微生物综合实验设计方案（1）4

微生物综合实验设计方案
第八小组第八小组 （曹婉仪（曹婉仪 蔡楚萍蔡楚萍 贝锦涛贝锦涛 张韵红）张韵红）
一、取样
取三个经高压蒸汽灭菌的锥形瓶，取三个经高压蒸汽灭菌的锥形瓶，于华师校园内湖中取水样。

于华师校园内湖中取水样。

为使取样具有
代表性和全面性，分别选取三个取样点，取样点1：湖的东面，取样点2：中间湖边，取样点3：湖的西面，分别编号1.2.31.2.3，于水面以下，于水面以下10cm 10cm，取水各，取水各100mL 100mL，，盖好瓶塞。

盖好瓶塞。

器具：三角瓶器具：三角瓶*3*3个
二、测水体pH 值
为了大致地确定水体微生物的生长适宜pH pH（个人感觉这说法有点奇怪，好（个人感觉这说法有点奇怪，好像暗示测出来的pH 就是适宜生长的pH 似的，至少改为：为了了解华师湖水的pH 吧，或者改为其他更好的说法），取好水样后，分别用pH 计测量三个水样的值，每个水样各测量三次，取平均值。

值，每个水样各测量三次，取平均值。

将三个水样混合均匀，得到混合水样，用pH 计测量pH 三次，取平均值。

三次，取平均值。

器具：器具：pH pH 计 三、分离提纯2
种微生物
1、材料：混合水样混合水样
2、方法
操作名称操作名称 具体步骤具体步骤
试剂和材料试剂和材料 器具（经器具（经高压高压蒸汽灭菌）蒸汽灭菌） 配置牛肉膏蛋白胨
固体培养基400mL 1、配置牛肉膏蛋白胨固体培养基
400mL 400mL，分装于两个三角瓶，分装于两个三角瓶，分装于两个三角瓶
2、高压蒸汽灭菌、高压蒸汽灭菌 （灭菌材料：250ml 三角瓶三角瓶*5*5*5，，培养皿*16*16，试管，试管，试管*11*11*11，，1ml 移液管
*5,*5,10mll 10mll 量筒*1） 3、倒16个平板个平板 4 4支试管斜面支试管斜面（按（按原来写的也要13个平板，怎么会是10个，而且还没有设置对照的平板；如果要作×10000，还要更多平板。

