无菌实验室操作规程

无菌实验室操作规程
为无菌实脸室的操作，无菌实验室的保护提供一个标准化规程，保证实验室操作顺利进行，保证实验结果的准确性。

无菌实验室操作程序很重要，安徽人和净化为您提供。

操作程序
1、微生物检验的准备工作
1.2操作前的准备：
1. 2. 1无菌实验室使用前必须打开无菌实验室的紫外灯辎照火菌30分钟以上，并且同时打开超净台进行吹风。

以保证无菌实验室的洁净度符合要求。

1. 2. 2微生物检验玻璃仪器的淸洗
1. 2. 2. 1按技术要求将各种玻璃仪器进行淸洗，可用瓶刷或海绵沾上肥皂或洗衣粉或去污粉等洗涤剂刷洗，然后用自来水充分冲洗干净。

热的肥皂水去污能力更强，可有效地洗去器皿上的油污。

洗衣粉和去污粉较难冲洗下•净而常在器壁上附有一层微小粒子，故要用水多次甚至10次以上充分冲洗，或可用稀盐酸摇洗一次，再用水冲洗，然后倒置于磁盘或木架上，在室内晾干，放烘箱烘干。

1.2. 2. 2玻璃器皿经洗涤后，若内壁的水是均匀分布成一薄层，表示油垢完全洗净，若挂有水珠，则还需用洗涤液浸泡数小时，然后再用自来水充分冲洗。

1. 2. 2. 3装有固体培养基的器皿应先将其弃去，然后洗涤。

带菌的器皿在洗涤前先浸在2% 煤酚皂溶液（来苏尔）或0.25%新洁尔火消毒液内24小时或煮沸半小时，再用上法洗涤。

带病原菌的培养物最好先行高压蒸汽火菌，然后将培养物倒去，再进行洗涤。

1.2. 2. 4盛放一般培养基用的器皿经上法洗涤后，即可使用，若需精确配制化学药品，或做科研用的精确实验，要求自来水冲洗干净后,再用蒸餾水淋洗三次，晾干或烘干后备用。

1. 2. 2. 5准备好所用的各种试剂，做好普通营养琼脂或其他选择的培养基。

1.3消毒、火菌
微生物检验用器材及场所必须进行灭菌或消毒处理，不同的对象采用不同的处理方法。

1.3.1.高压蒸汽灭菌：工作服、口罩、稀释液等，置髙压杀菌锅内，一般采用121°C火菌半小时，当然不同的培养基有不同的要求，应分别处理
1.3.
2.火焰火菌：接种针、接种环等可直接火焰火菌
1.3.3.高温干燥火菌：各种玻璃器皿、注射器、吸管等，置于燥箱中160°C火菌2小时。

1.3.4.一般消毒：无菌实验室内的凳、工作台、试管架、天平、待检物容器或包装均无法
进行火菌，必须用其他方法进行消毒处理，采用2%石炭酸或来苏儿水溶液擦拭消毒，工作人员的手也用此法进行消毒。

1.3.5.空气的消毒：开启紫外灯照射30-60分钟即可。

2、培养基的配制、验证及存储
培养基制备的质量将宜接影响微生物生长。

由于各种微生物对其营养要求不完全相同，培养目的的不同，各种培养基制备要求如下。

2.1.根据培养基配方的成分按量称取，然后溶于蒸馅水中，在使用前对应用的试剂药品应进行质量检验。

2.2.PH测定及调节：PH测泄要在培养基冷至室温时进行，因在热或冷的情况下，其PH 有一左差异，当测左好时，按计算量加进碱或酸混匀后，应再测试一次。

培养基PH值一泄要正确，否则会影响微生物的生长或彫响结果的观察。

但需留意因高压火菌可影响一些培养基的PH降低或升高，故不宜灭菌压力过高或次数太多，以免影响培养基的质量，指示剂、往氧胆酸钠、琼脂等一般在调完PH后再加进。

2.3.培养基需保持澄淸，便于观察细菌的生长情况，培养基加热煮沸后，可用脫脂棉花或绒布过滤，以除往沉淀物，必要时可用鸡蛋白澄淸处理，所用琼脂条要预先洗净晾下后使用，避免
因琼脂含杂质而影响透明度。

2、4.培养基的火菌既要达到完全火菌目的，又要留意不因加热而降低其营养价值，一般121°C15min即可，如为含有不耐高热物质的培养基如糖类、血淸、明胶等，则应采用低温火菌或间歇法火菌，一些不能加热的试剂如亚碼酸钾、卵黄、TTC、抗菌素等，待基础琼脂髙压火菌后凉至50°C左右再加进。

2.5.每批培养基制备好后，应做无菌生长试验及所检菌株生长试验。

假如是生化培养基，使用标准菌株接种培养，观察生化反应结果，应呈正常反应，培养基不应贮存过久，必要时可置4°C 冰箱存放。

2.6.目前各种干燥培养基较多，每批需用标准菌株进行生长试验或生化反应观察，各种培养基用相应菌株生长试验良好后方可应用，新购进的或存放过久的干燥培养基，在配制时也应测PH,使用时需根据产品说明书用量和方法进行。

2.7.每批制备的培养基所用化学试剂、火菌情况及菌株生长试验结果、制作职员等应做好记录，以备查询。

3、样品的采集：接到第一检查站通知后，提前30分钟到达生产现场，双方确认生产品种、下辘时间后相互签字后，检验员用75%酒精棉球擦手两次，用灭菌刀取样，放到事先火好菌的纸袋中，带回放入无菌实验室中待检，并做好标识。

