KLF3基因3'-UTR区双荧光素酶报告载体及其突变载体的构建与活性鉴定

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中 国 畜 牧 兽 医 !!"#$!%%"&#$'%%!'K"
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/01&基因&VUX3J 区双荧光素酶报告载体及其 突变载体的构建与活性鉴定
张 明 新 "%B(0!#!男 !辽 宁 昌 图 人 !学 士 !研 究 员 !研 究 方 向 $毛 羊 育 种 与 生 产 !C!:9$D$[::$-!%(*',#:
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翟!博等$AO9*基因*a!NT; 区双荧光素酶报告载体及其突变载体的构建与活性鉴定
<=; 扩 增 体 系 *& %J$2 \ <GFV$#- 8FRR7U (%J!0'2 ::#D%J"4T< M$X0')%J!上(下 游 引 物 "%& %:#D%J#各 % %J!<GFV$#- 345 聚 合 酶 "0N%%J#&'*%J!345 模板"约%&&-I#%%J!灭菌 水补足体 系' 首 先 进 行 降 落 <=;!之 后 对 <=; 产 物进行 纯 化' 用 M":# 和 D:3# 对 <=; 产 物 和 载 体进行双酶切!酶切反应体系)&%J$%&\Q 缓冲 液 )%J!345 约 0%I!内 切 酶 "%& N%%J#各 %%J!双 蒸水补足体 系'*/ ^ 酶 切 )G 后 进 行 回 收 纯 化 与 连接'连 接 反 应 体 系 %& %J$目 的 片 段 345"约 %2&-I#0%J!载体"约2&-I#&'2%J!>#DFH$#- #快 速连接液2%J!双蒸水补足体系'%( ^连接*&:$后进行转化及菌液 <=; 鉴定!并送广州市锐博生 物 科技有限公司测序!测 序 鉴 定 正 确 的 重 组 载 体 命 名
-/04A:5)A1/0=0>,)A1Y1ABZ>60A1<1)=A1/0/<*5=.R5)1<6:=46J69/:A6:[6)A/: =0> P5A=A1/0[6)A/:/</01&C606&VUX3J
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#! 材 料 与 方 法
#I#! 主 要 试 剂 0B*T 细胞为吉 林 省 农 业 科 学 院 畜 牧 科 学 分 院
养羊研究室保存&质 粒 购 自 广 州 市 锐 博 生 物 科 技 有 限公司&:$;!0% 系 列 产 品 均 购 自 江 苏 百 奥 公 司&双 荧光素 酶 检 测 试 剂 盒 购 自 <U#:7I9 公 司&脂 质 体 0&&&购 自 K-Z$HU#I7- 公 司&3MCM 培 养 基(胰 酶( 胎牛 血 清(3MCM 培 养 基 均 购 自 6$@,# 公 司&T) 345 连接酶(345 提 取 试 剂 盒(<=; 产 物 自 T9S9;9 公 司&限 制 性 内 切 酶 M": # 和 D:3 #均购自 O7U:7-H9V公司' #I!! 双 荧 光 素 酶 报 告 载 体 的 构 建
收 稿 日 期 0&%(!%&!%& 基金项目国家?(*资助项目"0&%*55%&02&(#&国家绒毛用羊产 业 技 术 体 系 "=5;>)&!%(#&国 家 科 技 支 撑 计 划 子 课 题 "0&%%8530?8&2!%!2#&
