分子生物学研究法
分子生物学10
三、离子交换层析
• 离子交换层析 离子交换层析（ion exchange chromatography, IEC）是 根据物质自身所带电荷的不同进行分离的层析技术。如二 乙基氨基乙基－交联葡聚糖（DEAE-Sephadex）层析就 是使用带有正电荷的二乙基氨基乙基（DEAE）的带电基 团作为树脂填料来分离物质。这些带有正电荷的DEAESephadex吸附带有负电荷的物质如蛋白质并与之相结合。 这些带有负电荷的物质所带的负电荷越多，它们之间的结 合也就越紧密。
四、原位杂交
• 原位杂交（(in situ hybridization, ISH）是 原位杂交（ ） 让细胞中的染色体扩散，使DNA部分变性 产生能与标记探针杂交的单链，通过染色 确定染色体所在，而通过放射自显影确定 目的基因所在，从而确定目的基因在哪一 条染色体上。
• 将DNA探针用能被荧光 抗体检测的二硝基酚标记， 可以确定肝糖磷酸化酶基 因位于人11号染色体上， 染色体用碘化丙啶（PI） 染色，发出红色荧光；而 以红色为背景，位于11 号染色体上的抗体探针的 黄色是很明显的。这种使 用荧光标记探针的技术就 是荧光原位杂交 （Fluorescence in situ hybridization FISH）。
DNA分型（DNA typing）技术，又称 分型（ 指纹技术， 分型 ）技术，又称DNA指纹技术，是对人类基因 指纹技术 组中具有多态性的重复序列进行基因分型的技术。 组中具有多态性的重复序列进行基因分型的技术。
三、RNA印迹杂交 印迹杂交
• Northern blot用于判断完整RNA的量和大小，这 是一种将RNA从琼脂糖凝胶中转印到硝酸纤维素 膜上的方法。DNA印迹技术由Southern于1975年 创建，称为Southern印迹技术。RNA印迹技术正 好与DNA相对应，故被趣称为Northern印迹杂交 印迹杂交， 印迹杂交 与此原理相似的蛋白质印迹技术则被称为 Western blot。
分子生物学的研究方法例题和知识点总结
分子生物学的研究方法例题和知识点总结分子生物学是一门从分子水平研究生命现象、生命本质、生命活动及其规律的科学。
它的研究方法多种多样，下面我们将通过一些例题来深入理解这些方法，并对相关知识点进行总结。
一、核酸提取与纯化核酸包括 DNA 和 RNA，是分子生物学研究的重要对象。
提取和纯化高质量的核酸是后续实验的基础。
例题：从植物叶片中提取总 DNA，需要经过哪些步骤？知识点：1、破碎细胞：使用机械研磨、酶解法等破坏细胞壁和细胞膜，释放出核酸。
2、去除杂质：通过加入蛋白酶 K 去除蛋白质，用酚/氯仿抽提去除酚类、多糖等杂质。
3、沉淀核酸：常用乙醇或异丙醇沉淀 DNA，离心后获得核酸沉淀。
4、洗涤和溶解：用 70%乙醇洗涤沉淀去除盐分，干燥后用适当的缓冲液溶解。
二、PCR 技术（聚合酶链式反应）PCR 是一种用于扩增特定 DNA 片段的技术。
例题：设计一对引物用于扩增某基因的特定片段，需要考虑哪些因素？知识点：1、引物长度：通常为 18 25 个核苷酸。
2、碱基组成：G ＋ C 含量在 40% 60%之间，避免形成稳定的二级结构。
3、特异性：引物要与目的基因特异性结合，避免与其他序列有过多的同源性。
4、退火温度：根据引物的碱基组成计算退火温度，以保证扩增的特异性和效率。
PCR 的基本步骤包括：1、变性：高温使双链 DNA 解离为单链。
2、退火：降低温度，引物与单链 DNA 结合。
3、延伸：在 DNA 聚合酶的作用下，从引物 3'端开始合成新的DNA 链。
三、基因克隆基因克隆是将目的基因插入到载体中，导入宿主细胞进行复制和表达。
例题：简述构建重组质粒的过程。
知识点：1、目的基因获取：可以通过 PCR 扩增、从基因文库中筛选等方法获得。
2、载体选择：常见的载体有质粒、噬菌体等，要根据实验需求选择合适的载体。
3、酶切和连接：用相同的限制性内切酶分别切割目的基因和载体，然后用 DNA 连接酶将它们连接起来。
(整理)分子生物学研究方法.