4、样品的微生物检验
4. 1化验员进入无菌实验室前，必须用肥皂或消毒液洗手消毒，然后在缓冲间更换专用工作服，鞋，帽子，口罩和手套（或用75%的乙醇再次擦拭双手），方可进入无菌实验室进行操作。

4. 2供试品在检查前，应保持外包装完整，不得开启，以防污染。

检查前，用70%的洒精棉球消毒外表而。

4. 3检査洒精等内洒精体枳是否在2/3处，不足时先加好无水酒精，擦下净洒在瓶外的洒精
方可点燃洒精灯。

4. 4用75%的后洒精再次擦拭消毒双手，用银子取岀洒精棉球点燃，在待检样瓶口和稀释水瓶口处环绕几圈对瓶口火菌。

4. 5纸样的预处理：用无菌剪剪开信封，无菌银子取出样品，用同样的方法将样品剪成5mmX5mm左右的方块，放在天平台上的火菌纸上，称取样品无菌操作将样品置于火菌生理盐水中，摇动10分钟，使纸样充分湿润，完全浸泡在无菌生理盐水中，注意不可用力过猛，小心样液溅岀。

4. 5如果样品所含细菌较多需稀释时，应以无菌方法吸取lml样液注入盛有9ml火菌生理盐水中，吸上来在轻吹下去往复2-3次混匀成1:10稀释液，吸取1:10稀释液lml注入盛有9ml 火菌生理盐水中混匀成1： 0:1稀释液，如此递增西施一次，必须更换一支火菌吸管。

4. 6打开培养皿火菌桶，取出所需的培养的培养皿并在培养皿上做好标识。

4. 7吸取液体样品前，火菌吸管在使用前下端需通过火焰火菌（再火焰上来回灼烧三次以上）稍冷再用。

4. 7移取样品前应充分混匀，再用火菌吸管吸取lml注入做好标识的培养皿中。

4. 8每个培养皿中倒入冷却至约45°C的培养基15-20ml,立即平摇培养皿，时代测样品能够均匀分散于培养基中。

4. 9样品检验过程中所用方法、出现的现象和结果等均要用文字做好纪录，以作为对结果分析、判泄的依据，记录要求具体、淸楚、真实、客观、不得涂改和伪造。

4. 10工作完毕，将酒精灯帽扣上，两手应用肥皂或洗手液洗净，必要时先用2%消毒液消毒，然后用水冲洗。

如果菌也洒在桌而或地而上，应立即用5%石碳酸溶液或3%的来苏尔倾覆在被污染处至少30分钟，再做处理。

5、培养
培养基冷却后，翻转培养基，使培养皿底在下面，放入37°C培养箱中培养。

6、样品的留存：
纸样做好标识留存48小时以上，已备待査。

检验完毕的培养基放在冰箱中留存48小时以上以备待査。

7、无菌检验岀现异常数据时：
站长在日常巡视时，发现异常时及时对生产盐水、培养基，操作空白进行排查，立即组织复测，当检验员发现菌落异常时，立即汇报给站长，进行排查，组织复检。

8、废弃物处置
8. 1处置程序
8.1.1检验后的废气物必须随时淸除，并及时送到指左地点加以处理。

检验后的废弃样品，若对环境无害，可做为垃圾处程。

8.1.2液体废物一般可加漂白粉进行氯化消毒处理。

固体可燃性废物分类收集、处理、一律及时焚饶。

固体非可燃性废物分类收集，可加漂白粉进行氯化消毒处理。

满足消毒条件后作最终处置。

8.1.3.若经过物理、化学方法处理后能转化为无害的或达到排放标准的有害废弃物，在经过妥善处理后，克排放处理。

8.1.4一次性使用的制品如手套、帽子、工作物、口罩等使用后放入污物袋内集中烧毁。

8.1.5.应有盛装废弃物的容器，最好是防碎裂的，里面盛装适宜的消毒液，消毒液使用时新鲜配制。

把消毒液及废弃物倒入一个容器里以备高压火菌。

盛装废弃物的罐子在再次使用前应高压并洗净。

可重复利用的玻璃器材如玻片、吸管、玻瓶等可以用1000-3000mg/L 有效氯溶液浸
泡2-6h.然后清洗重新使用，或者废弃。

8.1、6.用来盛放的容器应用消毒液浸泡：严格与感染性生物材料区分，防止二者混放：过期的生物性试剂应废弃，禁I匕使用。

盛标本的玻璃、塑料、搪瓷容器可煮沸15min.或者用lOOOmg/L 有效氯漂白粉澄淸液浸泡2-6h,消毒后用洗涤剂及流水刷洗、沥干；用于微生物培养的，用压力蒸汽火菌后使用。

8.1.7.微生物检验接种培养过的琼脂平板应压力火菌30min,趁热将琼脂倒弃处理。

8. 2处宜规左
8.2、1、检验过程中产生的任何污染材料未经消毒不能拿岀实验室。

8.2.2、液体废弃物必须收集在防漏、未破的容器内，经高浓度化学消毒剂处理。

8.2.3、对剩余标本、接触过的培养基、菌种等丢弃前均须适当消毒。

8.2.4、对于任何有污染的锐器如针头、注射器、玻璃等在处理前不要用手接触。

安徽人和净化。