吉 林 省 博 士 后 科 研 人 员 科 研 项 目 "&&%&)0)#&吉 林 省 农 业 科 学 院 博 士 后 科 研 项 目 "0&(&2BB# 作 者 简 介 翟 ! 博 "%B?)!#!女 !吉 林 九 台 人 !博 士 !助 理 研 究 员 !研 究 方 向 $毛 羊 育 种 与 生 产 !C!:9$D$[G9$@#*%&!%(*',#: " 通 信 作 者 张 立 春 "%B//!#!男 !黑 龙 江 嫩 江 人 !博 士 !副 研 究 员 !研 究 方 向 $动 物 生 物 技 术 !C!:9$D$[G9-I,D$,G!%(*',#:
!!锌指蛋白*"SJO*#是一种典型的 SJO 家 族 成 员!对其活性的研究 主 要 集 中 于 调 控 脂 肪 生 成 和 肌 肉基因调节等方面*%+'AO9*基因是 一 种 主 要 的 转 录抑制因子!在功能 上 主 要 依 赖 于 与 调 控 基 因 启 动 子的 =H8< 相 互 作 用 和 自 身 的 修 饰 功 能*0+&而 在 结 构 上 !其 具 有 羧 基 端 * 个 串 联 的 锌 指 结 构 !可 以 结 合 富含 6= 的基序!调控基因表达!调节 细胞的生长 发 育!并可 在 早 期 胚 胎 发 育 中 发 挥 作 用**+'SJOV 是 脂肪形成的重要影 响 因 子!与 脂 肪 的 合 成 和 利 用 密 不 可 分 !如 果 这 种 相 互 作 用 被 破 坏 !则 可 导 致 人 类 代 谢障碍等疾病的发 生':$,U#;45V":$;45V#是 一 类长度约00-H的小分子非编码 ;45!通 过 与 *a端 非编码区的碱基配对靶向调节 :;45V的表达 从而 抑制其 翻 译 或 降 解 ' *)!?+ 一 种 :$;45 可 以 参 与 多 种靶基因的调控!可 以 同 时 调 控 细 胞 的 分 化(增 殖( 生长(迁 移 和 凋 亡 等 多 种 生 物 学 过 程 ' *?!%%+ 越 来 越 多的 研 究 发 现!:$;45 在 脂 肪 的 分 化 和 代 谢 中 具 有调控作用*%0+!因此该领域成 为 脂 肪 形 成 与 基 因 表 达研究的 突 破 口' 为 了 研 究 AO9* 基 因 在 脂 肪 组 织合成与利用中的 调 控 机 理!本 试 验 采 用 双 荧 光 素 酶检测及载体构建等方法!初步确定 AO9* 基因靶 向调控的 :$;45!并 进 一 步 研 究 :$;!0% 与 AO9* 基因负向调控 的 关 系!以 期 为 深 入 挖 掘 调 控 AO9* 基因表达的 :$;45 奠定基础'
根据 67-89-.中 登 录 的 绵 羊 AO9* 基 因 序 列
"登 录 号$_M!&&)&&B/(/'0#!采 用 <U$:7U<U7:$7U 2'&软件设计 <=; 引 物!引 物 序 列 为$`9U!SJO*!*a NT;!O$2a!66=66=T=65656T6TT6=5=T5! 5T6T665!*a&`9U!SJO*!*aNT;!;$2a!55T6=6! 6==6=656T56555=5656556655=!*a!下 划 线标记 为 M": #(D:3 # 的 酶 切 位 点 序 列!预 计 扩 增片段长 度 为 (&/@A' 引 物 由 苏 州 金 唯 智 生 物 科 技有限公司合成'
"%8<"22BH.22-#$=O%,:.%3:./!H.%$5":;&$#'%()*+,%$-./!I#(#$&5%-2'/:;&=.#5*(3*.%(<5#2$52+! J:$=T"*(#$=%*(%&&!!"#$%&086:$="*%62%5"2.+!:((2=2H.%$5"!6:$="*%%*)&&%!!"#$%#
翟!博%李!旭%王春昕%赵云辉%孙!铭0张立春%" 张明新%"
"%'吉林省农业科学院畜牧科学分院养羊研究室!公主岭 %*(%&&&0'通化师范学院分院!通化%*)&&%#