一．名词解释IP（免疫沉淀、免疫印迹）：是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。
这个实验是用特异性抗体结合细胞裂解液中的目的蛋白，洗涤后解离特异性抗体和目的蛋白质，经聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），最后用Western blot分析目的蛋白质。
这种方法可以分析溶液中的、细胞内的、结合在细胞膜上的蛋白质或者受体，但只能是定性或者半定量的实验。
NLS（核定位序列）：核定位信号是另一种形式的信号肽, 可位于多肽序列的任何部分。
一般含有4～8个氨基酸, 且没有专一性, 作用是帮助亲核蛋白进入细胞核。
可分为单一型NLS和双分型NLS。
单一型NLS，由一段连续的碱性氨基酸序列排列而成（RKKKRKV），双分型NLS，有两段碱性氨基酸被中间10~12GE 非特异性氨基酸所分割而形成，（KRPAA TKKAGQAKKKKLDK）。
SUMO（small ubiquitin-related modifier）：是一种小的泛素相关修饰蛋白，它与泛素在序列上虽只有18%相同，但在二级结构和三级结构上有惊人的相似。
SUMO家族成员都有独特的N端氨基酸序列和C端外延序列。
SUMO 化（sumoylation）的功能与泛素化（ubiquitination）不同，它并不是蛋白降解，反而加强它们的稳定性或调解它们在细胞内的定位和分布，甚至与凋亡相关。
二．问答题1.什么是近交系小鼠，它们有什么特征？有哪些常见的近交系小鼠？答：近交系小鼠：是经连续20代（或以上）的全同胞兄妹交配（或亲代与子代交配）培育而成的小鼠，品系内所有个体都可追溯到起源于第20代或以后代数的一对共同祖先。
特性：①基因位点的纯合性（Homozygosity）近交系小鼠中任何一个基因位点上纯合子的概率高达99％，因而也能繁殖出完全一致的纯合子后代。
②遗传组成的同源性（Isogenicity）品系内所有动物个体都可追溯到一对共同祖先，个体在遗传上是同源的，基因型完全一致。
分子生物学 分子生物学研究法
5‘ 供者
探针
3‘ 受者
Taqman法 分子信标(molecular beacon)法
高效液相色谱 ＭＡＬＤＩ-ＴＯＦ质谱分析法 DNA芯片技术（DNA chip）
SNP数据库
国立生物技术信息中心 德国的HGBAS网站
JST的数据库
2.5基因打靶(gene targeting)
通过DNA定点同源重组，改变基因组中 的某一特定基因，在生物活体内研究该 基因的功能。(反向遗传学)
抗原－抗体 特异性结合
SDS-PAGE 后转膜
基因表达产 物――蛋白
的检测
ELISA 原理和用途类似于Western blot,但在酶标板中操作，无需SDSPAGE转膜，操作简单，可批量检测，并可半定量测定。
Southern blot
Northern blot
Western blot
双脱氧法测序
gradient gel electrophoresis,DGGE) 原理:当双链DNA在变性梯度凝胶中进行 到与DNA变性温度一致的凝胶位置时， DNA发生部分解链，电泳迁移率下降， DNA链中有一个碱基改变时，会在不同 的时间发生解链，因影响电泳速度变化 的程度而被分离。
荧光共振能量传递 (fluorescent resonance energy transfer, FRET)
基因敲除(gene knockout)：定向敲除 基因敲入(gene knockin)：定向替代
基因打靶的必备条件
胚胎干细胞(ES细胞)
能在体外培养，保留发育的全能性
打靶载体
Neo（新霉素）阳性筛选标志 HSV-tk阴性筛选标志：单纯疱疹病毒
(herpes simplex virus) 胸腺嘧啶激酶 (thymidine kinase)
分子生物学研究方法
分子生物学研究方法
首先，核酸提取与分析是分子生物学的基础。
通过从生物体细胞中提
取核酸，可以获得DNA和RNA的样本，为后续的实验提供原料。
核酸的分
析方法包括凝胶电泳和聚合酶链式反应（PCR）等。
凝胶电泳可以根据核
酸分子的大小和电荷差异进行分离，从而获得目标核酸的纯度和浓度信息。
PCR是一种体外扩增DNA的方法，可以在短时间内从少量的DNA模板扩增
到大量的DNA产物，为后续实验提供更多的材料。
其次，蛋白质的表达与纯化是分子生物学的另一个重要研究方法。
蛋
白质是生物体内功能的执行者，因此研究蛋白质的表达与功能对于揭示生
命活动的机理具有重要意义。
蛋白质的表达通常利用重组DNA技术，将目
标基因克隆到可表达载体中，并转化到细菌或其他表达系统中。
随后，通
过诱导表达、细胞破碎、蛋白质纯化等步骤，最终获得目标蛋白质的产物。
蛋白质的纯化方法包括亲和层析、离子交换层析、凝胶过滤等多种方法，
可以根据蛋白质的性质和特点选择合适的方法进行纯化。
另外，生物信息学和计算生物学方法也是分子生物学研究的重要手段。
随着DNA测序技术的快速发展，大规模的基因组、转录组和蛋白质组数据
被不断积累，因此需要开发合适的计算方法进行存储、管理和分析这些数据。
