SYBRGreen实时定量PCR检测转基因大豆中外源基因拷贝数

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SYBR Green 实时定量PCR 检测转基因
大豆中外源基因拷贝数
冀志庚，高学军*，敖金霞，张明辉，霍楠
（东北农业大学生命科学与生物技术研究中心，哈尔滨
150030）
摘要：采用SYBR Green Ιreal-time PCR 方法检测转基因大豆中外源基因35S 边界基因的拷贝数，以大豆凝
集素基因（Lectin ）作为内参照基因，以转基因大豆基因组DNA 为内参照基因标准品，初始浓度为0.43μg ·μL -1，进行5倍梯度稀释得到内参照基因C T 值与起始模板量的相关性标准曲线：y =-2.9915x +22.3321，R 2=0.996；以含35S 边界序列的质粒DNA 为目的基因为标准品，初始浓度为0.64μg ·μL -1，同样进行5倍梯度稀释，建立目的基因C T
与起始模板量的相关性标准曲线：y =-3.4021x +17.7219，R 2=0.999。

通过SYBR Green Ιreal-time PCR 获得样本中目的基因和内参基因的C T 值，将C T 值分别代入标准曲线计算该样本中内参基因和目的基因起始模板量，目的基因与内参基因起始模板量比值即是目的基因在该转基因中的拷贝数。

计算结果为4份样品中，2个拷贝的1个，3个拷贝的3个。

关键词：real-time PCR ；SYBR Green Ι；转基因大豆；拷贝数；Lectin ；35边界序列中图分类号：S565.1；Q78
文献标志码：A
文章编号：1005-9369（2011）10-0011-05
Establishment of SYBR Green-base quantitative real-time PCR assay for determining transgene copy number in transgenic soybean/JI Zhigeng,
GAO Xuejun,AO Jinxia,ZHANG Minghui,HUO Nan(Life Science and Biotechnique Research Center,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China)
收稿日期：2010-10-28
基金项目：国家转基因重大专项课题（2008ZX08012-001）
作者简介：冀志庚（1984-），男，硕士研究生，研究方向为转基因作物检测。

E-mail:hanbo001@/doc/3416717608.html *通讯作者：高学军，教授，博士生导师，研究方向为转基因检测。

E-mail:gaoxj5390@/doc/3416717608.html Journal of Northeast Agricultural University
东北农业大学学报第42卷第10期42(10):11~15
2011年10月
Oct.2011
实时荧光定量PCR 技术是一种新的DNA 定量方法[1]。

其定量的基本原理是在PCR 反应体系中加入非特异性的荧光染料（如SYBR Green ）或特异性
的荧光探针（如Taqman 探针）[2]，实时检测荧光量的
变化，获得不同样品达到一定的荧光信号（阈值）时所需的循环次数—C T 值（Cycle threshold ）；根据C T 值与起始模板数的对数值成反比线性关系的原
理，制作标准曲线，就可知道基因线，获得C T 值与起始模板数的相关性方程，将样品的C T 值代入该方程就可获得目的基因的起始模板数，通过与大豆内源参照基因起始模板数的比较，就可知道基因组中该外源基因拷贝数[3]。

本研究以抗草甘膦（CP 4-EPSPS ）转基因大豆为材料，以CaMV35S 边界序列为外源基因，避免以CaMV35S 和nos 为外源基因出现假阳性。

选择大豆凝集素基因（Lectin ）作为内源参照基因进行拷贝数估算，通过SYBR Green Ι实时荧光定量PCR 法检测转基因大豆中CaMV35S 基因的拷贝数。

1材料与方法
1.1
材料
转基因杂交大豆（由东北农业大学大豆研究所提供），非转基因大豆（购自某超市）；阳性质粒（本实验室构建）；TaKaRa LA PCR in vitro Cloning Kit （Code No.:DRR015）SYBR Premix EX Taq TM （Code No.:DRR041S ）购自大连宝生物工程有限公司；ABI 实时定量荧光PCR 仪（ABI7300），96孔扳（AXYG-EN ）。

1.2
方法
1.2.1DNA 提取
转基因大豆基因组DNA 采用CTAB 法提取[4]，用
分光光度计检测DNA 含量及纯度。

内参基因标准品选用转基因大豆基因组DNA ，浓度为0.43μg ·μL -1，稀释倍数分别为50、5-1、5-2、5-3和5-4。

以含35S 边界序列的质粒DNA 为标准品，浓度为0.64μg ·μL -1，稀释倍数分别为50、5-1、5-2、5-3和5-4。

以Lectin 作为大豆的内参基因，以含35S 边界序列的质粒DNA 为阳性对照，未转基因大豆为阴性对照，水为空白对照。

1.2.2CaMV35S 边界序列的获得
以转基因大豆基因组DNA 为模板，利用染色
体步行法（TaKaRa LA PCR in vitro Cloning Kit ）扩增CaMV35S 上游序列。