我觉得做15~20个平板比较好。

NaCl 2g 蛋白胨4g
牛肉膏1.2g 400mL 水 1mol/LNaOH
1mol/L HCI (pH7~7.6) 高压蒸汽高压蒸汽灭菌灭菌锅 天平天平 玻璃棒玻璃棒
500ml 大烧杯*1个
250ml 三角瓶*2个 封口膜封口膜*2*2张 绳子绳子*2*2条 培养皿16套 试管试管*4*4个 胶塞/棉塞*4个 报纸多张报纸多张
稀释涂布分离微生
物
1、取0.2ml 混合水样进行稀释，混合水样进行稀释，设设置四个梯度：原液、×置四个梯度：原液、×101010、×、×、×100100100、、混合水样混合水样 蒸馏水蒸馏水
恒温培养箱恒温培养箱
1ml 移液管*5
×10001000，分别装于，分别装于4个试管中，标明稀释度，每种稀释度5ml25ml2、涂布、涂布8个平板个平板
3、3737℃恒温培养箱中倒置培养℃恒温培养箱中倒置培养24h
空白平板空白平板*8*8个 个
10ml 量筒量筒
试管试管*4*4个酒精灯
酒精棉球酒精棉球 涂布器涂布器 标签纸标签纸
平板划线分离微生物
1、选取稀释涂布平板操作中分离程度较好的两种微生物的平板菌落，
进行平板划线，各划线2个平板个平板 2、3737℃恒温培养箱中倒置培养℃恒温培养箱中倒置培养24h 涂布分离的平板
空白平板空白平板*4*4个 恒温培养箱恒温培养箱 酒精灯酒精灯
酒精棉球酒精棉球
接种环接种环
标签纸标签纸
平板划线分离微生
物
1、两种微生物均选取划线操作效果好的菌落，进行第二次平板划线操作，各划线2个平板个平板
2、 37℃恒温培养箱中倒置培养24h 第一次划线分离的不同菌种的平板的平板*2*2个 空白平板空白平板*4*4个 恒温培养箱恒温培养箱
酒精灯酒精灯 酒精棉球酒精棉球
接种环接种环
标签纸标签纸
平板菌种接种到试管保藏管保藏
1、用接种环把菌种接种到试管斜面，每个菌种接种2个斜面个斜面
2、3737℃恒温培养箱中培养℃恒温培养箱中培养24h
3、待菌种在固体斜面培养基上生长丰满后，注明菌类或菌种名、保藏日期、保藏人，然后置于4~84~8℃的冰℃的冰箱中保存箱中保存
第二次划线分离的不同菌种的平板的平板*2*2个 空白斜面培养基*4个 恒温培养箱恒温培养箱 冰箱冰箱
酒精灯酒精灯
酒精棉球酒精棉球 接种环接种环 标签纸标签纸
四、革兰氏染色
细菌的革兰氏染色细菌的革兰氏染色
1.1.实验材料实验材料实验材料
1.1材料材料
第二次划线分离的不同菌种的平板第二次划线分离的不同菌种的平板第二次划线分离的不同菌种的平板*2*2个 1.2试剂：试剂：
无菌水、结晶紫、碘液、无菌水、结晶紫、碘液、无菌水、结晶紫、碘液、95%95%95%乙醇、番红乙醇、番红乙醇、番红 1.3器具器具
载玻片、接种环、酒精灯载玻片、接种环、酒精灯载玻片、接种环、酒精灯 2.2.实验方法实验方法实验方法 步骤序号步骤序号 操作名称操作名称 操作方法
1 制片
①涂片：滴1滴无菌水于载玻片，挑取少许菌体与水滴均匀混合少许菌体与水滴均匀混合 ②干燥：火焰上方略加温②干燥：火焰上方略加温
③固定：用加热法，通过火焰3次
2 染色
结晶紫初染1min 1min，，水洗；碘液媒染1min 1min，，水洗；水洗；95%95%95%乙醇脱色乙醇脱色20~30s 20~30s，水洗；番，水洗；番红复染1min 1min，水洗，水洗 3
镜检
显微镜油镜观察
五、观察细菌的形态特征
在高倍镜和油镜下观察细菌形态，拍下照片，画图，描述形态特征
器具：显微镜器具：显微镜
六、生理生化试验（淀粉水解、糖酵解）
（1）淀粉水解实验
(2)(2)糖酵解实验糖酵解实验糖酵解实验 1 1 实验材料实验材料实验材料 1.1实验材料实验材料
第二次划线分离的不同菌种的平板第二次划线分离的不同菌种的平板第二次划线分离的不同菌种的平板*2*2个、空白平白个、空白平白*1*1个、试管个、试管*5*5个 1.2实验试剂实验试剂
卢卡氏碘液卢卡氏碘液, , , 葡萄糖发酵培养基试剂葡萄糖发酵培养基试剂葡萄糖发酵培养基试剂[[蛋白胨0.1g,NaCl 0.25g, K 2HPO 4 0.01g,0.01g,水水 50ml, 50ml,溴麝香草酚蓝溴麝香草酚蓝（1%1%水溶液）水溶液） 0.15ml 0.15ml，，葡萄糖葡萄糖 0.5g] 0.5g] 1.3实验器具实验器具
恒温培养箱、酒精灯、酒精棉球、接种环、标签纸恒温培养箱、酒精灯、酒精棉球、接种环、标签纸恒温培养箱、酒精灯、酒精棉球、接种环、标签纸 2 2 实验方法实验方法实验方法
操作名称操作名称
实验方法实验方法
接种接种 以无菌操作技术，把两个菌种接种到同一个平板上，划成“+”字
形，平板的一边接一个种
培养培养
在平皿底部做好记号，盖上盖，在平皿底部做好记号，盖上盖，373737℃恒温培养箱中倒置培养℃恒温培养箱中倒置培养24h
检验检验
平皿盖打开，滴加卢卡氏碘液于接种处平皿盖打开，滴加卢卡氏碘液于接种处
记录结果记录结果
有水解圈：淀粉水解实验阳性，用有水解圈：淀粉水解实验阳性，用++表示；无水解圈：淀粉水
解实验阴性，用解实验阴性，用--表示表示
操作名称操作名称
操作方法操作方法
配置糖发酵培养基配置糖发酵培养基 配置葡萄糖发酵培养基50ml,50ml,分装分装5支试管中，高压蒸汽灭菌支试管中，高压蒸汽灭菌
接种接种
取葡萄糖发酵培养基试管3支，支，分分别接入两种菌种，别接入两种菌种，用标签纸标明菌类或用标签纸标明菌类或菌名、发酵培养基名称，第3支不接种，作为对照。