生物信息学和计算生物学的研究方法涉及到生物数据库的建立和维护、序列比对、基因和蛋白质结构预测、分子动力学模拟等等。
这些方法可以
帮助研究人员更好地理解和分析分子生物学数据，从而揭示生命活动和疾
病发生发展的机理。
分子生物学研究方法教案
分子生物学研究方法教案一、教学目标1、让学生了解分子生物学的基本概念和研究范畴。
2、使学生掌握常见的分子生物学研究方法，包括其原理、操作步骤和应用领域。
3、培养学生的实验设计能力和科学思维，能够运用所学方法解决实际问题。
二、教学重难点1、重点（1）PCR 技术的原理和应用。
（2）核酸电泳技术的原理和操作。
（3）基因克隆的基本流程。
2、难点（1）PCR 反应体系的优化和常见问题的解决。
（2）基因克隆中载体的选择和构建。
三、教学方法1、讲授法：讲解分子生物学研究方法的基本原理和关键步骤。
2、演示法：通过多媒体展示实验过程和结果，增强学生的直观感受。
3、讨论法：组织学生讨论实验设计和结果分析，培养学生的思维能力。
四、教学过程1、课程导入（1）通过介绍一些与分子生物学相关的疾病诊断、基因治疗等实际应用案例，引起学生的兴趣，引出分子生物学研究方法的重要性。
2、分子生物学研究方法概述（1）简单介绍分子生物学的定义和研究对象，如 DNA、RNA、蛋白质等生物大分子。
（2）列举常见的分子生物学研究方法，如 PCR、核酸电泳、基因克隆、DNA 测序等。
3、 PCR 技术（1）原理：讲解 PCR 技术的基本原理，即通过高温变性、低温退火和适温延伸的循环过程，实现 DNA 片段的指数扩增。
（2）反应体系：介绍 PCR 反应体系的组成成分，包括模板 DNA、引物、dNTPs、Taq DNA 聚合酶和缓冲液等，并说明各成分的作用。
（3）操作步骤：详细讲解 PCR 的操作步骤，包括模板 DNA 的制备、引物设计、反应体系的配制、PCR 扩增程序的设置等。
（4）应用：举例说明 PCR 技术在基因诊断、遗传分析、物种鉴定等方面的应用。
4、核酸电泳技术（1）原理：解释核酸电泳的原理，即根据核酸分子在电场中的迁移速率不同来分离和鉴定核酸片段。
（2）琼脂糖凝胶电泳：介绍琼脂糖凝胶电泳的操作方法，包括凝胶的制备、样品的加载、电泳条件的设置等。
分子生物学研究方法
优点
（1）相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的，处于天 然状态； （2）蛋白的相互作用是在自然状态下进行的，可以避 免人为的影响； （3）可以分离得到天然状态的相互作ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ蛋白复合物。
缺点
（1）可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质－蛋白 质相互作用； （2）两种蛋白质的结合可能不是直接结合，而可能 有第三者在中间起桥梁作用； （3）必须在实验前预测目的蛋白是什么，以选择最 后检测的抗体，所以，若预测不正确，实验就得不到 结果，方法本身具有冒险性。 （4）灵敏度没有亲和色谱高。
➢通过报告基因的功能筛选相互作用的蛋白。
Bait and Hunter Plasmids
Yeast two-hybrid transcription
Transfection
举例
3. GST融合蛋白沉降技术
▪ 研究体外蛋白质相
互作用技术
▪ 利 用 GST 对 谷 胱 甘
肽偶联的琼脂糖球 珠的亲和性，从混 合蛋白质样品中纯 化得到相互作用蛋 白。
操作步骤
（1）转染后24-48 h 可收获细胞，加入适量细胞裂解缓冲液 （含蛋白酶抑制剂），冰上裂解30min, 细胞裂解液于4°C， 最 大转速离心30 min后取上清； （2）取少量裂解液以备Western blot分析，剩余裂解液加1μg 相应的抗体加入到细胞裂解液，4°C缓慢摇晃孵育过夜； （3）取10μl protein A 琼脂糖珠，用适量裂解缓冲液洗3 次，每 次3,000 rpm离心3 min； （4）将预处理过的10μl protein A 琼脂糖珠加入到和抗体孵育 过夜的细胞裂解液中4°C缓慢摇晃孵育2-4h，使抗体与protein A琼脂糖珠偶连； （5）免疫沉淀反应后，在4°C 以3,000 rpm 速度离心3 min， 将琼脂糖珠离心至管底；将上清小心吸去，琼脂糖珠用1ml裂解 缓冲液洗3－4次；最后加入15μl的2×SDS 上样缓冲液，沸水煮 5分钟； （6）SDS-PAGE, Western blotting或质谱仪分析
分子生物学的新研究方法
分子生物学的新研究方法分子生物学是生物学的一个重要分支，研究对象是生命体内分子层面上的生命过程。
随着生物学研究的深入，分子生物学的研究方法也在不断地发展和更新。
本文将介绍分子生物学的新研究方法，包括单细胞测序、CRISPR-Cas9技术和光遗传学。
一、单细胞测序在分子生物学的研究中，传统的测序方法只能对大量细胞的基因表达进行测量。
然而，单个细胞的表达谱是有差异的，这些差异都不能被所谓的平均值来描述。
因此，单细胞测序近年来得到普及。
