自体皮肤成纤维细胞、PRP及胶原蛋白液的获取方法[发明专利]

(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201710725703.4
(22)申请日 2017.08.22
(71)申请人 四川驰鼎盛通生物科技有限公司
地址 610041 四川省成都市高新区天府大
道北段1480号1栋3层12附3号
(72)发明人 胡火珍　王曦　宋丽萍　杨燕　
谢小琴　肖春　李利　薛红　
张泽辛　张娟　罗旭梅　彭芳芳　
叶林　胡章兰　刘佩娜　黄娟　
邹琳　
(74)专利代理机构 北京众合诚成知识产权代理
有限公司 11246
代理人 夏艳
(51)Int.Cl.
C12N 5/071(2010.01)
C12N 5/077(2010.01)C07K 14/475(2006.01)C07K 14/78(2006.01)A61K 8/65(2006.01)A61K 8/64(2006.01)A61Q 19/00(2006.01)A61Q 19/08(2006.01)
(54)发明名称自体皮肤成纤维细胞、PRP及胶原蛋白液的获取方法(57)摘要本发明公开了一种自体皮肤成纤维细胞、PRP及胶原蛋白液的获取方法，包括以下步骤：皮肤成纤维细胞分离、培养和传代；自体高浓度以胶原蛋白为主的分泌浓缩蛋白液的制备；自体血小板富集血浆的制备。

本发明针对皮肤衰老、疤痕形成的主要原因而设计制备的，制剂的三种成分——自体皮肤成纤维细胞、自体生长因子即PRP、自体胶原蛋白，保证了制剂的有效性，维持时间长的特点；而且三种成分全部都是自体的，保证了制剂的安全性，这较市场上单纯使用自体成纤维细胞移植的效果好。

本发明主要内容是分
泌的胶原蛋白为主的上清浓缩液制备的方法。

权利要求书1页 说明书3页 附图1页CN 107523533 A 2017.12.29
C N 107523533
A
1.一种自体皮肤成纤维细胞、PRP及胶原蛋白液的获取方法，其特征在于，所述自体皮肤成纤维细胞、PRP及胶原蛋白液的获取方法包括以下步骤：
步骤一，皮肤成纤维细胞分离、培养；包括：标本处理；分离；培养和传代；
步骤二，自体高浓度胶原蛋白液的制备；
步骤三，自体血小板富集血浆的制备。

2.如权利要求1所述的自体皮肤成纤维细胞、PRP及胶原蛋白液的获取方法，其特征在于，所述步骤一具体包括：
(1)标本处理：皮肤标本放于磷酸缓冲液PBS瓶中，4℃保存，带回GMP级实验室；将取回的标本置于生物安全柜，标本移入平皿内，首先用1×磷酸盐缓冲液PBS 5ml浸泡15min，用1ml移液枪吸弃浸泡液，再用1×PBS反复冲洗，然后用500u/ml氨苄青霉素和500mg/ml硫酸链霉素的PBS溶液中浸泡消毒10min后，用PBS液用力反复冲洗5次，直至标本发白，轻度发胀，在平皿中修剪皮下筋膜，剔除脂肪，将标本剪粹，后面相同；
(2)分离：用1mg/ml的混合胶原酶MNP-S在37℃条件下消化1h，分离表皮与真皮；去除表皮，真皮组织剪成约0.1mm3～0.3mm3大小，加入Tryple select无动物源性消化液，37℃条件下继续消化15min；当成纤维细胞大部分从组织中分离出来时，加入10％FBS高糖-IMDM培养基终止消化，移入离心管，1000r/min离心5min，收集沉淀；
(3)培养和传代，将获得的细胞及剩余的组织块一并接种于75cm 2培养瓶中，加入1ml完全培养基，置37℃5％CO 2培养箱中培养；于培养24h后补充培养液，此后隔3d半定量换液；原代细胞融合至70％时，0.1％胰蛋白酶消化，去除组织块，按照1：5比例转入T175传代，培养基改为加含10％自体血清培养基；在培养至第四代，获得2×108～3×108成纤维细胞。

