透明质酸功能化三氧化二铋纳米颗粒的制备及其对肝癌细胞的放疗增敏作用

透明质酸功能化三氧化二铋纳米颗粒的制备及其对肝癌细胞的
放疗增敏作用
娄嘉明;金洁;龚爱华;杜凤移;吴朝阳
【摘要】Objective:To investigate the radiosensitization enhancements of a newly developed nanopartical modified by hyaluronic acid (HA-Bi2O3) on hepatoma cells SMMC-7721.Methods:We used HA and BiCl3 · 6H2O as precursors to synthesize HA-Bi2O3 by polyol method.HA-Bi2O3 were characterized by transmission electron microscopy (TEM/HRTEM),NanoDLS particle size analyzer and X-ray diffraction (XRD).The biocompatibility characterization of HA-Bi2O3 NPs was characterized by CCK-8
assay,histological analysis and inductively coupled plasma mass spectrometry(ICP-MS).The radiosensitization of HABi2O3was conducted by CCK-8 assay,Live-dead staining assay (FDA-PI staining) and clonogenic assay,randomly on SMMC-7721 cells,divided to four groups (control,HA-Bi2O3,radiation and HA-Bi2O3 + radiation).Results:We fabricated the HA-Bi2O3 with a diameter of 45 nm,the amorphous phase structure and these diffraction peaks of HA-Bi2O3 NPs matched well with the characteristic peaks of cubic Bi2O3 (JCPDS 2004 06-0312).Inhibition rates of cell proliferation of HA-Bi2O3 ranging with different concentrations of HA-
Bi2O3 (0-400 mg/L) were no statistically significant differences(P ＞
0.05).HA-Bi2O3was no obvious toxicity to the mouse susceptible organs (liver,heart,spleen,lung,and kidney) showed by histological assessment and pared with control,radiation group and HA-Bi2O3 group,there
were lower inhibition rates of cell proliferation and survival fraction in HA-Bi2O3 + radiation group with statistically significant differences(P ＜
0.05).Conclusion:We have successfully developed HA-Bi2O3 with favorable solubility in water,excellent biocompatibility,no obvious toxicity and effective radiosensitization enhancement on hepatoma SMMC-7721 cells.%目的:制备透明质酸(HA)功能化三氧化二铋纳米颗粒(HA-Bi2O3),观察其对肝癌细
胞SMMC-7721的放疗增敏效果.方法:利用HA、二乙二醇和六水氯化铋为前驱物,通过水热聚醇法构建HA-Bi2O3纳米颗粒;透射电子显微镜(TEM/HRTEM)、NanoDLS高敏度粒径分析仪、X射线衍射仪(XRD)揭示HA-Bi2O3的理化特
性;CCK-8法、石蜡切片苏木精-伊红(H&E)染色法和电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)技术观察HA-Bi2O3的生物相容性;将SMMC-7721细胞随机分为对照组、单纯HA-Bi2O3组、单纯照射组、HA-Bi2O3+照射组,CCK-8法、活-死细胞(FDAPI)染色法和克隆形成实验检测HA-Bi2O3对肝癌细胞SMMC-7721的放疗增敏作用.结果:成功构建HA-Bi2O3纳米颗粒;HA-Bi2O3粒径均一,约为45 nm,物相符合
Bi2O3(JCPDS 2004 06-0312)的特征;不同浓度的HA-Bi2O3(0～400 mg/L)对SMMC-7721细胞的增殖抑制率差异无统计学意义(P＞0.05);在小鼠体内代谢中主要为肝脏及肾脏所吸收;对小鼠重要脏器(心、肝、脾、肺、肾)未显示明显毒
性;HA-Bi2O3联合照射对SMMC-7721细胞的增殖抑制率明显高于对照组、单纯HA-Bi2O3组和单纯照射组(均P＜0.05).结论:成功构建HA-Bi2 03纳米颗粒,此纳米颗粒具有结构稳定、水溶性良好及毒性低等特点,对肝癌细胞SMMC-7721具有明显的放疗增敏效果.
【期刊名称】《江苏大学学报（医学版）》
【年(卷),期】2017(027)005
【总页数】7页(P397-402,407)
【关键词】三氧化二铋;放疗增敏;纳米材料;SMMC-7721细胞
【作者】娄嘉明;金洁;龚爱华;杜凤移;吴朝阳
【作者单位】江苏大学附属人民医院肿瘤科,江苏镇江212002;江苏大学附属人民医院肿瘤科,江苏镇江212002;江苏大学医学院,江苏镇江212013;江苏大学医学院,江苏镇江212013;江苏大学附属人民医院肿瘤科,江苏镇江212002
【正文语种】中文
【中图分类】R73-36;R735.7
放射治疗主要通过高能X射线对细胞自由基或DNA产生损伤从而杀伤癌组织,使其缩小甚至消失[1-4]。