单细胞测序技术能够快速地捕获单个细胞的转录组数据，并从成千上万个单细胞中识别和分类。
它能够揭示细胞之间的多样性和功能异质性，并为研究单个细胞的生命过程提供丰富的信息。
单细胞测序技术主要分为两种：单细胞RNA测序（scRNA-seq）和单细胞DNA测序（scDNA-seq）。
其中，scRNA-seq技术应用最为广泛。
二、CRISPR-Cas9技术CRISPR-Cas9技术是近年来分子生物学研究中的一大亮点。
它是一种基于人造的DNA切割工具，可以实现精准、高效的基因编辑。
CRISPR-Cas9技术以一种快速、简单和高效的方式来操纵基因中的特定序列。
它能够去除、添加或修复基因的特定区域，并在细胞、组织和动物等多种模型中得到应用。
CRISPR-Cas9技术已经在众多领域得到了成功的应用，如基因治疗、疾病诊断和治疗、农业生产等。
它被认为是基因工程领域的一项革命性技术。
三、光遗传学光遗传学是一种新的分子生物学研究方法，在光和基因学的交叉领域中应用较广。
它利用人造的光敏蛋白来刺激或抑制细胞的活动，并实现对生命过程的基因表达和神经元活动的精确控制。
光遗传学技术主要依赖于两类光敏蛋白：一类是光激活钠离子通道（如ChR2），可触发神经元的电信号；另一类是光抑制钙离子通道（如NpHR），可以用于精确抑制神经元活动。
这种技术可在分子和细胞层面促进生命过程的研究。
光遗传学技术的应用范围广泛，包括神经科学、基因工程、药物研发等。
分子生物学的研究方法
分子生物学的研究方法分子生物学是生命科学领域中的重要分支，研究生物大分子（如DNA、RNA、蛋白质等）的结构、功能及其在生物体内的相互作用关系。
分子生物学的研究方法随着技术的不断进步，越来越高效、精准。
本文将介绍几种常见的分子生物学研究方法。
1. PCR技术PCR技术是分子生物学中最常用的研究方法之一。
PCR技术简单来说就是以DNA为模板，通过循环加热和降温的方式使DNA 分离成两条单链，并利用DNA聚合酶合成新的DNA分子。
通过PCR技术可以扩增目标DNA片段，为其他分子生物学研究提供了重要的基础。
PCR技术的具体操作是：首先选择适当的引物，引物是一段长度为15~30个核苷酸的单链DNA，与目标DNA上的两端互补，可用来定向扩增DNA。
然后将待扩增的DNA样品与引物混合，加入适当浓度的DNA聚合酶和反应缓冲液，反复加热降温，反应若干个周期后，就可以得到扩增的DNA产物。
近年来，PCR技术不断发展，出现了许多高级变体，如RT-PCR技术和qPCR技术等。
这些技术在分子生物学、医学以及疾病诊断等领域得到了越来越广泛的应用。
2. 质谱技术质谱技术是一种分析化学技术，用于测定化合物的分子量、化学式以及数量等信息。
在分子生物学中，质谱技术主要用于分析蛋白质和核酸的结构和功能。
质谱技术的基本原理是将待测样品中的分析物（如蛋白质、核酸等）转化成气态或溶液状态下的离子，并利用质谱仪测定离子的质荷比。
通过离子的质谷比可以确定分析物的分子量、化学式以及数量等信息。
质谱技术的应用范围非常广泛，包括蛋白质组学、代谢组学以及疾病诊断等领域。
随着技术的不断进步，质谱技术也变得更加高效、精准，未来将有更多的应用。
3. 基因编辑技术基因编辑技术近年来获得了长足发展，它可以通过将基因序列中的单个碱基替换、插入或删除，来打造定制化的基因组序列。
这种技术有巨大的应用潜力，可以用于人类基因疾病的治疗以及植物、动物品种改良等领域。
基因编辑技术最常用的手段是CRISPR-Cas9系统，它是一种通过结合RNAs和酶分子来定向剪切DNA的系统。
分子生物学实验
分子生物学实验引言分子生物学实验是研究生物体分子层面的结构和功能的实验方法。
通过在分子水平上研究细胞中的基因表达、蛋白质合成和代谢等过程，可以全面了解生物体的生理机制和疾病发生的分子基础。
本文将介绍常见的分子生物学实验方法和技术。
1. DNA提取实验DNA提取是分子生物学实验中的基础步骤，它的目的是从细胞中分离出DNA。
常用的DNA提取方法有酚/氯仿法、CTAB法和商业试剂盒法等。
以下是酚/氯仿法的步骤：1.收集样本组织或细胞：可以使用动植物组织、细菌、真菌等样本。
2.细胞破碎：使用细胞破碎缓冲液将样本破碎，释放出内部的细胞和胞浆。
3.蛋白质沉淀：加入酚/氯仿缓冲液，使蛋白质从细胞裂解物中沉淀。
4.DNA沉淀：将上一步的上清液加入异丙醇中沉淀DNA。
5.洗涤和溶解：用乙醇洗涤并净化DNA沉淀，最后用缓冲液溶解DNA。
2. PCR实验PCR（聚合酶链反应）是分子生物学中的一种重要技术，用于扩增特定的DNA片段。
PCR实验一般包括以下步骤：1.DNA模板准备：提取好的DNA作为PCR反应的模板。
2.反应组分配置：配置PCR反应体系，包括引物、脱氧核苷酸（dNTPs）、聚合酶和缓冲液等。
3.反应条件设定：设置PCR反应的温度和时间参数，包括变性、退火和延伸步骤。
4.PCR扩增反应：将PCR反应体系放入热循环仪中进行循环扩增。
5.PCR产物分析：使用凝胶电泳等方法对PCR产物进行分析和检测。
3. 克隆实验克隆实验是将DNA片段插入到载体DNA中，并通过细胞转化和筛选得到含有目标DNA的克隆。
