Western blot操作步骤及技巧

Western blot操作步骤及技巧
实验器材：
电泳及转膜设备、PVDF膜（0.2μM）
实验试剂：
SDS凝胶配制试剂盒（碧云天）、SDS电泳缓冲液、转膜液（分干转及湿转）、蛋白Loading buffer、预染蛋白Marker、甲醇、PBST/TBST、脱脂奶粉、一抗抗体、二抗抗体、碱性磷酸酶显影液或ECL化学发光显影液、BSA、PMSF、细胞蛋白裂解液
实验步骤：
一、配胶（具体浓度选择根据所需检测蛋白分子量大小而定，常用10%）
1.将玻璃板洗净、用ddH2O冲洗、晾干；
2.分离胶及浓缩胶均可事先配好（AP及TEMED使用前加入），避光存放于4℃，
可至少存放1个月，临用前取出室温平衡；
3.封胶：灌入2/3的分离胶后应立即封胶，可以使用ddH2O或者异丙醇封胶，
也可以用0.1%的SDS。

封胶后切记，勿动。

待胶凝后将封胶液倒掉，如用醇封胶需用ddH2O冲洗干净;
4.灌好浓缩胶插入梳子，待胶凝固拔除梳子。

拨出梳子后用ddH2O冲洗胶孔两
遍以去除残胶。

若上样孔有变形，可用适当粗细的针头拨正；若变形严重，可在去除残胶后用较薄的梳子再次插入梳孔后加水拔出。

30min后即可上样，长时间有利于胶结构的形成，因为肉眼观的胶凝时其内部分子的排列尚未完成。

二、样品处理
1.悬浮细胞：
a) 1.5 ml EP管或离心管收集细胞，2000rpm、3min去培养液后用温的PBS
洗1遍；
b)离心尽量去除PBS，加入适量细胞裂解液（裂解液使用前按100-200：1
加入PMSF），冰上裂解30min,期间不间断振荡EP管，使细胞裂解充分；
c)4℃，12000rpm离心10min，取上清定量；
2.贴壁细胞：
a)去培养液后用温的PBS冲洗1遍，尽量去除残留PBS；
b)加入适量的冰预冷的裂解液（6孔板细胞密度在80%左右，每孔加100-200
μl裂解液,浓度在2-4μg/μl左右）后置于冰上30min，期间不断震荡培养
板，使裂解充分；
c)收集细胞裂解液在EP管后4℃，12000rpm离心10min，取上清定量；
3.组织：
a)匀浆对于心肝脾肾等组织可每50~100mg加1ml裂解液，肺100~200mg
加1ml裂解液。

可手动或电动匀浆，亦可在液氮状态下碾磨。

注意尽量
保持低温，快速匀浆；
b)收集裂解液至1.5ml EP管中，冰上裂解30min，12000rpm离心，4℃，
2min；
c)取少量上清进行定量；
4.定量及蛋白变性处理：
a)参照碧云天BCA蛋白定量试剂盒，对所有蛋白样品做浓度测定，添加裂
解液将所有蛋白样品调至等浓度；
b)加入蛋白loading buffer后混匀，98℃10min使蛋白样品充分变性。

变性
后的蛋白样品可直接进行后续操作，也可以低温储存，-20℃一个月，每
次上样前98℃5min。

三、电泳
1.上样前将胶板下的气泡赶走；
2.所有蛋白样品调至等浓度后上样，样品两侧的多余泳道用等体积的1×
loading buffer上样，Marker也用1×loading buffer调整至与样品等体积；
3.以初始电压为80V时的电流强度进行稳流电泳，当样品完全进入分离胶后改
为120V稳压电泳；
4.在溴酚蓝指示带泳动至距胶下缘0.5-1cm以上结束,也可以根据目的蛋白大小
将溴酚蓝完全溢出作为结束电泳指标。