通过测序获得CaMV35S 上游
大豆基因组序列。

根据获得的序列设计特异性引物，构建pMD18-T 阳性质粒载体。

1.2.3引物设计及合成
转基因大豆内、外源基因的引物由Invitrogen
公司合成。

引物序列见表1。

1.2.4PCR 反应体系和程序
定量PCR 反应体系：SYBR Premix EX Taq TM
（2×）10μL ，PCR 上游引物（10μmol ·L -1）0.4μL ，PCR 下游引物（10μmol ·L -1）0.4μL ，ROX Re-ference Dyer （50×）0.4μL ，模板2.0μL ，灭菌蒸馏水6.8μL ，总体积20μL 。

PCR 程序（采用两步法PCR 扩增程序）：预变
性95℃30s ；95℃5s ，60℃31s ，40个循环。

5个不同稀释度的内参照基因标准品，5个不同稀释
Abstract:SYBR Green Ιreal-time PCR was developed to determine copy number of exogenous 35S/plant
gene in transgenic soybean.A conserved soybean housekeeping gene,Lectin was used as an internal contral and 5times diluted soybean genome DNA was used as an initial template copy of Lectin .So y =-2.9915x +22.3321,R 2=0.996,the standard curves of the cycle threshold (C T )relative to the log of each initial template copy of Lectin was obtained.In the same way,the standard curves of 35S/plant y =-3.4021x +17.7219,R 2=0.999,was obtained using 5times diluted plasmid DNA which contains 35S/plant gene.By SYBR Green Ιreal-time the C T values of Lectin and 35S/plant gene in each transgenic soybean was got,the transgene copy number was calculated by comparing the initial template copy of 35S/plant to Lectin gene in the same transgenic soybean.It concluded that among four PCR putative transgenic plants:one had two copies,and the other had three copies,respectively.
Key words:real-time PCR;SYBR Green Ι;transgenic soybean;copy number;Lectin ;injection sequence of
35S
东北农业大学学报·12·第42卷
度带有目的片段的质粒DNA ，空白对照同时进行扩增，均设3个平行。

1.2.5Lectin 基因和35S/plant 标准曲线的制作
Lectin 基因标准曲线的制作是将大豆基因组
DNA 做50、51、52、53和54倍稀释，并以这些稀释
的DNA 进行PCR ，得到各自的C T 值，通过C T 值与起始模板
数的对数值之间存在的线性关系，获得标
准曲线。

含有目的片段的质粒DNA 标准曲线的制作是将质粒DNA 做50、51、52、53和54的梯度稀释，用与Lectin 同样的方法获得标准曲线。

M 1
234
500bp 200bp M-DL2000分子质量标准；1~2-阳性子；3-阳性对照；4-阴性对照
M-DL2000DNA Marker;1-2-Positive sample;3-GM soybean;4-no-GM soybean
图1阳性质粒pMD18-T35S 阳性克隆PCR 鉴定Fig.1PCR assay of plamisd pMD18-T35S
100bp
750bp 1000bp 2000bp 表1
实时定量PCR 引物序列
Table 1Primer sequence for real-time quantitative PCR
名称Name
35S/plant-F 35S/plant-R Lectin -F Lectin -R
引物方向（5'-3'）Primer sequence
CATAGGGAACCCAAATGGAAAA CGGCAGAGGCATCTTCAAC CCAGCTTCGCCGCTTCCTTC
GAAGGCAAGCCCATCTGCAAGCC
扩增片段（bp ）Amplification fragment
9074
2
结果与分析
2.1
阳性质粒标准品的鉴定
质粒pMD18-T35S 克隆阳性子以PCR 的方式进
行鉴定，引物序列如下：大豆基因组引物：
ACCCTTCAATTTAACCGAT GCT
35S 引物：TCCATCTTTGGGACCACTGTCG
PCR 反应程序：95℃，2min ；95℃，30s ；
58℃，30s ；72℃，30s ；35个循环。

PCR 结果见图1。

2.2标准曲线的制作
用转基因大豆基因组DNA 做内参基因标准
品，以含35S/plant 基因的质粒作为外源基因标准
品进行梯度稀释，得到标准曲线。

以C T 值为Y 轴，
以起始模板拷贝数的对数为x 轴，分别建立标准曲线。

数据由ABI7300自带软件分析，由分析结果可知，模板C T 值与该模板起始浓度存在线性关系，横坐标为标准品浓度的对数值，纵坐标为循环数。

Lectin 内参基因标准曲线为y =-2.9915x +22.3321，R 2=0.996；35S/plant 基因的标准曲线为y =-3.4021x +17.7219，R 2=0.999。

2.3
熔解曲线的分析
SYBR Green 是一种双链DNA 结合染料，可以
结合于所有双链DNA 双螺旋小沟区域中并受激发
产生绿色荧光的能力。

因此在PCR 扩增中没有特异性，所以在进行实时荧光定量时，一般通过熔解曲线来分析其扩增特异性。

理想的溶解曲线荧光是单峰型曲线，如果出现两个或两个以上的峰，说明有引物二聚体等非特异性扩增。

本试验的溶解曲线如图2、3所示，图2中Lectin 基因的扩增溶解曲线为单峰，图3中35S/plant 基因的扩增溶解曲线也为单峰，在PCR 过程中都没有非特异性条带出现，由此推断定量PCR 扩增所获得的数据是可靠的。

