氯喹对戊四氮致痫大鼠脑内神经递质表达的影响

氯喹对戊四氮致痫大鼠脑内神经递质表达的影响
于宁;赵玉红;荆丽丽;吴淑华;曹璋
【摘要】目的研究氯喹对戊四氮(PTZ)致痫大鼠脑内星形胶质细胞介导的腺苷激酶(ADK)及谷氨酸(Glu)表达的影响,探讨氯喹在控制癫痫发作中的治疗作用及机制.方法 30只健康雄性SD大鼠随机分为对照组、戊四氮(PTZ)致痫组和氯喹干预组,每组10只.观察大鼠行为表现,记录脑电改变,免疫组化法检测3组大鼠脑内ADK 和Glu的表达水平.结果对照组大鼠无痫样发作,戊四氮(PTZ)致痫组大鼠癫痫发作严重(Ⅳ～Ⅴ级),脑电图记录呈频发高幅的癫痫样波,氯喹干预组大鼠的痫样发作有所减轻(Ⅰ～Ⅲ级),脑电图显示癫痫样波幅低且缓.戊四氮(PTZ)致痫组大鼠脑内ADK 和Glu表达增强,与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.01),采用氯喹干预后,大鼠脑内ADK及Glu表达降低,与癫痫组相比差异均有统计学意义(P＜0.05).结论氯喹可减轻癫痫大鼠的痫样发作,抑制脑内ADK的表达水平,并能降低Glu的含量.【期刊名称】《滨州医学院学报》
【年(卷),期】2019(042)004
【总页数】4页(P243-246)
【关键词】腺苷激酶;谷氨酸;氯喹;癫痫
【作者】于宁;赵玉红;荆丽丽;吴淑华;曹璋
【作者单位】滨州医学院附属医院病理科滨州256603;滨州医学院附属医院病理科滨州256603;滨州医学院烟台附属医院病理科;滨州医学院病理教研室;滨州医学院病理教研室
【正文语种】中文
【中图分类】R742.1
癫痫是神经系统的常见疾病，是脑内神经元细胞群过度放电引起的脑功能障碍，发病机制十分复杂，目前尚未完全阐明。

近年来，研究显示星形胶质细胞(astrocyte，Ast)增生、兴奋性神经递质和抑制性神经递质的失衡在癫痫发病过程中发挥重要作用。

腺苷(adenosine)全称为腺嘌呤核苷，可作为一种重要的因子，调节神经中枢兴奋性递质和抑制性递质的平衡[1-2]，其表达水平主要受腺苷激酶(adenaosine kinase, ADK)的调控。

谷氨酸(glutamate, Glu)是一类广泛存在于中枢神经系统的兴奋性氨基酸，在癫痫发生的过程中，存在谷氨酸的异常增多，从而导致Glu受
体的兴奋性增高，最终导致神经细胞兴奋性异常增高和细胞毒损害。

氯喹作为一种传统抗疟疾药，研究表明其具有广泛的生物学效应，前期研究表明，氯喹可抑制戊四氮致痫大鼠脑内星形胶质细胞的增生，控制癫痫发作[3-5]。

本研究运用氯喹作
为干预剂，研究氯喹对癫痫过程中腺苷与谷氨酸代谢的影响，为癫痫发作的有效防治提供有价值的理论和实验基础。

1 材料与方法
1.1 实验动物及分组选取30只成年健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠，体重为120～150 g，所有实验动物购自山东烟台绿叶公司动物中心。