以下是常见的克隆实验步骤：1.DNA片段选择：根据需要选择目标DNA片段，并通过酶切或PCR方法制备。
2.载体准备：选择适当的载体，如质粒或噬菌体，并进行酶切或PCR扩增。
3.构建重组体：将目标DNA片段和载体DNA连接，形成重组DNA。
4.细胞转化：将重组DNA引入宿主细胞中。
5.筛选克隆：通过筛选方法（如抗生素筛选）获得含有目标DNA的克隆。
生物学中的分子生物学研究方法
生物学中的分子生物学研究方法引言：生物学中的分子生物学研究方法是一门重要的学科，它通过研究生物体内分子的结构、功能和相互作用，揭示生命的本质和机制。
本文将从分子生物学的基础知识、实验技术和应用领域三个方面，探讨分子生物学研究方法的发展与应用。
一、分子生物学的基础知识1. DNA的结构与功能DNA是生物体内最基本的遗传物质，它的结构和功能对于理解生命的本质至关重要。
本节将介绍DNA的双螺旋结构、碱基配对规则以及DNA的复制、转录和翻译等功能。
2. RNA的结构与功能RNA在细胞中扮演着重要的角色，包括mRNA、tRNA和rRNA等。
本节将介绍RNA的结构与功能，以及RNA在基因表达和蛋白质合成中的作用。
3. 蛋白质的结构与功能蛋白质是生物体内最重要的功能分子，其结构和功能多样性决定了生物体的形态和功能。
本节将介绍蛋白质的结构层次、蛋白质的折叠和功能以及蛋白质与其他分子的相互作用等内容。
二、分子生物学的实验技术1. DNA测序技术DNA测序技术是分子生物学研究的重要手段，它可以揭示DNA序列的信息，从而对基因组进行分析和研究。
本节将介绍传统的Sanger测序技术和新一代测序技术的原理和应用。
2. PCR技术PCR技术是一种重要的DNA扩增技术，它可以在体外快速扩增特定DNA片段，为分子生物学研究提供了强有力的工具。
本节将介绍PCR技术的原理、反应体系和应用领域。
3. 基因克隆技术基因克隆技术是分子生物学研究中常用的技术，它可以将特定基因片段插入到载体中，并在宿主细胞中进行复制和表达。
本节将介绍基因克隆技术的原理、方法和应用。
4. 蛋白质分离与鉴定技术蛋白质分离与鉴定技术是研究蛋白质结构和功能的重要手段，包括SDS-PAGE、Western blotting和质谱分析等。
本节将介绍这些技术的原理、方法和应用。
三、分子生物学的应用领域1. 基因组学基因组学是研究生物体基因组的结构和功能的学科，它包括基因组测序、基因注释和基因组比较等内容。
分子生物学的研究方法
分子生物学的研究方法1. 基因克隆啊，这就好比是复制粘贴一样神奇！比如说我们要研究一个很重要的基因，那我们就可以通过基因克隆这个方法把它复制出来，然后好好研究它。
就像找到一把神奇的钥匙，打开我们了解生命奥秘的大门啊！2. 聚合酶链式反应，哇，这可是个厉害的家伙！你想想看，就像快速变魔术一样，能把少量的 DNA 迅速扩增好多倍。
比如要检测一个很微小的病原体，聚合酶链式反应就能大显身手啦！3. 核酸杂交，嘿，这不就像是在茫茫人海中寻找那个特别的人嘛！通过它可以找到特定的核酸序列哦。
比如说在基因诊断中，核酸杂交就能精准地找到出问题的地方，是不是超厉害呀！4. 基因测序就像在解读生命的密码本！我们可以知道基因的具体序列啦。
像破解一个神秘的代码一样，让我们对生命的了解深入到每一个碱基。
比如研究遗传病，基因测序就能告诉我们到底是哪里出了问题呀！5. 蛋白质印迹，这就像照妖镜一样，能让特定的蛋白质现形！当我们想知道某种蛋白质有没有表达或者表达量多少的时候，它就派上大用场了。
哎呀，简直太妙了！6. 细胞培养，哇塞，这就如同给细胞安个家呀！我们可以让细胞在特定的环境中生长繁殖。
比如想研究某种药物对细胞的影响，细胞培养不就正好嘛，多有趣呀！7. 基因编辑，这可是能直接修改生命蓝图的神技啊！就像我们拿着笔可以随心所欲地修改一样。
像要治疗一些基因导致的疾病，基因编辑没准就是未来的希望呢！8. 免疫印迹，嗯，这有点像侦探在找线索呢！通过它可以检测特定的蛋白质和抗体。
比如说研究自身免疫性疾病，免疫印迹就能帮忙找出那些捣乱的家伙呀！9. 实时荧光定量 PCR，嘿，这绝对是个精确的计量器呀！能实时检测DNA 的变化呢。
在监测基因表达的动态过程中，它可太有用啦，厉害不厉害！我觉得分子生物学的这些研究方法真的超级神奇，它们让我们对生命的探索不断深入，有着无比广阔的前景和重要性啊！。
现代分子生物学-第九章 分子生物学基本研究法(下)-基因功能研究技术
转录组测序分析和RNA-Seq
转录组(transcriptome)，广义上指在某一特定生理 条件或环境下，一个细胞、组织或者生物体中所 有RNA的总和，包括信使RNA (mRNA)、核糖体 RNA (rRNA)、转运RNA (tRNA)及非编码 RNA(non-coding RNA或sRNA); 狭义上特指细胞中转录出来的所有mRNA的总和。
转录因子与顺式作用元件结合，激活最基本启动子Pmin， 使报告基因表达。若接入3个以上顺式作用元件，可增强 转录因子的识别和结合效率。
结构域
二者融合 导入酵母 细胞
上游
启动子 下游
酵母单杂交体系主要用于：
