侵袭性真菌病的诊断_现状与展望

DOI:10.13346/j.mycosystema.2011.01.023
M ycosystema ●贺三十周年约稿●
菌 物 学 报15 January 2011, 30(1): 5-11
jwxt@
ISSN1672-6472 CN11-5180Q
©2011 Institute of Microbiology, CAS, all rights reserved.
侵袭性真菌病的诊断：现状与展望
廖万清* 陈敏
上海市医学真菌分子生物学重点实验室 中国人民解放军真菌病重点实验室 第二军医大学附属长征医院皮肤科 上海 200003
摘 要：近二十年来，医学科学很多领域都取得重大进步。

但全球范围内，侵袭性真菌病的发病率及死亡率却仍明显上升，严重威胁人类健康。

侵袭性真菌病发病隐匿、临床表现不典型、治疗手段有限、病死率与致残率高，早期、特异的诊断对于改善预后意义重大。

目前，以培养、病理为代表的形态学诊断方法虽有局限，但仍是侵袭性真菌病诊断的金标准；以G试验、GM试验、高分辨率CT为代表的新兴血清学及影像学诊断方法值得在临床大力推广；而以PCR技术为基础的核酸诊断技术方法前景光明，但其临床应用之路却仍任重而道远。

联合使用并不断改良现有培养、病理等形态学诊断方法、血清学方法及先进影像学技术是提高侵袭性真菌病诊断水平的现实最佳途径。

关键词：侵袭性真菌病，诊断
The diagnosis of invasive fungal diseases: current status and future perspectives
LIAO Wan-Qing*CHEN Min
Shanghai Key Laboratory of Medical Molecular Mycology & PLA Key Laboratory of Fungal Diseases, Department of Dermatology, Changzheng Hospital, Second Military Medical University, Shanghai 200003, China
Abstract: During the last 20 years, significant progress had generated in numerous regions of medical science. However, the worldwide incidence or mortality of invasive fungal diseases (IFDs) are still increasing remarkably, and being a serious threat to human health. Absence of typically clinical manifestations and optimal therapy options of IFDs lead to high mortality and morbidity of these infections worldwide. So earlier and specific diagnosis can distinctly improve the prognosis of IFDs. Despite the limitations of the morphological methods, represented by culture or pathology, they are still the gold standard of diagnostic invasive fungal diseases at present. The serological and imaging test such as G/GM test or high resolution CT deserved to be vigorously promoted in the clinical diagnosis; Although its clinical application is still long way to go, nucleic acid diagnostics based on PCR
基金项目：国家自然科学基金（No. 81071335）
*Corresponding author. E-mail: liaowanqing@
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technology is likely to have a bright perspectives. Currently, combination and improvement of the current methods such as morphological methods, serological methods and advanced imaging technology is the best and most realistic approach to the diagnosis of IFDs in clinics.
Key words: invasive fungal diseases, diagnosis
真菌（Fungi ）是具有真正的细胞核、能产生孢子、不含叶绿素、以寄生或腐生方式吸收营养、能进行有性和（或）无性繁殖、具有几丁质细胞壁的真核细胞生物。

真菌广泛分布于自然界，与人类生产生活关系密切。

据估计，自然界中存在的真菌约有150万种（Hawksworth 1991），到2008年已知的种类约有9万8千种（Kirk et al . 2008），中国目前报道的真菌有1万4千种（戴玉成和庄剑云2010）。

其中绝大部分对人类有益，但也有约300余种可感染人类导致严重疾病（廖万清和吴绍熙2006）。

侵袭性真菌病（Invasive fungal diseases ，IFDs ）系指病原真菌侵犯心、肝、脾、肺、肾、脑、血液等各系统内脏器官而引起的系统感染性疾病。

近二十年来，IFDs 的发病率及死亡率在全球范围内呈持续上升趋势（Denning et al. 2003；Pfaller et al. 2006；Antinori et al. 2009）。

免疫抑制剂、各种置管技术的广泛使用及HIV 在全球的持续蔓延是导致发病率持续上升的主要原因，其中白念珠菌与烟曲霉是IFDs 最常见的病原真菌，约占70%－80%（Baddley et al. 2001；Marr et al. 2002；Wisplinghoff et al. 2004；Antinori et al. 2009）。

1995－2002年美国49所医院连续7年的监测资料表明，念珠菌败血症在医院感染性败血症中居第4位，病死率则居首位（Wisplinghoff et al. 2004）
；而中国医院感染监测网数据则显示IFDs 现已成为我国院内感染第2位的重要组成（约占24.1%）。