实验室条件下饲养
实验大鼠，采用数字随机表法，将实验大鼠分为3组：对照组、PZT致痫组、氯
喹干预组，每组10只。

1.2 大鼠癫痫模型的制备 0.4%戊巴比妥钠(40 mg/kg)腹腔注射，麻醉后固定于立体定位仪上，进行右脑室注射。

对照组大鼠注射6 μL生理盐水，注射点坐标为：硬膜下3.8 mm，前囟后0.8 mm、中线右侧旁开1.5 mm，使用10 μL微量注射
器垂直注入。

PZT致痫组大鼠每日上午8:00腹腔注射0.5% PTZ(美国Sigma公司)溶液，剂量60 mg/kg。

氯喹干预组大鼠腹腔注射0.5% PTZ(美国Sigma公司)溶液后，2 h后侧脑室注射氯喹溶液(45 mg/kg，美国Sigma公司)进行干预，方法同前。

1.3 行为学观察和脑电记录行为学观察：仔细观察并记录3组实验大鼠的行为表现，其癫痫发作分级参照Racine评分标准。

脑电记录仪采用ASB240U生物信号采集分析系统。

实验大鼠麻醉后仰卧固定，采用皮下针形电极，分别对海马区、额叶皮层区进行脑电记录。

海马区定位为硬膜下0.5 mm、前囟后3.8 mm、中线两侧旁开
2.0 mm；皮层区定位为硬膜下0.5 mm，前囟前2 mm、中线旁开2.0 mm。

1.4 免疫组织化学染色检测ADK和Glu的表达
实验大鼠快速冰上开颅取出脑组织，浸入4%多聚甲醛中固定5～6 h，梯度酒精
脱水、二甲苯透明、石蜡浸蜡处理后进行组织包埋，以2～3 μm厚度连续切片。

实验前，切片置于60℃烤箱内30 min，依次浸入二甲苯进行脱蜡、梯度酒精进行水化。

经高压抗原修复后，切片置于3%过氧化氢中20 min，阻断内源性过氧化
物酶的活性。

加入一抗孵育：兔抗ADK抗体(1∶200，北京博奥森公司)、兔抗
Glu抗体(1∶1 000，Sant Cruz)，4℃过夜，复温1 h，加入二抗，37℃温箱内孵育30 min，滴加新配置的DAB溶液，每张切片显色3～5 min。

切片充分洗涤之后，浸入苏木素进行复染，盐酸分化，显微镜下观察切片染色质量。

每一操作步骤之间用PBS(0.01 mol/L)充分洗涤。

阴性对照实验用PBS代替一抗孵育切片。

1.5 结果判定及量化观察每例实验大鼠海马区和大脑皮质区的ADK和Glu的表达，以细胞质染成棕黄色为阳性标志。

每张切片随机观察5个200倍视野，应用显微
图像分析系统，计数每张图片的阳性细胞数目并测定其平均光密度(OD)值，实验
图片由Image-proplus病理图文分析系统进行分析。

1.6 统计学处理应用SPSS19.0统计学软件进行处理，采用检验比较各组间痫样发作的程度，采用t检验比较各组之间的差异。

以均数±标准差记录ADK和Glu免
疫组化OD值结果，P<0.05认为差异具有统计学意义。

2 结果
2.1 实验大鼠的行为学观察和脑电图记录对照组大鼠无痫样发作；PTZ致痫组大鼠、氯喹干预组大鼠均表现出程度不同的痫样发作，其中PTZ致痫组大鼠表现出Ⅳ～Ⅴ级的痫样发作，发作程度明显重于氯喹干预组(Ⅰ～Ⅲ级)，两组结果比较差异具有统计学意义(P<0.05)(见表1)。

脑电图记录显示，对照组大鼠无痫样放电，PTZ致痫组大鼠的脑电图呈现频发高幅的尖波、棘波、棘慢波或棘慢复合波，氯
喹干预组大鼠脑电图则显示出慢波和小棘波(见图1)。

表1 3组大鼠癫痫发作程度的比较组别例数无(0级)轻(Ⅰ-Ⅲ级)重(Ⅳ-Ⅴ级)对照组10 10——PTZ致痫组 10 — 1 9氯喹干预组 10 — 8 2
2.2 ADK免疫组化结果 ADK表达于胞浆，对照组大鼠脑内星形胶质细胞内微弱表达。