摘!要试验旨在构建锌指蛋白*"SJO*#基因*a!NT; 区双荧光素 酶 基 因 报 告 载 体 及 其 突 变 载 体!初 步 分 析 可 能 调控 AO9*基因表达的 :$;45V' 首 先 通 过 <=; 方 法 扩 增 AO9* 基 因 的 *a!NT; 序 列!将 其 克 隆 到 经 M": #( D:3 # 双 酶 切 的 双 荧 光 素 酶 报 告 载 体 中&运 用 T9UI7HV,9- 软 件 预 测 可 能 与 AO9* 基 因 *a!NT; 相 互 作 用 的 :$;45&使用脂质体0&&&转染试剂将 :$;45V:$:$,V与构建好的 AO9*基因 *a!NT; 段 双 荧 光 素 酶 报 告 载 体 或 突 变载体共转染于常规培养的0B*T 细胞中!检测荧光素酶活性'结果表明!AO9*基因*a!NT; 可能是 :$;!0%的 作用靶 位 点&双 荧 光 报 告 显 示!:$;!0% :$:$,V 组 "&'(B&&m&'&%))#比 突 变 组 "%'&&&m&'&(??#和 空 白 对 照 组 "%'&&&m&'&%2B#AO9*基因*a!NT; 双荧光素酶基因报告载体 和 突 变 载 体 的 活 性 降 低 了 *%b"K%&'&%#' 本 试 验成功构建了含有 AO9*基因*a!NT; 段双荧光素 酶 基 因 报 告 载 体 与 突 变 载 体!初 步 证 实 :$;!0% 对 AO9* 基 因 有调控作用' 关 键 词 AO9* 基 因 &双 荧 光 素 酶 基 因 报 告 载 体 &:$;!0%&*a!非 编 码 区 中图分类号f/?0!!!!文献标识码5 !!!!文章编号%(/%!/0*("0&%/#&*!&())!&/
,G4A:=)A$TG$VVHF"EW9V9$:7"H#,#-VHUF,HHG7"F9DDF,$R7U9V7U7A#UH7UZ7,H#UWG$,G,#-H9$-7" AO9*I7-7*a!NT;9-"$HV:FH9H$#-Z7,H#U!9-"9-9DE[7HG7A#VV$@D7:$;45VWG$,G,#FD"U7IF! D9H7AO9*I7-77XAU7VV$#-'K-HG$VVHF"E!TG7AO9*I7-7*a!NT; W9V9:AD$R$7"@EA#DE:7U9V7 ,G9$-U79,H$#- "<=;#9-"$-V7UH7"$-HG7"F9DDF,$R7U9V7U7A#UH7UZ7,H#UWG$,G W9V"$I7VH7"@E M": # 9-" D:3 #&d$HG T9UI7HV,9-H#AU7"$,HHG7 :$;45VWG$,G :$IGH$-H7U9,HW$HG AO9* I7-7*a!NT;&0B*T,7DDV W9VHU79H7" W$HGU7,#:@$-9-HZ7,H#U#U$HV :FH9H$#-Z7,H#U#U7:AHE Z7,H#U9-":$;45 :$:$,V#U,#-HU#D@EJ$A#R7,H9:$-70&&&'TG7"F9DDF,$R7U9V7U7A#UH7U9VV9E VEVH7: W9VFV7"H#,#:A9U7HG79,H$Z$HE#RDF,$R7U9V7'TG7U7VFDHVVG#W7"HG9HAO9*I7-7*a! NT; :$IGH@7HG79,H$#-A#$-HV#R:$;!0%&3#F@D7RDF#U7V,7-HU7A#UHU7VFDHVVG#W7"HG9H:$;!0% :$:$,VIU#FA "&'(B&&m&'&%))#W9V"7,U79V7"*%b HG9-HG7:FH9H$#-Z7,H#UIU#FA "%'&&&m &'&(??#9-"HG7@D9-.,#-HU#DIU#FA "%'&&&m&'&%2B#W$HGHG7DF,$R7U9V79,H$Z$HE#R0B*T,7DDV'