IFDs 预后凶险且给患者带来沉重额外经济负担，如侵袭性曲霉病（Invasive aspergillosis ，IA ）死亡率可达58%（Lin 2001）；目前在美国因侵袭性曲霉感染或复发而导致的额外经济负担平均高达96,731美元（Tong et al. 2009）。

IFDs 起病隐匿、临床表现不典型且常被基础疾病症状所掩盖，有尸检研究发现IFDs 患者生前确诊率
仅17.3%（Gonzalez et al. 1999）。

实际上，IFDs 早期诊断与治疗预后密切相关，目前困扰临床医生最大的问题就是IFDs 缺乏理想的诊断学技术方法，往往使患者失去最佳治疗时机（Garey et al. 2006；Morrell et al. 2005），临床医生常被迫采取抢先治疗方案，但这又易产生耐药菌株并加重损伤患者肝肾功能。

因此，如何推动侵袭性真菌病诊断的研究，及时开发出快速、特异且易于操作的诊断技术方法是目前医学真菌学研究迫切需要解决的问题，也是当前国内外真菌病研究领域的热点。

故笔者现对当前国内外侵袭性真菌病的诊断现状及进展做一述评。

1 侵袭性真菌感染诊断研究的现状
由于侵袭性真菌病临床表现及体征不典型，且常被基础疾病掩盖，因此其诊断主要依赖于实验室诊断。

2002年欧洲癌症研究和治疗组织/侵袭性真菌感染协作组和美国国立变态反应和感染病研究院真菌病研究组共识组（EORTC/MSG ）共同发表了IFDs 定义，该定义根据真菌感染的可能性将诊断分为三个级别，即确诊、拟诊和疑似，并由宿主因素、临床标准、微生物学标准、确诊标准四个部分构成其诊断标准。

此后该定义开始在全世界推广，我国在2005－2007年先后颁布的三项IFDs 诊治指南（血液、呼吸、ICU ）均是基于EORTC/MSG 的定义之上。

2008年该专家组根据反馈意见再次对IFDs 定义进行了修订和更新（De et al. 2008），其诊断标准更加精炼，实用性强。

目前，侵袭性真菌病的诊断技术仍以形态学为基础的镜检、培养及组织病理学检查等技术方法作为IFDs 诊断的基石和金标准（Denning et al. 2003）。

镜检是侵袭性真菌感染实验室检查的基本方法，包括直接镜检和染色镜检，是最简单、直接与
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实用的真菌实验室诊断技术方法。

人体无菌部位样本阳性结果可确定真菌感染，但阳性率低，阴性结果不能排除诊断，需结合培养检查结果。

如在脑脊液等无菌体液发现真菌常可明确诊断，但在采自口腔、阴道等有菌部位的临床标本只有镜检发现大量菌丝或假菌丝才有诊断意义。

有经验的技术人员一般可通过镜检区分念珠菌、隐球菌、毛霉等真菌感染。

培养是真菌病实验室检查的经典方法，培养时间一般为2－4周，个别生长缓慢的真菌如组织胞浆菌等则需要更久；根据不同的真菌选择相应的培养基；有时温度也可作为鉴定真菌种属的手段之一，如马内菲青霉等双相真菌在不同的温度形成的菌落形态不同，烟曲霉可在45℃生长等。

真菌的培养方法可分为试管法、平皿法和玻片法（小培养），其中试管培养是临床上最常用的培养方法之一，主要用于临床标本分离的初代培养，平皿培养主要用于纯菌种的培养及研究，玻片培养则主要用于菌种鉴定。

培养检查的目的是为了进一步提高对病原体检出的阳性率，以弥补直接镜检的不足，同时在培养过程中可对真菌的形态、镜下结构、生理特点和生化特性进行充分研究，以了解其全部生活史，研究其科、属和种的分类学地位，指导临床治疗。

但如果培养分离出条件致病菌，应结合临床进行判断：若标本来源于无菌的密闭体腔或组织液如脑脊液等常可确定的真菌侵袭性感染，但对脓液、痰、粪便等标本则应谨慎解释结果，一次培养阳性往往不能确定诊断，必要时需结合直接镜检的结果。

鉴于目前条件致病性真菌感染不断增加的现状，难以排除少见真菌引起感染的可能性。

因此，在没有经过认真分析之前，任何一株培养物都不可被视为污染菌。

目前，酵母菌鉴定体系相对比较成熟规范，主要从形态学特征和生理学特征两方面来鉴定。

国内外临床真菌实验室已普遍采用商品化的API-20C 试剂盒及科玛嘉念珠菌显色培养基来鉴定酵母菌，可以较好的满足临床需求。

需要指出的是，一些显色培养基往往对白念珠菌和几种常见的念珠菌鉴定
比较可靠，而对少见菌种则需要几种方法相互验证。

然而，早期、特异地诊断病原真菌一直是临床IFDs 实验室诊断的难点（Patterson 2005；Lai et al. 2008），因为在IFDs 发病早期阶段，培养结果常为阴性（Alexander & Pfaller 2006；Borst et al . 2001），如侵袭性念珠菌病早期血培养阴性率可达65%（Borst et al . 2001）。