在PTZ致痫大鼠的海马和皮质中，ADK表达明显增强，与对照组大鼠比较差异有统计学意义(P<0.01)。

氯喹干预组大鼠ADK表达明显降低，尤其是在海马区，与PTZ致痫组、对照组大鼠比较差异有统计学意义(P<0.05)；氯喹干预组ADK表达与对照组差异有统计学意义(P<0.05) (见图2，表2)。

2.3 Glu免疫组化结果 Glu在胶质细胞胞浆内表达。

与对照组相比，Glu在PTZ致痫组大鼠脑内海马区和皮质区表达明显增强(P<0.01)。

采用氯喹作为干预治疗后，星形胶质细胞中Glu的表达显著降低，与PTZ致痫组大鼠皮质区及海马区Glu的表达具有显著差异性(P<0.05)，其表达与对照组相比，差异无统计学意义(P>0.05) (见图3，表2)。

3 讨论
1977年 Besedovsky 提出免疫—神经—内分泌网络学说，此网络的调节失衡与癫痫的发病密切相关，神经因素在该网络失衡中占主导地位[6]。

有研究认为癫痫发
生的病理生理基础是神经元异常放电，与神经系统中兴奋性和抑制性神经递质之间的平衡失调有关，在这个过程中，Ast在中枢系统细胞外神经递质水平的调控中起重要作用[7]，是调节神经突触递质的关键。

癫痫状态下，Ast异常增生，形态和
功能都出现异常，使抑制性神经递质腺苷和兴奋性神经递质谷氨酸的表达水平失衡，从而导致大鼠出现痫样发作。

氯喹是一种传统的抗疟药，具有广泛的生物学效应，主要通过干扰 DNA 复制和抑制蛋白质合成发挥作用[8-9]。

前期研究结果显示[3-5]，氯喹能抑制癫痫状态下星形胶质细胞的增生，减轻癫痫发作的程度。

张树华等研究表明，氯喹还能降低TNF-α和IL-1的表达水平、抑制谷氨酸受体表达[10]。

本研究采用戊四氮诱发实验大鼠的癫痫发作，免疫组化结果显示癫痫大鼠脑内皮质和海马区ADK过度表达。

ADK仅仅存在于星形胶质细胞中，是决定突触内腺苷浓度、调控突触兴奋性传播的关键酶，ADK可将细胞内的腺苷磷酸化生成一磷酸腺
苷(Adenosine monophosphate，AMP)，进一步形成三磷酸腺苷(Adenosine triphosphate，ATP)，从而降低细胞内腺苷浓度，细胞外的腺苷能通过星形胶质
细胞膜上的核苷转运体进入细胞内。

因此，细胞内ADK是腺苷代谢的关键酶，其表达水平的微小变化，会导致腺苷水平出现较大的改变[11]。

因此，癫痫状态的大鼠脑内ADK的过表达，会导致腺苷水平也明显降低，造成大鼠痫样发作。

采用氯喹作为干预剂之后，ADK的表达明显降低，腺苷的表达水平也随之增加，并且脑
电记录显示为慢波和小幅度的尖波，表明氯喹能减轻大鼠痫样发作的程度。

腺苷是一种抑制性神经递质，是内源性的抗惊厥剂，细胞外腺苷水平是决定癫痫发作易感
性的关键因素之一。

腺苷对神经抑制作用主要是通过与A1R结合而实现的，腺苷
与A1R受体结合之后，通过降低细胞膜对钙离子的通透性，阻止兴奋性神经递质
谷氨酸的释放及其引导的神经元除极效应[12]。

谷氨酸是脑内最重要的兴奋性神经递质，星形胶质细胞能够表达高亲和力的谷氨酸转运体GLT-1，将细胞外的谷氨酸快速摄取到细胞内，减少细胞外谷氨酸的蓄积，对维持神经网络兴奋性的平衡起着重要作用[13]。

癫痫状态下，激活的星形胶质细胞增生，功能紊乱，导致谷氨酸—谷氨酰胺循环相关酶和转运功能的丢失和降低，突触前膜对谷氨酸再摄取障碍，从而造成谷氨酸清除速率缓慢，使得Glu在癫痫
病灶中浓度升高，导致同步异常放电产生癫痫发作。