接种后，轻摇试管，使混合均匀均匀
培养培养 3737℃恒温培养箱中静止培养℃恒温培养箱中静止培养24h 观察观察
记录结果：黄色、有气泡：产酸产 气，用0表示表示
黄色、无气泡：产酸不黄色、无气泡：产酸不产气，用产气，用++表示表示
紫色、无气泡：不产酸紫色、无气泡：不产酸不产气，用不产气，用--表示表示
配置糖发酵培养基：分别称取蛋白胨和NaCl 溶于热水中，调pH 至7.47.4，再，再
加入溴麝香草酚蓝（先用少量95%95%乙醇溶解后，再加水配成乙醇溶解后，再加水配成1%1%水溶液）水溶液）
，加入糖类，分装试管，装量4~5cm 高，并倒放入一德汉氏小管（管口向下，管内充满培养液）。

115115℃湿热灭菌℃湿热灭菌20min 20min。

灭菌时注意适当延长煮沸时间，尽量把冷空气排。

灭菌时注意适当延长煮沸时间，尽量把冷空气排尽，以使德汉氏小管内不存在气泡。

常用的糖类：如葡萄糖、蔗糖、甘露糖、麦芽糖、乳糖、半乳糖等（后两种糖的用量常加大为1.5%1.5%））
七、配置菌悬液
八、探究pH 对细菌生长的影响
1）第一次测量分光光度值）第一次测量分光光度值 (1)(1)材料：上述菌悬液材料：上述菌悬液材料：上述菌悬液 (2)(2)试剂试剂试剂:1mol/L :1mol/L NaOH NaOH 或或1mol/L HCL 调至pH 分别为3、4、5、6、7、8、9牛肉膏蛋白胨液体培养基，自来水（需要热水溶解牛肉膏）。

