如何提取出高质量RNA？一文带你“扫雷”

如何提取出⾼质量RNA？⼀⽂带你“扫雷”
RNA，核糖核酸，是动植物细胞、部分病毒及类病毒的遗传信息载体，如今已成为⼤量⽣物学科研⼈员重点研究领域，RNA提取技术作为分⼦⽣物学研究中的基本技术,对研究材料进RT-PCR、cDNA⽂库的构建、蛋⽩质的体外翻译等均需要提取⾼质量的RNA。

然⽽RNA很
是“娇弱”，⼀不⼩⼼就会提取失败。

究其原因主要是RNase的内外源性污染。

RNase是⼀种相对稳定遍布我们⽣活的⼀种核酸内切酶，⽐如我们的双⼿、实验仪器、周围环境，甚⾄样品本⾝
都有RNase的存在，它能催化RNA⾼效降解,因此能否有效防⽌RNase 的污染，是提取⾼质量RNA的关键。

本⽂以植物为试材, 介绍⼆种常⽤的植物组织RNA的提取⽅法———试剂盒法和trizol法。

在提取RNA之前，准备⼯作是必须要进⾏的，这决定了RNA提取的成败与否。

⼀、仪器准备和消毒
⾸先是实验器具和仪器的清理和消毒，需要⽤到的器材和溶液有：研磨棒、研钵（有研磨仪的
可不⽤研磨棒和研钵）、剪⼑、镊⼦、钢珠、液氮、RNase free的离⼼管和圆底EP管、DEPC ⽔（1ml DEPC加1000 ml⽆菌⽔）、DEPC处理⽔（DEPC⽔经湿热⾼温灭菌后的⽔）。

将上
述的⾦属制品和研磨棒、研钵先⽤0.5mol/L NaOH冲洗⼲净后放⼊DEPC⽔中浸泡过夜，⽤锡箔纸包住，以180°⾼温灭菌4 h，即完成准备⼯作。

⼆、取样
从植物取50mg-80mg样品，快速⽤DEPC处理⽔清洗表⾯，将灭菌后的剪⼑和镊⼦将样品剪成
⼩块加钢珠装⼊RNase free的圆底EP管中，放⼊液氮罐中以-80°保存预冷。

三、提取
⾸先介绍的是试剂盒法，试剂盒法是⼀种由专业试剂⽣产公司⽣产出来装有⼀整套RNA提取试
剂的试剂盒⼦，有擎科、天根、TAKALA等众多牌⼦试剂盒，优点是简单快捷⽅便，对于⼩⽩
来说易上⼿，缺点是成本⾼，此外试剂盒法主要针对⼤众样品，对于⼀些特殊样品效果可能⼀般。

从液氮罐中取出将装有样品的EP管放⼊已经预冷好的研磨仪中，快速研磨，如果⽤的是研钵，需要加⼊液氮充分研磨，研磨时间不能超过1分钟，样品磨成粉末后，按照试剂盒说明书添加试剂，即可完成RNA提取，⽤试剂盒提取，2⼩时即可完成⼀批RNA提取⼯作。

其次介绍的是Trizol法，Trizol主要物质是异硫氰酸胍，它可以破坏细胞使RNA释放出来的同
时，保护RNA的完整性Trizol试剂操作上的允许同时处理多个的样品，Trizol抽提的总RNA能够避免DNA和蛋⽩的污染，缺点是需要⾃⼰配置试剂，⽐较繁琐。

试剂：TRIzol 试剂、氯仿、异丙醇、75% ⼄醇（DEPC H2 O 配制）、DEPC H2O
提取步骤：
（1）组织样品按100mg加⼊1ml Trizol。

