荧光光度法测定二氯荧光素

荧光光度法测定二氯荧光素
一、实验目的
1.了解荧光光度法的基本原理。

2.掌握荧光物质的标准曲线法定量测量含量的操作方法和原理。

3.掌握wgy-10荧光分光光度计使用方法，熟悉测量软件的数据处理。

二、方法原理
分子在紫外和可见光的照射下，可吸收辐射形成激发态分子。

分子外层的电子在10-8s内返回基态。

在返回基态的过程中，部分能量通过热能形式释放，另一部分能量则以辐射光的形式释放。

这种分子在光照射下，分子外层电子从第一激发态的最低振动能级跃迁至基态各振动能级时，发射出来的光称为分子荧光，因此荧光是一种光致发光现象。

荧光光谱包括激发谱和发射谱。

激发谱和吸收谱极为相似，呈镜象对称关系。

激发谱是荧光物质在不同波长的激发光作用下测得的某一波长处的荧光强度的变化情况，也就是不同波长的激发光的相对效率；
发射谱则是某一固定波长的激发光作用下荧光强度在不同波长处的分布情况，也就是荧光中不同波长的光成分的相对强度。

发射谱中最大荧光强度的位置称为 max，是荧光光谱的一个重要参数。

分子发射的荧光强度与浓度的关系遵循比尔定律：I=2.3kbcI0。

在一定条件及一定浓度范围内，荧光强度与物质浓度成线性关系。

一般来说，溶液的荧光强度随温度的降低而增强。

如荧光物质为弱酸或弱碱，则溶液pH值的改变常对荧光强度有较大影响。

荧光强度一般随介质粘度的升高而增强。

因为介质粘度增加，减少了分子碰撞，从而减少了能量损失。

三、仪器和试剂
仪器：wgy-10荧光分光光度计（天津港东科技发展股份有限公司）
试剂二氯荧光素（0~5 μg·mL-1）标准储备液：称取0.0100 g二氯荧光素（A.R.）加入1 mol·L-1 NaOH 5 mL，再加3 mL 1 mol·L-1 HCl溶解后，转移至100 mL容量中，用二次蒸馏水稀释至刻度、摇匀，备用；取0.50 mL上述溶液，转移至100 mL容量瓶中稀释至刻度，配成0.50 μg·mL-1标准储备液供配制标准系列用。

四、实验步骤
1. 配制标准溶液系列
标准系列溶液配制：分别吸取0.50μg·mL-1二氯荧光素标准储备液0.0 mL、2.0 mL、4.0 mL、6.0 mL、8.0 mL、10.0 mL放入6个100 mL容量瓶中，用去离子水稀释至刻度，摇匀，备用。

2. 开启电源，打开荧光光度计和计算机，预热5分钟
(1) 开启稳压电源。

开灯(有氙灯和钨灯)，如用氙灯，就将开关扳到氙灯位置，按氙灯按钮。

(2) 开启荧光分光光度计电源（按钮在仪器前面）。

(3) 开启计算机系统电源。

3. 进行仪器初始化
双击桌面上的“WGY－10 型荧光分光光度计”图标或从“WGY－10
激发滤光片初始化、发射光栅初始化、发射狭缝初始化及发射滤光片初始化。

初始化结束（~5 min），仪器进入工作状态。

4. 激发、发射与及同步荧光光谱的测定（本实验最大激发波长498 nm，最大发射波长520 nm）
(1) 扫描激发谱（参数设置见图1. 左下方的方式设置项：工作模式；扫描设置）
A.选择工作模式扫描设置：起始波长（400），终止波长（550）狭缝宽度（8，若浓度较大，光谱溢出，可调小些）负高压（100，不宜经常改动。