而烟曲霉等丝状真菌的鉴定对技术人员的知识储备和经验要求高，不仅需要熟练掌握各种病原丝状真菌的菌落形态、镜下形态和产孢方式，具体鉴定时还需查阅参考大量文献及专业书籍，有时还需要花费数周时间重复多次培养才能得到正确鉴定结果。

组织病理学检查对IFDs 的诊断具有与镜检及培养同样重要的价值。

根据病原真菌在组织内的表现，可将病原真菌鉴定到属的水平，如许多病原真菌在组织内表现为菌丝，根据菌丝的形态，可以将其鉴定至属的水平，发现无色分隔、分枝的菌丝多为念珠菌及曲霉；发现粗大、不分隔少分枝或直角分枝的菌丝多为接合菌；发现棕褐色菌丝多为暗色真菌。

对临床组织标本采用PAS 染色等特殊染色结合常规HE 染色可以提高IFDs 的组织病理学检查阳性率。

另外，IFDs 组织病理表现有时与其他一些疾病的组织病理表现极其相似，往往只有在仔细研究了病理切片并发现了真菌之后才考虑到IFDs 的诊断，而这时标本已被固定，培养已不可能，组织病理切片就成了真菌感染的主要依据，所以临床上送病理标本的同时，要尽可能考虑到IFDs 的可能，以便同时采集标本送真菌实验室进行真菌学检查及培养鉴定。

另外，传统的HE 染色通过形态学诊断组织中的真菌，然而很多真菌在组织中形态相似或完全相同，这时就需要依靠免疫组化方法和原位杂交技术来鉴别。

免疫过氧化物酶染色可以根据致病真菌抗原性的不同制备种属特异性抗体来检测组织标本中的致病菌。

目前已有针对念珠菌、隐球菌、曲霉菌的特异抗体用于免疫组织化学诊断。

原位杂交技术是组织化学和分子生物学成功结合的产物，国内外已用于常见的IFDs 如侵袭性曲霉病的诊断研究中。

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2 侵袭性真菌病诊断研究的进展
目前，非培养诊断是国内外侵袭性真菌病诊断研究的热点，其技术路线主要是基于免疫学原理的血清学方法和以PCR 技术为基础的分子生物学方法。

总体而言，这两大类技术方法各有优势，部分血清学技术方法已经较为成熟，敏感性及特异性均较高，但基于免疫学原理的固有属性也导致假阳性、假阴性等问题；而核酸检测等分子生物学技术方法虽然尚未完全成熟，但可以很好地弥补目前血清学方法的弊端，临床应用前景光明。

另外，近年来高分辨率影像学技术在侵袭性真菌病的辅助诊断中的价值已经得到广泛认可，尤其是高分辨率CT 对肺部侵袭性曲霉病的预测值甚高（Caillot et al . 2001）。

如侵袭性曲霉病的肺部CT 表现通常为局灶病变而非弥漫性浸润，出现典型征象（如：“晕轮征”及“半月征”）时应高度怀疑侵袭性曲霉病，但晕轮征也可以在其他肺部疾病出现如“奴卡放线菌病”和“接合菌病”且侵袭性肺曲霉病亦可没有晕轮征（Austin et al . 1996），故也有一定局限性，目前国内此方面研究还不多。

血清学诊断主要包括抗体检测及抗原、代谢产物检测两大类，其中真菌抗原和代谢产物的检测敏感性高、特异性好，能够反映病情的变化，对于免疫功能受损的患者更有价值，已应用于隐球菌病、曲霉病、念珠菌病等侵袭性真菌感染的诊断；而抗体的检测常用于诊断地方性真菌病如组织胞浆菌病等（Tobon et al . 2005）。

理想的真菌感染的抗原性标记物应该在目标菌种内保守，不与人类和其他微生物抗原发生交叉反应，在侵袭性感染早期即开始足量出现。

此外，这些试验应该便于开展，易于操作，各实验室间结果有较强可比性。

目前，发展较快的IFDs 血清学检测方法主要有隐球菌乳胶凝集试验（latex agglutination test ）、β-1,3-D-葡聚糖试验（β-1,3-D-glucan ，BG ，G 试验）、半乳甘露聚糖（galactomanna ，GM test ）试验等。