(3)250ml 三角瓶7个，试管7支，配置牛肉膏蛋白胨液体培养基7个，个，pH pH 计，大烧杯（是否需要校准），恒温摇床。

，恒温摇床。

(4)(4)步骤步骤步骤: : 操作操作
试剂或用具试剂或用具
配置牛肉膏蛋白胨液体培养基配置牛肉膏蛋白胨液体培养基
NaCl 8g NaCl 8g 蛋白胨蛋白胨16g 16g 牛肉膏牛肉膏4.8g 无菌生理盐水1600ml 7个250ml 三角瓶 试管7支 ，每个三角瓶中倒入200ml 液体培养基，其余分装试管（约25ml/25ml/支）支）支）
调pH 值
1mol/l NaCl 或 HCI 溶液溶液 pH pH 计
包扎培养基并且灭菌包扎培养基并且灭菌 高压灭菌锅121摄氏度20min 接种（无菌操作）：移液管移取0.5ml 菌悬液于不同pH 的三角瓶中的三角瓶中 移液管移液管 吸气球吸气球 牛肉膏蛋白胨液体培养基养基
置于37度恒温箱中培养24h 恒温摇床恒温摇床
测分光光度值测分光光度值
分光光度计OD600 记录数据并且描绘关系图记录数据并且描绘关系图
2）第二次测量分光光度值）第二次测量分光光度值 (1)(1)材料：重新配置的菌悬液材料：重新配置的菌悬液材料：重新配置的菌悬液
(2)(2)试剂试剂试剂:1mol/L NaOH :1mol/L NaOH :1mol/L NaOH 或或1mol/L HCL 调至pH 分别为6、6.46.4、、6.86.8、、7.27.2、、7.67.6、、8(8(假设假设1)1)中最适中最适pH 为7)7)牛肉膏蛋白胨液体培养基，牛肉膏蛋白胨液体培养基，自来水（需要热水溶解牛肉膏）。

(3)250ml 三角瓶5个，试管5支，配置牛肉膏蛋白胨液体培养基5个，个，pH pH 计，大烧杯（是否需要校准），恒温摇床。

，恒温摇床。

(4)(4)步骤步骤步骤: : 操作操作 试剂或用具试剂或用具 配置牛肉膏蛋白胨液体培养基配置牛肉膏蛋白胨液体培养基
NaCl NaCl 5.5g 5.5g 5.5g 蛋白胨蛋白胨11g 11g 牛肉膏牛肉膏3.3g 3.3g 无无
菌生理盐水1100ml 5个250ml 三角瓶三角瓶 试管5支 ，每个三角瓶中倒入200ml 液体培养基，其余分装试管（约20ml/支）支）
调pH 值
1mol/l NaCl 或 HCI 溶液溶液 pH pH 计 包扎培养基并且灭菌包扎培养基并且灭菌
高压灭菌锅121摄氏度20min
接种（无菌操作）：移液管移取0.5ml 菌悬液于不同pH 的三角瓶中的三角瓶中 移液管移液管 吸气球吸气球 牛肉膏蛋白胨液体培养基养基 置于37度恒温箱中培养24h 恒温摇床恒温摇床 测分光光度值测分光光度值
分光光度计OD600 记录数据并且描绘关系图记录数据并且描绘关系图
附：附：
（1） 牛肉膏蛋白胨液体培养基的：牛肉膏3g 3g，，蛋白胨10g 10g，，NaCl 5g 5g，，水1000ml 1000ml，，
pH7~7.6
（2） 淀粉培养基：蛋白胨10g 10g，，NaCl NaCl 5g 5g 5g，牛肉膏，牛肉膏5g 5g，可溶性淀粉，可溶性淀粉2g 2g，蒸馏水，蒸馏水
1000ml 1000ml，琼脂，琼脂15~20g 15~20g，，121摄氏度灭菌20min 20min。

（3） 糖发酵培养基：蛋白胨0.2g 0.2g，，NaCl 0. 5g NaCl 0. 5g，，K 2HPO 4 0.02g 水100ml 100ml，溴麝，溴麝
香草酚蓝（香草酚蓝（1%1%1%水溶液）水溶液）水溶液）0.3ml 0.3ml 0.3ml，糖类，糖类1g 1g。

分别称取蛋白胨和氯化钠溶于热。

分别称取蛋白胨和氯化钠溶于热水中，水中，调调pH 至7.47.4，，再加入溴麝香草酚蓝再加入溴麝香草酚蓝（先用少量（先用少量95%95%乙醇溶解后，乙醇溶解后，乙醇溶解后，再再
加水配成1%1%水溶液）水溶液）
，加入糖类，分装试管，装量4~5cm 高，并倒放入一德汉氏小管（关口向下，管内充满培养液）。

115摄氏度湿热灭菌20min 20min。