四．转膜（分为湿转和半干转）：
常用的电泳转移方法有湿转和半干转。

两者的原理完全相同，只是用于固定
胶/膜叠层和施加电场的机械装置不同。

湿转是一种传统方法，将胶/膜叠层浸入缓冲液槽然后加电压。

这是一种有效方法但比较慢，需要大体积缓冲液且只能用一种缓冲液。

半干转移，用浸透缓冲液的多层滤纸代替缓冲液槽。

与湿转相比，这种方法要快（15-45 分钟）。

小分子量的蛋白半干转效果比较好，大分子量（100KD 以上）建议湿转。

1.电泳结束前20分钟左右戴上手套开始准备：
浸泡PVDF膜（不分正反面）：将PVDF膜浸泡在甲醇中2min后转入转膜液中。

将滤纸也浸入转膜液中。

切忌手套直接接触PVDF膜。

2.取胶：
用取胶板小心将胶卸下，去除上层浓缩胶，左上切角，在转移液中稍稍浸泡一下，置于洁净玻璃板上。

3.转膜、裁膜：
a)湿转：在转膜液中制作海绵垫、滤纸、SDS聚丙烯酰胺凝胶、PVDF膜
组成的“三明治夹心（从下往上依次为海绵垫、薄滤纸、SDS胶、PVDF
膜、薄滤纸、海绵垫）”，小心赶出SDS聚丙烯酰胺凝胶与PVDF膜之间
的气泡，将装置置于电泳槽中，PVDF膜面对准正极（红色），SDS胶面
对准负极（黑色），加入冰袋及转膜液Transfer Buffer，整个装置置于冰
槽中，防止过度产热影响实验结果，100V恒压直流电转膜80分钟（80
分钟适合绝大多数分子量在20-130KDa之间的蛋白，可以根据目的条带
分子量大小适当改变）。

b)半干转：按顺序铺上PVDF膜、SDS胶与每侧一张厚滤纸。

注意用玻棒
或切胶板逐出气泡，剪去滤纸与膜的过多部分，以防止短路。

滴加少许
电转液再次驱赶气泡，封紧后放入电转槽，注意膜在正极一侧。

清理电
转槽上多余的转膜液，按照1或0.8 mA/cm2运行30~40分钟。

c)裁膜：转膜结束，取出PVDF膜，正面向上，于0.5%丽春红染液（1%
醋酸配制）中预染色，PBST适度清洗，结合PVDF膜上蛋白指示Marker，
裁剪出目的条带，标记，置于PBST清洗液中。

五．封闭、一抗孵育：
1.PBST清洗去除多余丽春红染液，PBST配制5%脱脂牛奶孵育目的条带，置
摇床上常温封闭60分钟。

2.PBST清洗目的条带，将目的条带放入含相应抗体的一抗抗体稀释液中（抗
体稀释液可使用商品化一抗稀释液，也可自行配置：常用为3% BSA，由PBST 配制，含万分之一NaN3）,置4℃摇床，抗原抗体结合16-24小时。

3.回收抗体稀释液，置4℃保存（可重复使用）。

PBST摇床常温上清洗目的条
带3次，每次10分钟。

4.1：2000-5000稀释配制二抗稀释液（二抗稀释液可用商品化稀释液，也可自
行用PBST配制3%脱脂牛奶，二抗属源性由一抗决定，即一抗抗体来源于鼠，相应二抗抗体也必须为抗鼠抗体），常温摇床孵育目的条带60分钟。

（抗体在常温孵育效价会严重降低，故二抗稀释液一般不回收重复使用，但相邻两天内可考虑重复使用）。

六．曝光成像（分碱性磷酸酶法、化学发光法）：
1.PBST摇床常温上清洗目的条带3次，每次10分钟。

2.碱性磷酸酶（AP）法显影：
a)参照AP显影试剂操作说明，避光条件配制适量显影液；
b)用镊子小心夹取目的条带，吸干多余PBST残液后置于显影液中，轻轻
摇晃均匀，避光静置3-5min或更长时间，直到目的条带完全出现；
c)将目的条带小心取出，置于PBST中，拍照，分析结果。

3.化学发光（HRP）法显影：
a)取化学发光液，参照使用说明，将ECL显影液A、B按1：1混匀；
b)取目的条带擦去多余水分，置于发光液中数秒至一分钟；
c)取出目的条带擦去多余发光液，置于塑料薄膜上，快速放入自动成像仪
中自动曝光。

4.结果分析：可选择使用Image Lab或Photo Shop处理图片。

图片一般保存Tif
格式，像素密度不小于300dpi。

注意事项：
1.很多时候检测不到目的条带的问题都是出在样本制备这一步。

质粒有没有转
染到细胞中去，转进去后有无表达，表达量是否足以用WB 检测，目的蛋白是否容易降解？想要得到最佳实验结果，了解清楚这些问题比一遍一遍优
化和改进WB 操作本身更为重要。

2.提取蛋白的细胞裂解液中加入蛋白酶抑制剂防止蛋白降解；如果需要检测磷
酸化蛋白，请加入磷酸酶抑制剂。

3.测定蛋白表达量，低表达的蛋白需要浓缩目的蛋白样本至可检测浓度, 确认
你的上样量达到20 μg。

4.过度洗膜洗掉一抗（CST 科学家经过自己验证，推荐在TBST 中清洗三次，
每次 5 分钟）、过度封闭( 超过1 小时或者过夜封闭，会减少特异信号)、抗体质量均会对实验结果造成影响。

5.分子量低于30 KD 的蛋白，建议使用较高浓度（12-15%）的蛋白分离胶并
缩短转膜的时间，建议在 1 小时以内。