3.如权利要求1所述的自体皮肤成纤维细胞、PRP及胶原蛋白液的获取方法，其特征在于，所述步骤二具体包括：自体真皮成纤维细胞在体外培养扩增过程中，分泌胶原蛋白、纤连蛋白蛋白质，在换液时，将所有含胶原蛋白上清全部收集，放于离心管，超滤浓缩技术除去分泌液中的无机盐，获取浓缩分泌蛋白液，然后再采用冷冻浓缩技术浓缩，采用超滤浓缩除盐结合冷冻浓缩方法，获得高浓度胶原蛋白>1500ug/ml，放于4℃冰箱无菌保存。

4.如权利要求1所述的自体皮肤成纤维细胞、PRP及胶原蛋白液的获取方法，其特征在于，所述步骤三具体包括：
(1)将血液从采血袋或注射器中移入到离心管中，全血离心450g，10min；
(2)全血分层为无明显界限的两层，取上层液体，取到红细胞层以上的包括白细胞在内的上层部分血浆；
(3)将获得的血浆离心3000g离心15min，温度22℃±2℃，使血小板下沉；
(4)轻轻吸出上层少血小板血浆，放于另一无菌离心管中，作为制备培养成纤维细胞培养基的血清，余下5ml～10ml血浆沉淀，即为浓缩血小板，可获得全血中80％以上的血小板。

5.一种利用权利要求1～4任意一项所述自体皮肤成纤维细胞、PRP及胶原蛋白液的获取方法获取的蛋白液。

6.一种利用权利要求5所述蛋白液制备的护肤品。

权　利　要　求　书1/1页CN 107523533 A
自体皮肤成纤维细胞、PRP及胶原蛋白液的获取方法
技术领域
[0001]本发明属于蛋白质获取技术领域，尤其涉及一种用自体皮肤成纤维细胞、PRP及胶原蛋白液的获取方法。

背景技术
[0002]随着年龄的增长，皮肤会出现松弛、干燥粗糙、弹性下降、皱纹增多等老化现象，这些现象都与成纤维细胞数量减少以及分泌合成功能下降或异常有关。

人皮肤成纤维细胞是皮肤真皮网织层中最重要的细胞，是皮肤衰老和细胞受损后的主要修复细胞之一。

它不但能够促进表皮细胞的迁移、增殖和分化，还能分泌大量的胶原蛋白、弹性纤维蛋白及多种细胞修复因子，具有强大的自我更新能力，从而修复老化的、损伤的皮肤。

成纤维细胞是维持皮肤弹性和韧性的重要细胞，因其特有的生物学特性，在抗皮肤衰老中起着重要的作用。

有活性的在体外培养好的符合临床级别要求的成纤维细胞移植到皱纹处需要成活、增殖、具有分泌功能，这就需要有促进成纤维细胞生长的因子及胶原蛋白等细胞外基质。

血小板中含有大量的这些因子，培养的上清中含有成纤维细胞成活、生长的包括胶原蛋白等胞外基质成分。

因此，本发明的制剂包含了自体成纤维细胞、PRP及浓缩的成纤维细胞培养上清中的分泌蛋白，主要是胶原蛋白。

发明内容
[0003]本发明的目的在于提供一种自体皮肤成纤维细胞、PRP及胶原蛋白液的获取方法，旨在解决制剂的有效成分获取的标准化程序的问题。

[0004]本发明是这样实现的，一种自体皮肤成纤维细胞、PRP及胶原蛋白液的获取方法，所述自体皮肤成纤维细胞、PRP及胶原蛋白液的获取方法包括以下步骤：
[0005]步骤一，皮肤成纤维细胞分离、培养；包括：标本处理；分离培养；培养；
[0006]步骤二，自体高浓度胶原蛋白液的制备；
[0007]步骤三，自体血小板富集血浆的制备。