确定某个DNA分子与某个蛋白质之间是否存在相互作用；
分离编码结合于特定顺式调控元件或其他DNA位点的功
胚胎干细胞（ES细胞）分离和体外培养的成功奠定 了哺乳动物基因敲除的技术基础。
6. 2. 3 植物基因敲除技术
T-DNA插入失活技术是目前在植物中使用最为广 泛的基因敲除手段。
利用根癌农杆菌T-DNA介导转化，将带有报告基 因的DNA序列整合到基因组DNA上，如果这段 DNA插入到目的基因内部或附近，就会影响该基 因的表达，从而使该基因“失活”。
关于基因敲除技术，噬菌体的Cre/Loxp系统、 Gin/Gix系统、酵母细胞的FLP/FRT系统和 R/RS系统是现阶段常用的四种定位重组系统， 尤以Cre/Loxp系统应用最为广泛。
1、完全基因敲除：
Neo基因有双重作用：①形成靶位点的插入突变；②作为
正向筛选标记。
取代型
插入型
由于基因转移的同源重组自然发生率极低， 动物的 重组概率约为10-2～10-5，植物的概率为10-4～10-5， 即使采用双向选择法也很难保证一次就从众多细胞 中筛选出真正发生 了同源重组的胚胎干细胞。
分子生物学-研究方法(上)PPT课件精选全文完整版
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1个PCR循环产生2条双链分子
一般每完成一个循环需2-4分钟，2-3小时就能 将待扩增目的基因扩增放大几百万倍。
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33
PCR的基本原理
模板DNA
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34
PCR的基本原理
• PCR反应条件 • PCR过程 • PCR的特点
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5
基因工程技术区别于其它技术的根本特征：具 有跨越天然物种屏障、把来自任何生物的基因 置于毫无亲缘关系的新的寄主生物细胞之中的 能力。
1962年Arber 发现限制性核酸内切酶， 1967年Gellert发现了 DNA 连接酶。
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6
酶类
重组DNA实验中常见的主要工具酶
功能
限制性核酸内切酶 DNA连接酶
末端转移酶
在双链核酸的3ˊ末端加上多聚单核苷酸
DNA外切酶III
从DNA链的3ˊ末端逐个切除单核苷酸
λ噬菌体DNA外切酶
从DNA链的5ˊ末端逐个切除单核苷酸
碱性磷酸酯酶
切除位于DNA链5ˊ或3ˊ末端的磷酸基团
科学家已几乎能随心所欲地把任何DNA分子切割成一系列不连续的片段， 再利用凝胶电泳技术将这些片段按照分. 子量大小逐一分开，以供下一步研7究。
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42
（3）PCR的应用
• 反向PCR：扩增已知序列旁侧的未知DNA序列
• 锚定PCR: 用于测定基因结构
• 不对称PCR: 用于扩增某一单链模板
• RT-PCR(逆转录-PCR): 逆转录联合PCR以扩增cDNA
• 复合PCR: 用多对引物同时扩增几条DNA片段
• 易错PCR：引入错配碱基，导致随机突变
分子生物学实验方法
分子生物学实验方法
分子生物学实验方法是研究生物分子结构、功能和相互作用的技术手段。
以下是常用的分子生物学实验方法：
1. PCR（聚合酶链式反应）：PCR是一种通过体外DNA扩增技术来复制DNA 片段的方法，可以快速、高效地扩增特定DNA序列。
2. 基因克隆：通过将目标DNA片段插入到载体DNA中，形成重组DNA分子，再将重组DNA导入到宿主细胞中，从而得到大量目标DNA的方法。
3. 电泳：电泳是一种利用电场将DNA、RNA或蛋白质分子按照大小和电荷进行分离的方法。
常用的电泳包括琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳。
4. 蛋白质表达与纯化：通过在宿主细胞中表达目标蛋白质的基因，然后利用蛋白质的特异性结构、功能或抗体亲和纯化技术，从宿主细胞中纯化目标蛋白质。
5. 免疫沉淀：利用抗体与特定蛋白质结合来纯化对应的蛋白质复合物的方法。
6. 荧光显微镜：利用荧光探针标记目标生物分子，通过荧光显微镜观察和分析分子在细胞或组织中的位置和数量。
7. Northern blot和Western blot：用于检测和分析RNA和蛋白质的方法。
Northern blot可以检测特定的RNA序列，Western blot可以检测特定蛋白质。
8. 基因敲除和基因转染：通过基因敲除技术可以去除或禁止特定基因的表达，而基因转染技术可以将外源基因导入细胞中，从而改变细胞的表型。
9. 蛋白质相互作用分析：利用蛋白质相互作用分析技术，如酵母双杂交、质谱分析等，研究蛋白质之间的相互作用关系。
这些方法是分子生物学研究中常用的实验技术，可以用于从分子水平解析生物学问题，探索生物的结构和功能。
分子生物学研究方法