本研究结果显示，癫痫大鼠脑内兴奋性神经递质谷氨酸的表达明显增加，应用氯喹作为干预剂之后，癫痫大鼠脑内谷氨酸的表达明显下降。

这是由于氯喹能通过与CaM结合，抑制Ca2+细胞内流。

而细胞内Ca2+ 浓度升高，能有效地激活Glu信号传导通路。

因此氯喹能够
阻断Glu信号通路的传导效率，下调Glu的表达，使得神经元兴奋性降低，减轻
了癫痫大鼠的痫样发作[10]。

本研究表明氯喹干预组ADK和Glu的表达虽然较癫痫组相比明显下降，但是与正常组相比仍存在差异，表明氯喹的干预并不能完全改善癫痫状态下神经递质的失衡。

因此，如何在癫痫治疗中合理地应用氯喹，既达到抑制癫痫的治疗目的，又能最大限度地避免药物不良反应，需进一步的研究和探讨。

参考文献
【相关文献】
[1] Dulla C G, Masino S A. Physiologic and metabolic regulation of adenosine: Mechanisms[M]. Adenosine: Springer, 2013: 87-107.
[2] 陈宇亮,张亚楠,李润平.腺苷在癫痫发病机制中的作用以及腺苷相关癫痫治疗的研究进展[J].现代生物医学进展,2014, 14 (26): 5180-5188.
[3] 荆丽丽,谭宏伟,于静,等.不同剂量氯喹对戊四氮慢性致痫大鼠脑内谷氨酸受体2表达的影响[J]. 中国医药导报, 2014,11(15):10-12.
[4] 于宁,朱玉红,荆丽丽,等. 氯喹对戊四氮慢性致痫大鼠脑皮质及海马腺苷激酶表达的影响[J]. 中华神经医学杂志，2013,12(4):343-346.
[5] 荆丽丽,吴淑华,杨东霞,等. 氯喹对戊四氮慢性致痫大鼠海马GluR2及nNOS表达的影响[J].神经解剖学杂志，2011,27(4):428-432.
[6] 朱长庚. 神经-免疫-内分泌网络与癫痫发病机理的关系[J]. 解剖学报,2002,33(3):321-324.
[7] Arne Schousboe, Lasse Kristoffer Bak, Karsten Kirkegaard Mdsen, et al. Amino acid neurotransmitter synthesis and removal [M].Neuroglia. Oxford University Press: Oxford, 2012:443-456.
[8] Briceo E, Calderon A, Sotelo J. Institutional experience with chloroquine as adjuvant to the therapy for glooblastoma multiforme[J]. Surg Neurol,2007,67(4):388-391．
[9] Savarino A, Boelaert J R, Cassone A, et al. Effects of chloroquine on viral infections: an old drug against today's diseases?[J]. Lancet Infections Diseases, 2003, 3(11):722-727. [10] 张树华,朱长庚,刘庆莹，等. 氯喹对戊四氮致痫大鼠皮质和海马谷氨酸和NMDAR1表达的影响[J]. 中国组织化学与细胞化学杂志,2006, 15(1):18-23.
[11] Etherington L V, Patterson G E, Meechan L, et al. Astrocytic adenosine kinase regulates basal synaptic adenosine levels and seizure activity but not activity-dependent adenosine release in the hippocampus[J]. Neuropharmacology, 2009,56(2): 429-437. [12] Muzzi M, Coppi E, Pugliese A M, et al. Anticonvulsant effect of AMP by direct activation of adenosine A1 receptor [J]. Experimental neurology, 2013, 250:189-193. [13] Micheli M R, Bova R, Laurenzi M A, et al.Modulation of BDNF and TrkB expression in rat hippocampus in response to acute neurotoxicity by diethyldithiocarbamate[J]. Neuroscience Letters，2006,410(1):66-70.。