[0008]进一步，所述步骤一具体包括：
[0009](1)标本处理：皮肤标本放于无钙镁磷酸缓冲液(DPBS)瓶中，4℃保存，带回GMP级实验室；将取回的标本置于生物安全柜，标本移入平皿内，首先用1×DPBS5ml浸润15min，用1ml移液枪吸弃，再用1×DPBS同样反复冲洗，然后用500u/ml氨苄青霉素和500mg/ml硫酸链霉素的DPBS溶液中浸泡消毒10min后，用DPBS液用力反复冲洗5次，直至标本发白，轻度发胀，在平皿中修剪皮下筋膜，剔除脂肪，将标本剪碎，后面相同；
[0010](2)分离：用1mg/ml的混合胶原酶MNP-S在37℃条件下消化1h～2h，分离表皮与真皮；去除表皮，真皮组织剪成约0.1mm3～0.3mm3大小，加入Tryple select无动物源性消化液，37℃条件下继续消化15min；当成纤维细胞大部分从组织中分离出来时，加入10％FBS-IMEM培养基终止消化，移入离心管，1000r/min离心5min，收集沉淀；
[0011](3)培养和传代，将获得的细胞及剩余的组织块一并接种于75cm2培养瓶中，加入
1ml完全培养基，注意切勿使培养物浮起，置37℃5％CO2培养箱中培养；于培养24h后补充培养液，此后隔3d半定量换液；原代细胞融合至70％时，Tryple select无动物源性消化液，200目过滤去除组织块，按照1：2比例转入T175传代，培养基改为加含10％自体血清培养基；从P2代开始，以1:5的比例传代，培养至第四代，获得2×108～3×108成纤维细胞。

[0012]进一步，所述步骤二具体包括：自体真皮成纤维细胞在体外培养扩增过程中，分泌胶原蛋白、纤连蛋白等蛋白质，在换液时，将所有含胶原蛋白上清全部收集，放于无菌试剂瓶内以备制备浓缩胶原蛋白液用，超滤除去培养上清液中的无机盐，获得浓缩的以自体胶原蛋白为主的分泌蛋白，然后再用冷冻浓缩技术浓缩，获得高浓度胶原蛋白大于1500ug/ ml，放于4℃冰箱无菌保存。

[0013]进一步，所述步骤三具体包括：
[0014](1)将无菌采集的200ml静脉血从采血袋或注射器中移入到离心管中，全血离心450g，10min；
[0015](2)全血分层为无明显界限的两层，取上层液体，取到红细胞层以上的包括白细胞在内的上层部分血浆；
[0016](3)将获得的血浆离心3000g离心15min，温度22℃±2℃，使血小板下沉；[0017](4)轻轻吸出上层少血小板血浆，放于无菌试剂瓶中，作为制备培养成纤维细胞培养基的血清，余下5ml～10ml血浆沉淀，即为浓缩血小板，可获得全血中80％以上的血小板。

[0018]本发明的另一目的在于提供一种利用所述自体皮肤成纤维细胞、PRP及胶原蛋白液的获取方法获取的自体活细胞注射液。

[0019]本发明的另一目的在于提供一种利用所述蛋白液制备的修复皮肤瘢痕、除皱产品。

[0020]本发明提供的自体皮肤成纤维细胞、PRP及胶原蛋白液的获取方法，针对皮肤衰老、疤痕形成的主要原因而设计制备的，制剂的三种成分——自体皮肤成纤维细胞、自体生长因子即PRP、自体胶原蛋白，保证了制剂的有效性，维持时间长的特点。