分子生物学研究方法
分子生物学研究方法是研究生物分子结构、功能和相互作用的一系列实验方法和技术。
这些方法帮助科学家了解细胞的基本结构和功能，研究生物分子在疾病发展、遗传变异和进化中的作用。
以下是一些常用的分子生物学研究方法：
1. DNA提取：从细胞或组织中提取DNA，以用于后续实验。
2. 聚合酶链式反应（PCR）：用于扩增DNA片段，以便进行分析和检测。
3. 凝胶电泳：用电场将DNA、RNA或蛋白质分离成不同大小的片段，以便研究其结构和功能。
4. 蛋白质纯化：通过一系列步骤将目标蛋白质从混合物中纯化出来，以获得足够的纯度用于研究。
5. 克隆：将DNA序列插入到载体中，以产生大量目标DNA 分子，用于进一步的分析和实验。
6. 基因测序：确定DNA序列的顺序，以研究基因功能、分析遗传变异或进行进化研究。
7. 基因表达：将目标基因转录成mRNA，并翻译成蛋白质，以研究基因功能和调控机制。
8. 蛋白质相互作用：使用技术如亲和层析、酵母双杂交等研究蛋白质之间的相互作用关系，以探索细胞信号传导和代谢途径。
9. 基因编辑：利用技术如CRISPR/Cas9，对细胞或生物体的基因进行精确的编辑，以研究基因功能或治疗遗传疾病。
分子生物学研究方法的不断发展和创新使得科学家可以更深入地了解生物分子的结构、功能和相互作用，为疾病治疗和生物技术的发展提供了基础。
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核酸的分子杂交
核酸的凝胶电泳 核酸的分子杂交 细菌转化 核苷酸序列分析 基因扩增 DNA与蛋白质相互作用研究
将带有互补的特定核苷酸序列的单链DNA或 RNA混合在一起，其相应的同源区段就会退火 形成双链结构。
如果退火的核酸来自不同的生物有机体，所形 成的双链分子就被称为杂种核酸分子。
Southern Blotting
基因操作
重组DNA技术史上的主要事件
重组DNA实验中常见的主要工具酶
• 限制性核酸内切酶 • DNA连接酶
• DNA聚合酶I(大肠杆菌)
• 反转录酶 • 多核苷酸激酶
• 末端转移酶
• DNA外切酶Ⅲ • λ噬菌体DNA外切酶 • 碱性磷酸酯酶
识别并在特定位点切开DNA 通过磷酸二酯键把两个或多个DNA片段连 接成一个DNA分子 按5'到3'方向加入新的按苷酸，补平DNA 双链中的缺口 按照RNA分子中的碱基序列，根据碱基互 补原则合成DNA链 把磷酸基团加到多聚核苷酸链的5'—OH 末端(进行末端标记实验或用来进行DNA 的连接) 在双链核酸的3'末端加上多聚单核苷酸 从DNA链的3'末端逐个切除单核苷酸 从DNA链的5'末端逐个切除单核苷酸 切除位于DNA链5'或3'末端的磷酸基团
细菌转化
核酸的凝胶电泳 核酸的分子杂交 细菌转化 核苷酸序列分析 基因扩增 DNA与蛋白质相互作用研究
一种细菌菌株由于捕 获了来自另一种细菌 菌株的DNA而导致性 状特征发生遗传改变 的生命过程
提供转化DNA的菌株叫 作供体菌株 接受转化DNA的细菌菌 株则被称为受体菌株
核苷酸序列分析
分子生物学研究法
分子生物学
基因操作
DNA分子的切割与连接 是分子生物学研究的核心技术 核酸分子杂交 凝胶电泳 细胞转化 核酸序列分析以及基因的人工合成 定点突变和PCR扩增等
基因工程
是指在体外将核酸分子插入病毒、质粒或其他载体分子中， 构成遗传物质的新组合，使之进入原先没有这类分子的寄主 细胞内并进行持续稳定的繁殖和表达。
鸟枪法(shot—gun approach) 局部双酶消化法
重组体DNA分子的构建
外源DNA片段定向插 入载体分子
重组体分子导入受体细胞的途径
将外源重组体分子导入受体细胞的主要 途径包括:
转化(或转染) 转导 显微注射 电穿孔等。
cDNA基因克隆
高等生物一般具有3~5万种左右不同的基 因 在一定时间阶段的单个细胞或组织中， 仅有15％左右的基因得以表达
DNA与蛋白质 相互作用研究
核酸的凝胶电泳 核酸的分子杂交 细菌转化 核苷酸序列分析 基因扩增 DNA与蛋白质相互作用研究
凝胶阻滞试验 DNase I足迹试验 基因芯片技术
基因芯片半位点法
基因工程—载体
基因克隆的主要载体系统
质粒DNA分离纯化 载体系统
●常用Vectors pUC18 DNA pUC19 DNA pUC118 DNA pUC119 DNA pUC118 EcoR I / BAP pUC118 BamH I / BAP pUC118 Hinc II / BAP pUC118 Pst I / BAP pUC118 Hind III / BAP pBR322 DNA ● SiRNA表达用载体 pSINsi Vector Series pSINsi Primer Set pBAsi Vector Series ● PCR产物克隆用载体 pMD18-T Vector pMD19-T Vector pMD18-T Simple Vector pMD19-T Simple Vector pSIMPLE-18 EcoR V/BAP Vector pSIMPLE19 EcoR V/BAP Vector ● Sequencing Primers M13 Primers BcaBESTTM Sequencing Primers λgt10/11 Primers SP6 Promoter Primer ● Oligo dT Primers Oligo d(T)15 Oligo d(T)18 ● Random Primers Hexadeoxyribonucleotide mixture; pd (N)6 Nonadeoxyribonucleotide mixture; pd (N)9 ● Linkers Phosphorylated Linkers Nonphosphorylated Linkers ● Adaptors Adaptors EcoR I - Not I - BamH I Adaptor
电泳的迁移率影响因素
核酸的凝胶电泳
核酸的凝胶电泳 核酸的分子杂交 细菌转化 核苷酸序列分析 基因扩增 DNA与蛋白质相互作用研究
核酸主要电泳方法
琼脂糖凝胶电泳
分辨率 分辨范围0.2~50kb 分辨率 分辨范围1~1000bp 分辨率 分辨范围107bp
聚丙烯酰胺凝胶
脉冲电场凝胶电泳
DNA连接酶
化学合成的具有Eco R I 粘性末端的DNA片段
DNA的平末端 DNA的粘性末端
重组DNA 操作过程
外源DNA导入的实验证明
(1)像pSCl01这样的质粒DNA分子可以作为基因克 隆的载体，从而把外源DNA导人寄主细胞； (2)像非洲爪蟾这样的高等生物的基因也可以被成 功地转移到原核细胞中并实现其功能表达； (3)质粒DNA—大肠杆菌细胞作为一种成功的基因 克隆体系，有可能在重组DNA或基因工程研究 中发挥重要作用。
应用mRNA差别 显示技术分离
应用cDNA差示分析
法(representational
difference analysis，
RDA)
应用酵母双杂交体系(two—hybrid system)
基因的图 位克隆法 map-based cloning
用DNA微列阵技术
主要DNA操作技术
核酸的凝胶电泳 核酸的分子杂交 细菌转化 核苷酸序列分析 基因扩增 DNA与蛋白质相互作用研究
核酸的凝胶电泳
核酸的凝胶电泳 核酸的分子杂交 细菌转化 核苷酸序列分析 基因扩增 DNA与蛋白质相互作用研究
原理
一种分子被放置到电场中，它就会以一定的速度移 向适当的电极。 这种电泳分子在电场作用下的迁移速度—电泳的迁 移率。 净电荷 分子大小 分子构型
氯化铯密度梯度离心法
基因的分离与鉴定
基因克隆
四个基本步骤：
(1)用于基因克隆的DNA材料的选择以及DNA分子 的片段化；
(2)外源DNA片段与载体分子的体外连接反应；
(3)将人工重组的DNA分子导人它们能够进行正常 复制的寄主细胞； (4)重组体分子的转化子克隆的选择或筛选。
DNA片段的产生与分离
核酸的凝胶电泳 核酸的分子杂交 细菌转化 核苷酸序列分析 基因扩增 DNA与蛋白质相互作用研究
核酸的分子杂交
核酸的凝胶电泳 核酸的分子杂交 细菌转化 核苷酸序列分析 基因扩增 DNA与蛋白质相互作用研究
基因芯片
核酸的凝胶电泳 核酸的分子杂交 细菌转化 核苷酸序列分析 基因扩增 DNA与蛋白质相互作用研究
核酸的凝胶电泳 核酸的分子杂交 细菌转化 核苷酸序列分析 基因扩增 DNA与蛋白质相互作用研究
Sanger双脱氧链终止法 Maxam—Gilbert化学修饰法 DNA序列分析的自动化 DNA杂交测序法(SBH)
Sanger双脱氧链终止法
DNA序列分析的自动化
DNA杂交测序法(SBH)
DNA杂交测序法(SBH)
核酸的凝胶电泳 核酸的分子杂交 细菌转化 核苷酸序列分析 基因扩增 DNA与蛋白质相互作用研究
EB 溴乙锭检测核酸原理
核酸的凝胶电泳 核酸的分子杂交 细菌转化 核苷酸序列分析 基因扩增 DNA与蛋白质相互作用研究ຫໍສະໝຸດ DNA脉冲电场凝胶 电泳示意图
核酸的凝胶电泳 核酸的分子杂交 细菌转化 核苷酸序列分析 基因扩增 DNA与蛋白质相互作用研究
?分离到目的基因片段? ?如何实现高质量mRNA的制备 ?
克隆基因的分离
应用核酸探针分离
应用mRNA差别显示技术分离 应用cDNA差示分析法(representational difference
analysis，RDA)
应用酵母双杂交体系(two—hybrid system) 基因的图位克隆法(map—basedcloning) 用DNA微列阵技术(DNA microarray)
基因扩增
核酸的凝胶电泳 核酸的分子杂交 细菌转化 核苷酸序列分析 基因扩增 DNA与蛋白质相互作用研究
PCR >>flash 反向PCR
反向PCR
(a)用一种在靶序列上没有切 点的限制性核酸内切酶消化大 相对分子质量DNA (b)产生大小不同的线性DNA 片段群体，其中靶DNA区段的 DNA分子长度不超过2-3kb， 经连接后重新环化； (c)按靶序列设计的一对引物 与互补序列退火结合，其延伸 方向如箭头所指； (d)经PCB扩增产生的主要是线 性双链DNA分子，它是由左侧 序列和右侧序列首尾连接而成， 其接点是(a)中所用的限制性 内切酶的识别位点