隐球菌乳胶凝集试验检测隐球菌荚膜多糖抗原成分，是快速诊断隐球菌性脑膜炎和肺隐球菌病
最有价值的血清学诊断方法，其以高效价抗隐球菌荚膜多糖抗体包被标准大小的乳胶颗粒，来检测血清或脑脊液标本中的隐球菌荚膜多糖抗原，其敏感性和特异性可达93%－100%（Babady et al . 2009）。

曲霉半乳甘露聚糖（GM ）抗原是广泛存在于曲霉属和青霉属细胞壁中的一类多糖。

美国FDA 于2003年批准将检测血清曲霉GM 抗原作为侵袭性曲霉感染的诊断指标，其最灵敏最常用的检测方法是采用Platelia 曲霉抗原ELISA 试剂盒来检测患者体液中GM 抗原，即双夹心ELISA 法，此法在欧洲国家也已被广泛应用。

EORTC/MSG 关于IFDs 诊断标准中，已将Platelia GM 试验作为侵袭性曲霉病临床诊断的微生物学标准之一，推荐对高危成人患者1周检测2次，连续2次/＞0.5为阳性；对儿童，以GM 连续2次＞0.8或单次＞1.5为阳性标准。

多项研究均发现在肺侵袭性曲霉病患者中，几乎有2/3在临床症状和影像学表现出现之前ELISA 法测定血浆GM 即可获得阳性结果，并证实监测血清GM 含量动态变化不仅有利于曲霉感染的诊断同样有利于对治疗效果和病情发展的判断。

最近，一项GM 试验诊断侵袭性曲霉病循证医学研究共收集分析了约4,000名患者，在确诊及拟诊患者中，GM 试验的灵敏度约为71%，特异度为89%。

总的来说，与组织病理学检查及临床标本培养诊断侵袭性曲霉感染相比，应用GM 试验诊断侵袭性曲霉病平均要早7－14d （Pfeiffer et al . 2006）。

另外，GM 试验在不同种类患者中应用价值也不同，如对血液系统疾病并发侵袭性曲霉感染患者诊断价值较高。

β-1,3-D-葡聚糖试验（β-1,3-D-glucan test ，G test ）除可检测念珠菌、曲霉菌外，还可以检测一些少见真菌，如镰孢菌、毛孢子菌等，但隐球菌与接合菌侵袭性感染患者阴性。

β-1,3-D-葡聚糖广泛存在与各类真菌细胞壁中，占细胞壁成分的50%以上，除隐球菌与接合菌外，存在于所有其他真菌细胞壁中，尤以酵母菌为高，而其他微生物、动物及人的细胞成分及细胞外液均不含此成分。

G 试验具有快速简便的特点，在欧洲癌症治疗研究组织/真菌病研究组（EORTC/MSG ）诊断IFDs 标准中，已将G 试
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验连续2次阳性作为阳性标准。

G 试验灵敏度及特异度文献报道差异较大，可能与使用不同的商品试剂盒及所用Cutoff 值不同所致。

此外，G 试验的假阳性率较高，菌血症患者的假阳性率约60%，革兰阳性球菌菌血症高达73%（Koo et al . 2009）。

虽然以G 试验为代表的血清学诊断技术有力地补充了常规诊断技术的缺陷，但其基于免疫学原理的基本属性使其假阳性与假阴性报告屡见不鲜（Patterson 2005；Alexander & Pfaller 2006；Lai et al. 2008），尤其是对可疑的AIDS 患者复发真菌感染，由于AIDS 患者不能消除真菌抗原，所以即使烟曲霉等致病真菌处于非致病态，抗原的检测也为阳性，成为当前血清学方法诊断IFDs 的一大难题。

而近年来分子生物学技术的飞速发展为IFDs 的诊断发展开辟了一条新途径。

IFDs 的分子诊断具有特异性和敏感性高、快速等优点，其核心技术主要有核酸分子杂交和核酸扩增技术。

核酸分子杂交技术是通过探针来检测某种真菌相应的核酸序列是否存在。

原位杂交无需进行核酸提取，且可进行定位诊断，已应用于曲霉及念珠菌的检测（Hayden et al . 2003）。

原位杂交易于操作，检测速度快，但其敏感性常低于核酸扩增技术。

目前，核酸扩增及序列比对技术被公认是IFDs 分子诊断的金标准（Balajee et al . 2007；Petti 2007）。

巢式PCR 技术又使病原真菌靶基因的扩增效率较常规PCR 大为提高，而近年来实时PCR （Realtime-PCR ）技术又有力推动了IFDs 分子诊断的发展。

实时PCR 技术是将PCR 技术与荧光探针检测技术结合起来，反应在同一密闭体系中进行，整个检测时间不超过1h ，且无扩增后的后续检测过程，从而缩短了检测时间，减少了污染。