而且三种成分全部都是自体的。

保证了制剂的安全性，这较市场上单纯使用自体成纤维细胞移植的效果好。

本发明主要内容是分泌的胶原蛋白为主的上清浓缩液制备的方法。

附图说明
[0021]图1是本发明实施例提供的自体皮肤成纤维细胞、PRP及胶原蛋白液的获取方法流程图。

具体实施方式
[0022]为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。

应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

[0023]下面结合附图对本发明的应用原理作详细的描述。

[0024]如图1所示，本发明实施例提供的自体皮肤成纤维细胞、PRP及胶原蛋白液的获取方法包括以下步骤：
[0025]S101：人皮肤成纤维细胞分离、培养；
[0026]S102：自体高浓度胶原蛋白液的制备；
[0027]S103：自体血小板富集血浆的制备。

[0028]下面结合具体实施例对本发明的应用原理作进一步的描述。

[0029](一)人皮肤成纤维细胞分离、培养
[0030]取材：在医院手术室无菌取耳后4块3mm2大小皮肤组织置于事先装有培养基的冻存管中；
[0031](1)标本处理：皮肤标本放于无钙镁磷酸缓冲液(DPBS)瓶中，4℃保存，带回GMP级实验室；将取回的标本置于生物安全柜，标本移入平皿内，首先用1×DPBS5ml浸泡15min，用1ml移液枪吸弃，再用1×DPBS同样反复冲洗，然后用500u/ml氨苄青霉素和500mg/ml硫酸链霉素的DPBS溶液中浸泡消毒10min后，用DPBS液用力反复冲洗5次，直至标本发白，轻度发胀，在平皿中修剪皮下筋膜，剔除脂肪，将标本剪碎；
[0032](2)分离：用1mg/ml的混合胶原酶MNP-S在37℃条件下消化1h～2h，分离表皮与真皮；去除表皮，真皮组织剪成约0.1mm3～0.3mm3大小，加入Tryple select无动物源性消化液，37℃条件下继续消化15min；当成纤维细胞大部分从组织中分离出来时，加入10％FBS-IMEM培养基终止消化，移入离心管，1000r/min离心5min，收集沉淀；
[0033](3)培养和传代，将获得的细胞及剩余的组织块一并接种于75cm2培养瓶中，加入1ml完全培养基，注意切勿使培养物浮起，置37℃5％CO2培养箱中培养；于培养24h后补充培养液，此后隔3d半定量换液；原代细胞融合至70％时，Tryple select无动物源性消化液，200目过滤去除组织块，按照1：2比例转入T175传代，培养基改为加含10％自体血清培养基；从P2代开始，以1:5的比例传代，培养至第四代，获得2×108～3×108成纤维细胞。

[0034](二)自体高浓度胶原蛋白液的制备：自体真皮成纤维细胞在体外培养扩增过程中，分泌胶原蛋白、纤连蛋白等蛋白质，在换液时，将所有含分泌蛋白上清全部收集，放于无菌试剂瓶内以备制备浓缩胶原蛋白液用，采用超滤浓缩技术浓缩分泌蛋白，去除上清中的无机盐，然后再用冷冻浓缩技术浓缩，获得高浓度以胶原蛋白大于1500ug/ml为主的分泌蛋白，放于4℃冰箱无菌保存。

[0035](三)自体血小板富集血浆的制备
[0036] 1.将无菌采集的200ml静脉血从采血袋或注射器中移入到离心管中。

全血离心450g，10min。

[0037] 2.全血分层为无明显界限的两层，取上层液体，为保证吸取到全部血小板，可尽量取到红细胞层以上的包括白细胞在内的上层部分血浆。

[0038] 3.将获得的血浆离心3000g离心15min，温度22℃±2℃，使血小板下沉。

[0039] 4.轻轻吸出上层少血小板血浆，放于无菌试剂瓶中，作为制备培养成纤维细胞培养基的血清(使用时需要灭活)，余下5ml～10ml血浆沉淀，即为浓缩血小板，约可获得全血中80％以上的血小板。

[0040]以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

图1。