＋＋～＋＋＋） P值II 6 2 0.109 1 7 0.18 III 8 4 2 10合计14 6 3 17
讨论
肝炎病毒感染是造成我国肝癌发生率在今后一个较长阶段内仍处于较高水平的重要原因［7］。

有研究报道乙型肝炎病毒基因的载量与肝癌的发生密切相关，国外研究也发现持续高水平的乙型肝炎病毒复制极易导致肝癌的发生［8-9］。

KUANG
等人发现，在肝炎病毒诱导的肝细胞癌中己糖激酶处于活化状态，提示在病毒性肝炎感染的过程中极有可能激活了己糖激酶，诱导肝细胞的糖代谢和细胞增殖发生异常，从而进一步导致了肝癌的发生［10］。

已证实，在肿瘤组织中STAT3处于持续活化状态，并在肿瘤的发生和发展过程中发挥重要作用。

近来研究结果提示HK 的生物学作用也受到了STAT3信号通路的调控［11］。

其中哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）／STAT3信号通路是与细胞增殖和凋亡关系密切的信号传导通路之一，参与调节细胞能量代谢，且该信号通路可促进肿瘤细胞内HK2表达的增加［12-13］。

但截止到目前尚未见STAT3与
HK2表达相关性在肝癌及病毒性肝炎的研究报道。

在本研究中肝纤维化组织为乙肝病毒感染的非癌组织，该组织中HK2的染色结果
与肝癌组织不同，可能提示在乙肝促肝癌的发生发展过程中HK2起到了极为重要
的作用，而在纤维化过程中HK2并未发挥重要功能。

同样，在丙肝病毒感染的肝
癌组织中也未观察到HK2的表达升高，可能与乙肝和丙肝病毒的致病机制不同有关。

本研究使用的肝癌组织为乙肝病毒和-丙肝病毒感染的肝癌组织的总和，乙肝
病毒感染的肝癌组织中STAT3的表达大多分布在胞浆和胞核中，而丙肝感染的肝
癌组织STAT3则较少发现分布在胞核中，以胞浆分布为主。

其中丙肝病毒感染肝
癌组织样本并未发现HKII表达的升高。

正常肝组织来源于肝癌的癌旁正常组织，
所以HK2的表达与STAT3的表达略有相关性，但不显著。

进一步分析HK2与STAT3表达的相关性，结果显示在同一乙肝病毒感染的肝癌组织中STAT3的表达强度与HK2的表达强度一致。

而肝癌、丙肝、肝纤维化组织中STAT3的表达强
度与HK2的表达强度有显著差异，提示在乙肝病毒感染的肝癌组织中HK2的表达极有可能受到STAT3的表达调控，STAT3的高表达可上调HK2的表达。

并且该
调控机制可能并未参与丙肝病毒感染导致的肝癌以及乙肝病毒感染导致的纤维化过程。

通过分析HK2与STAT3在肝癌中的表达及其与肿瘤分化之间的相关性，我
们发现HK2的高表达与肝癌的分化无显著相关性。

综上所述，在乙肝病毒感染的肝癌组织中HK2的表达与STAT3的表达强度和分
布有显著相关性，而在其它组织中尚未发现存在该分布特征。

但本研究中有关组织样本量较少，在后续研究中可进一步扩大乙肝病毒感染的肝癌组织样本量以深入探讨HK2的表达与STAT3表达在肝癌及其他肿瘤组织中的关系及可能的作用机制。

本研究提示STAT3可能参与调控肝癌糖代谢过程，且HK2对肝细胞恶性转化具
有潜在调节作用。

故本研究为临床相关疾病的研究和治疗提出新的潜在机制。

参考文献
【相关文献】
［1］CHEN W，ZHENGR，BAADE PD，et al.Cancer statistics in China，2015［J］.CA Cancer J Clin，2016，66（2）：115-132.
［2］PERZ J F，ARMSTRONG G L，FARRINGTON L A，et al.The contributions of hepatitis B virus and hepatitis C virus infections to cirrhosis and primary liver cancer worldwide ［J］.J Hepatol，2006，45（4）：529-538.
［3］EL-SERAG H B.Epidemiology of viral hepatitis and hepatocellular carcinoma ［J］.Gastroenterology，2012，142（6）：1264-1273.
［4］BOWMAN T，GARCIA R，TURKSON J，et al.STATs in oncogenesis［J］.Oncogene，2000，19（21）：2474-2488.
［5］KORTYLEWSKI M，JOVE R，YU H.Targeting STAT3 affects melanoma on multiple fronts［J］.Cancer Metastasis Rev，2005，24（2）：315-327.
［6］LIU Y H，WEI X L，HU G Q，et al.Quinolone-indolone conjugate induces apoptosis by inhibiting the EGFR-STAT3-HK2 pathway in human cancer cells［J］.Mol Med Rep，2015，12（2）：2749-2756.
［7］ZHU Q，LI N，ZENG X，et al.Hepatocellular carcinoma in a large medical center of China over a 10-year period：Evolving therapeutic option and improving survival ［J］.Oncotarget，2015，6（6）：4440-4450.
［8］SHIM J J，OH I H，KIM S B，et al.Predictive Value of Antiviral Effects in the Development of Hepatocellular Carcinoma in the General Korean Population with Chronic Hepatitis B［J］.Gut Liver，2016，10（6）：962-968.
［9］HUNG I F，WONG D K，POON R T，et al.Risk Factors and Post-Resection Independent Predictive Score for the Recurrence of Hepatitis B-Related Hepatocellular Carcinoma［J］.PLoS One，2016，11（2）：e0148493.
［10］KUANG Y，SCHOMISCH S J，CHANDRAMOULI V，et al.Hexokinase and glucose-6-phosphatase activity in woodchuck model of hepatitis virus-induced hepatocellular carcinoma［J］.Comp Biochem Physiol C Toxicol Pharmacol，2006，143（2）：225-231. ［11］LI Z，LI X，WU S，et al.Long non-coding RNA UCA1 promotes glycolysis by upregulating hexokinase 2 through the mTOR-STAT3／microRNA143 pathway
［J］.Cancer Sci，2014，105（8）：951-955.
［12］CALMETTESG，RIBALET B，JOHN S，et al.Hexokinases and cardioprotection ［J］.JMol Cell Cardiol，2015，78：107-115.
［13］DERON P，VERMEERSCH H，MEES G，et al.Expression and prognostic value of glucose transporters and hexokinases in tonsil and mobile tongue squamous cell carcinoma［J］.Histol Histopathol，2011，26（9）：1165-1172.。