对于未知物质，可以选择较宽的起始波长和终止波长范围，如400-800 nm，或200-800 nm）
Fig 1. 激发光谱扫描的操作界面
B.520nm。

对于未知物，按照发射波长大于激发波长
……”(需时~2 min)。

（注意：测定激发光谱时，应选该物质的最大发射波长；测定发射光谱时，则用最大激发波长。

）
C. 放样品
D.弹出对话框，输入通道号(1-10) ——>
“正在检索激发波长……”，扫描并绘制激发光谱。

E. 保存光谱（弹出对话框，输入保存数据所用的通道）。

注意：保存时可选同时存为txt 文件，便于供其他作图软件使用。

如不保存，或选择覆盖已选用的通道，则前面的扫描图和数据将丢失。

(2) 扫描发射谱（参数设置见图2.）
A.扫描设置：起始波长(450), 终止波长(630)(若将发射谱与激
发谱叠加在同一张图上，可选择400-630nm，波长范围涵盖发射和激发谱)，狭缝宽度（8）负高压（100）。

对于未知物，可由激发谱（1）来确定起始波长和终止波长。

Fig 2. 发射光谱扫描的操作界面
B.(498 nm)
“正在检索激发波长，请稍等”(需时~2 min)。

C.(1-10) （宜改变寄存器号，如选择与前
面相同的通道号，则会抹去激发光谱，数据丢失）——>
检索发射波长….”，扫描并绘制发射光谱。

D. 保存数据：扫描完后保存数据。

(3) 扫描同步荧光谱
恒波长同步荧光法系在扫描过程中使激发波长和发射波长彼此间保持固定的波长间隔(Δλ= λem－λex = 常数) ,即通常所说的同步荧光法。

在恒波长同步荧光法中,Δλ的选择十分重要，这将直接影响到同步荧光光谱的形状、带宽和信号强度。

恒波长同步荧光法参数设置见图3.
A. 工作模式
B.
起始波长与终止波长设置：在激发谱与发射谱重叠的区域选择，如图3B 所示 480-550nm 。

若激发谱、发射谱、同步扫描谱同时呈现在一张图上，波长选择需涵盖前两个谱：400-630 nm 。

A 4004404805205606006400
10
20
30
40
506070
F Wavelength (nm)Ex Em 5nm 10nm B
400440480520560
60064001020304050
60
70F Wavelength (nm)
5nm 10nm
C
Fig 3. 同步荧光光谱扫描的操作界面(A)、波长范围选择(B)、同步应光谱
(C) C. , 弹出对话框，输入通道号(1-10)波长差Δλ，如5、10 nm “正在检索….”，扫描并绘制同步扫描光谱。

（可分别试验Δλ=5、10、15、20、25、30 nm 所得到的同步扫描光谱。

从而选择最佳Δλ值）。

5. 标准溶液和试样的定量测定。

（参数设置见图4.）
方法一：以最大发射波长处的荧光强度进行定量分析（激发波长498 nm，波长范围450-630 nm），测定一系列不同浓度标准液的发射光谱。

方法二：利用仪器本身具有的线性测定功能，选择最大激发波长(498 nm)和最大发射波长(520 nm) 测定试样的荧光强度来求得其浓度。

（1）点击菜单栏\工作\定量测量：
Fig 4. 试样的荧光光谱测定的操作界面，编辑激发与测定波长
（2输入标准样品的浓度（由低到高，本底用空白溶液，此时c=0）
，直至将所有的标准系列溶液的浓度都输入完毕（见图5）；
Fig 5. 试样的荧光光谱测定的操作界面，输入标准溶液的浓度
（3
（4
（5）按提示放入样品，测定荧光强度。

若有多个样品，可按提示依次测定完毕。

记录数据或打印。

（见图6）
Fig 5. 试样的荧光光谱测定的操作界面，标准曲线及待测样品的浓度
完成所有测定后，保存数据，准备关机。

6. 关机。

先退出荧光测定程序(即关掉工作站) →关灯（氙灯或钨灯）→关闭荧光分光光度计→关计算机→稳压电源（如果计算机与光谱光度计使用同一稳压电源的话）。

五、结果处理
（1）根据标准系列溶液的荧光强度及对应的浓度绘制I-c标准曲线。

（2）以试样的荧光强度在标准曲线上查出相应的含量。

附：波长校正：
通过已知荧光物质的最大激发波长和最大发射波长来校正仪器的波长。

方法是：
, 输入激发波长修正值，按提示操作。

, 输入发射波长修正值，按提示操作。