由于实时PCR 具有敏感性和特异性高、污染少、检测速度快以及易于操作等优点，目前这种技术在侵袭性真菌感染早期诊断中已经显示出强劲的发展潜力。

随着真菌DNA 提取、扩增及检测技术的自动化，以及实时PCR 等技术的出现，分子生物学技术必然在侵袭性真菌感染分子诊断中发挥越来越重要的作用。

然而，目前美国食品药品监督管理局还没有批准任何一种应用于临床的PCR 真菌诊
断方法。

虽然The Internal Transcribed Spacer (ITS) region 等核糖体基因序列分析比对等技术是解决侵袭性真菌感染诊断的分子检测理想技术之一，近些年来国内外也已广泛应用于真菌的分子鉴定及分子流行病学研究，但其操作程序复杂、需要设备多且临床体液标本中的致病真菌DNA 含量与质量往往不能满足常规PCR 检测需要，目前尚无比较成熟的商品化系统能够全面完成该检测工作（Petti 2007；Rosemary 2008）。

RT-PCR 、巢式PCR 等新兴PCR 技术可以显著提高真菌核酸序列扩增及比对分析技术的灵敏度和实际应用价值，但胃肠道死亡细胞的污染可能导致PCR 假阳性、对一些体液样本PCR 分子检测还难以达到同培养的敏感性（Mengoli et al . 2009）等不足使得IFDs 的分子诊断临床应用之路是任重而道远。

因此，目前美国食品药品监督管理局还没有批准任何一种应用于临床的PCR 真菌诊断方法。

目前IFDs 的分子诊断从临床标本的选择和处理，到PCR 检测后的分析等诸多环节都存在着各种各样的影响因素，如临床标本的采集与处理、PCR 反应体系及PCR 结果的评估等等均需要国内外真菌检验研究者们进行优化、标准化，以使我们能够早日迎来真菌病核酸分子诊断时代。

3 侵袭性真菌病诊断研究的展望
目前，虽然已有侵袭性真菌病诊断指南可以参考，但由于侵袭性真菌病临床体征与表现具有不确定性、病情进展具有迅急性及难以预知性，侵袭性真菌病的诊断对于临床医师及实验室人员都是富有挑战和困难的工作，直接镜检、培养及病理学检查仍是侵袭性真菌感染诊断的金标准，主要源于目前的血清学及分子生物学诊断方法的不完善及不成熟。

实际上，自然环境中遍布曲霉等真菌的孢子，某些真菌如曲霉等可以在正常人及免疫抑制患者体内如呼吸道等组织中定植而并不处于侵袭性的致病态。

因此，如何早期、特异的区分高危人群人体组织中处于定植及致病态的丝状真菌是侵袭性真菌感染早期特异性诊断的一大难点。

笔者认为，基于免疫学基本原理的血清学检测技术对于解决
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该难点显然还有很大的发展空间，例如利用目前先进的蛋白质组学等组学技术分析真菌在人体中定植态与致病态所表达蛋白产物或代谢产物的差异，发现其由定植态向侵袭态转变的规律性的新的分子标志物对于解决侵袭性真菌感染早期特异性诊断水平意义重大。

而真菌分子检测技术具有灵敏度高、特异性强的优点，可以很好地弥补血清学诊断技术方法的不足。

目前以PCR 为核心技术之一的侵袭性真菌病分子诊断技术，从临床标本的选择和处理，到PCR 检测后的分析等诸多环节都存在着各种各样不确定的影响因素。

为此欧洲曲霉PCR 行动委员会（European Aspergillus PCR Initiative ，EAPCRRI ）目前正致力于曲霉PCR 标准化方案的实施探讨，我国目前也有许多该领域优秀学者在积极致力于以PCR 技术为基础的IFDs 的分子诊断研究工作。

我们深信，随着国内外相关学者们的积极努力，“真菌病临床核酸分子检测时代”一定会到来！
总之，立足并不断改良现有侵袭性真菌病的传统诊断学方法，结合血清学方法及高分辨率CT 等先进影像学技术是提高目前侵袭性真菌病诊断水平的现实最佳途径；而在此基础上开发新型的血清学与分子生物学检测方法，侵袭性真菌病的诊断水平一定能在不久的将来得到很大提高，满足临床迫切需求！
2010年12月
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