2.4相对定量法计算转基因大豆中35S/plant 基因的拷贝数
在本试验中，选取4份PCR 检测为阳性的转基
因大豆，利用CTAB 法提取基因组，每个样品做3
个重复，定量PCR 反应，获得扩增曲线，荧光阈值的设定与制作标准曲线时相同，获得待测样品的C T 值（见表2）。

表3为根据PCR 结果得出检测样本中C T 值，代
冀志庚等：SYBR Green 实时定量PCR 检测转基因大豆中外源基因拷贝数第10期·13·
表2
待测样本中内参基因、外源基因的C T 值及T m 值
Table 2
C T and T m values of Lectin and 35S/plant genes in transgenic soybean
转基因株系
Transgenic line
1234
阴性对照Negative control
空白Blank
凝集素基因Lectin
循环阈值Cyclethreshold (C T )
27.0025.1524.5725.16N/A N/A
温度（℃）T m
82.282.782.582.5N/A N/A
35S/植物基因35S/plant
循环阈值Cyclethreshold (C T )
27.4726.8826.2926.25N/A N/A
温度（℃）T m
81.481.781.781.4N/A N/A
表3转基因植株中外源基因拷贝数的估算
Table 3
Estimation of copy number of 35S/plant gene in each transgenic line
转基因株系Transgenic line
1234
35S/plant 基因计算结果Calculation result of
35S/plant
-2.8653-2.6918-2.5184-2.5067
凝集素基因计算结果Calculation result of
Lectin gene
-1.5606-0.9422-0.7483-0.9456
35S-植物基因/凝集素基因35S-plant/Lectin
1.83
2.85
3.362.65
拷贝数Copy number
2333
入标准曲线分别计算源基因Lectin 和外源基因35S/plant 的起始模板数，由外源基因相对于内参基因
的比值估算拷贝数。

经估算4份样品中2个拷贝的为1个，3个拷贝的为3个。

图2内参基因标准品中Lectin 基因的溶解曲线
Fig.2
Dissociation curve of Lectin gene
温度（℃）T emperature 0.450.40
0.350.300.250.200.150.100.050.00
-0.05
相对荧光强度的对数值
D e r i v a t i v
e
图335S/plant 基因标准品的溶解曲线
Fig.3Dissociation curve of 335S/plant
温度（℃）T emperature
0.50
0.400.300.200.100.00
-0.10
相对荧光强度的对数值
D e r i v a t i v e
3讨论
目前在转基因植株中用于确定外源基因拷贝数的方法多见于Southern blot 、CGH 、FISH 、Micro-array 等方法。

传统的方法耗时多、价格昂贵，
Taqman 探针法也可用于确定外源基因的拷贝数[5]，我国已经初步建立了以Taqman 为探针的荧光定量PCR 法，在部分口岸已进行转基因产品的定量检测，目前Taqman 探针已经被用在转基因农作物或初加工制品（玉米、棉花、水稻、大豆、烟草、豆
东北农业大学学报·14·第42卷
粉）进行定量检测，检测灵敏度均达到了0.1%[6]。

探针的设计和试剂的应用仍限制此方法的应用。

目前用SYBR Green荧光染料的实时定量PCR方法检测转基因植株外源基因拷贝数的报道很少[7]。

SYBR Green有荧光染料的价格相对比较便宜，可以识别任意的DNA双链，具有广泛的通用性[8]。

与Southern blot相比[9]，SYBR Green检测转基因拷贝数的结果有时不一致。

主要表现为荧光定量PCR法检测的转基因外源拷贝数常多于Southern blot结果[10-11]。

这可能是由多种原因造成的，从试验原理上来说，荧光定量PCR的高灵敏性所得到的结果更接近于客观事实。

因为SYBR Green燃料可以结合任何双链DNA，因此在PCR过程中可能会出现假阳性植株，为了能有效检测转基因植株中的外源基因，可以采用四步法来消除假阳性，即在检测荧光信号前选用介于引物二聚体T m值和特异产物T m值之间的中间温度84℃进行读板，消除了因无二聚体产生的荧光喜好引起的试验误差，消除假阳性植株。

利用实时荧光定量PCR法来检测外源基因的拷贝数是近几年迅速发展起来的新方法，它以快速、安全、成本低等优点渐渐取代了代价
昂贵、操作复杂的Southern blot等传统方法[12]。

目前已经建立了大豆、玉米、水稻等转基因作物的Taqman探针法检测外源基因拷贝数。

但是Taqman探针的设计也是很昂贵的，不适合大范围的推广，本研究利用SYBR Green法所具有的非特异性和试剂价格低廉的优势，将DNA双链结合染料应用实时荧光定量PCR测定外源基因拷贝数的研究中，建立一种高效并且价格低廉的检测外源基因拷贝数的方法来用于各种研究。

4结论
SYBR Green检测转基因大豆的外源基因的拷贝数具有快速、简便、准确的优点，同时试剂相对便宜，可以作为检测转基因作物外源基因拷贝数的选择。

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