另外，组织体积不能超过Trizol体积的10%，否则匀浆效果会不好。

（2）加Trizol后，室温放置5min，使其充分裂解。

（3）4℃，12,000rpm 离⼼10 min，取上清。

（4）按200ul氯仿/ml Trizol加⼊氯仿，剧烈振荡混匀后室温放置3 min。

（氯仿为有机溶剂，有效的使有机相和⽆机相迅速分离。

有机相中主要是酚和蛋⽩结合，从⽽使得蛋⽩和RNA脱
离，RNA进⼊⽔相）
（5）4℃ 12,000rpm离⼼15min。

吸取上层⽔相，⾄另⼀离⼼管中。

（6）得到的⽔相溶液加⼊等体积异丙醇混匀，室温放置10 min。

（7）4℃ 12,000rpm离⼼10min，弃上清，RNA沉于管底，成胶状沉淀。

（8）按1ml 75%⼄醇/ml Trizol加⼊75%⼄醇（沉淀RNA），温和振荡离⼼管，悬浮沉淀。

（9）4℃ 10000rpm离⼼5min，尽量弃上清。

（10）室温晾⼲或真空⼲燥5-10min。

注：RNA样品不要过于⼲燥，否则很难溶解。

可⽤50ul DEPC H 2 O反复吹打溶解RNA样品。

四、质量检测：
提取出来的RNA需要进⾏质量浓度检测，以判断是否得到⾼质量的RNA，检测⽅式有两种，⼀种是电泳检测，⼀种是紫外分光光度计法。

（1）电泳检测法：分别取5 µL RNA 样品加上1 µL 1xloadingBuffer上样缓冲液，在1%普通琼脂糖凝胶上电泳，电压 90 V，电泳 30 min 后在凝胶成像系统下观察RNA 带型。

⼀般⾼纯度的植物 RNA 电泳图谱中有 28S rRNA和18S rRNA两条特征性条带，28S rRNA 和18S rRNA 条带内侧、条带上⽅和条带下⽅⼏乎没有弥散现象，且28S rRNA 条带宽度和亮度是18S rRNA 条带 2倍左右，两条条带明亮且⼀致，则表明提取的RNA没有降解，保持了完整性。

（2）紫外分光光度计法：根据核酸具有紫外吸收特征，还可选⽤超微量紫外分光光度计法测定波长在230nm、260nm 及280nm 下的光密度值，并计算 OD260/ OD280及 OD260/OD230的⽐值和RNA浓度。

通常RNA浓度需要≥100 ng/µL，OD260/ OD280⽐值在 1.8～2.0 范围之间，表明所提 RNA 质量较⾼，28S rRNA 和 18S rRNA 条带没有发⽣明显降解，若 OD260/ OD280⽐值低于1.8 则说明存在蛋⽩质污染；⽽ OD260/ OD230⽐值通常在 2.0～2.4 之间，表明所提 RNA 纯度较⾼，但对于植物 RNA ⽽⾔，若 OD260/ OD230⽐值低于2.0，则表明RNA有其他物质⼲扰，质量不纯。

五、保存
提取出来的RNA通常会有微量的RNase出现，随着时间的延长，会让RNA逐渐降解，因此需要尽快进⾏后续试验，如果试验未能及时进⾏，需要将RNA放⼊液氮中冷藏保存。

注意事项：
RNA提取是否成功的关键是RNase内外源性污染
1.在RNase外源性污染控制上，⼀是需要做到操作上需要经常更换⼿套，并且最好在超净台上操作；⼆是实验⼈员佩戴⼝罩，减少⼈员流动；三是⾃配试剂都必须⽤DEPC⽔配置，以防治外源性RNase污染。

2.在RNase内源性污染控制上，⼀是样品研磨需要-80℃预冷且快速研磨；⼆是要取适量的植物材料进⾏研磨，材料少会使 RNA 浓度低，材料多容易造成⾃⾝的 RNAse 过多⽽导致 mRNA
的降解，还可能使材料研磨的不够充分，进⽽后续与溶液反应不彻底；三是所⽤的试剂都必须经过预冷；四是全程低温离⼼。

总结：
RNA的好坏直接影响分⼦分析的后续试验，⾼质量的RNA是进⾏转录组测序、RT-PCR等试验的基础，只要我们细⼼处理好每⼀个步骤，尽量减少污染，就能够提取出⾼质量的RNA。

END。