然而，由于肿瘤的异质性及各种原因引起的辐射抗性(例如缺氧)，临床上不得不增加放疗剂量以提高疗效[5]。

铋是元素周期表中稳定的重金属元素，位于金属和非金属交界处，具有特殊的理化性质以及无毒性、不致癌等特点，被称为绿色金属[6-7]，在自然界中主要以碳酸盐、硫化物及氧化物等形式存在。

以铋为基础的纳米材料如Bi2S3[7-8]和Bi2Se3[9]已经被证实是一种性能优良的CT对比剂。

同时，相比于传统放疗增敏剂金基和银基纳米材料，Bi2S3等铋基纳米材料具有更加低廉的成本及更为显著的放疗增敏作用[10-13]，但是三氧化二铋(Bi2O3)还未被证实也拥有类似的放疗增敏效果。

本研究通过水热聚醇法[14]，将六水氯化铋(BiCl3·6H2O)作为铋元素来源合成Bi2O3，并通过透明质酸(HA)进行修饰，构建HA-Bi2O3纳米颗粒，观察其对肝癌细胞SMMC-7721的放疗增敏作用。

1.1 主要试剂与仪器
人肝癌SMMC-7721细胞株、平滑肌VSMC细胞株和乳腺癌MCF-7细胞株(上海
肿瘤研究所)；ICR小鼠(雌性、6周龄、25 g，江苏大学动物中心)；HA(99%)，BiCl3·6H2O(99.99%)和二乙二醇(DEG，99%)为Aladdin公司产品；胎牛血清、胰蛋白酶、磷酸缓冲盐溶液和达尔伯克(氏)改良伊格尔(氏)培养基(Gibco公司), CCK-8试剂盒(Vazyme公司)，二甲基亚砜(DMSO)、荧光素二乙酸酯(FDA)和碘
化丙啶为Sigma公司产品；酶联免疫检测仪、透射电子显微镜(TEM)为Thermo
公司产品；NanoDLS高敏度粒径分析仪(布鲁克海文仪器公司)；电感耦合等离子
体质谱(ICP-MS)仪(Thermo公司)；医用电子直线加速器(Siemens公司)。

1.2 HA-Bi2O3的制备
首先，将5.7 mmol的BiCl3溶于30 mL的DEG中，室温下搅拌至透明均匀，然后将溶液转移至油浴锅中140～160 ℃搅拌1 h，再加入NaOH(7.5 mmol NaOH溶于30 mL DEG)，在油浴锅中密闭条件下180 ℃下剧烈搅拌30 min，室温下静置过夜，将0.5 mmol的HA及0.5 mmol的NaOH于30 mL DEG中搅
拌均匀后加入其中，并于室温下剧烈搅拌6 h后形成白色均液，冷却至室温后过滤、透析、冻干，获得HA-Bi2O3粉末。

应用TEM表征量子点超微结构和粒径形貌,
应用NanoDLS高敏度粒径分析仪分析材料的粒径，应用X射线衍射仪(XRD)表征其物像结构。

1.3 细胞培养
人肝癌细胞SMMC-7721培养于含10%胎牛血清培养液中，于37 ℃、5% CO2
饱和度培养箱中孵育，细胞为单层贴壁生长，待铺满培养皿底部80%～90%时用
胰蛋白酶消化传代。

所有操作均为无菌操作，于细胞培养用超净台中进行。

取对数生长期的细胞进行实验。

1.4 细胞辐照
采用医用电子直线加速器，辐照剂量：6 MV X线照射、剂量率：200 cGy/min、源皮距：100 cm、照射野：10 cm×10 cm。

根据实验设计予以不同的辐照剂量,
照射后的细胞置于培养箱(37 ℃、5% CO2饱和度)中继续孵育。

1.5 ICP-MS技术观察HA-Bi2O3在小鼠重要脏器中的分布
取3只ICR小鼠，通过尾静脉注射 HA-Bi2O3(10 mg/kg)[15]，共给药4次，每次间隔12 h，相同条件下继续养殖，48 h后处死，取小鼠重要脏器(心、肝、脾、肺、肾)，用组织碾磨器碾磨成液体，各脏器分别取单位质量(0.1 g)用PBS定容至100 mL，用ICP-MS仪测定铋元素在各脏器中的分布。

1.6 HE染色观察HA-Bi2O3对小鼠的毒性
取6只ICR小鼠，分为对照组和实验组。

HA-Bi2O3溶解于PBS(200 mg/L)中，实验组通过尾静脉注射 HA-Bi2O3(10 mg/kg)，共给药4次，每次间隔12 h。

对照组予以等体积的单纯PBS经尾静脉注射，同等条件下饲养2周后同期处死，取
小鼠重要脏器(心、肝、脾、肺、肾)，4%低聚甲醛固定，置于4℃冰箱过夜，乙醇浓度梯度脱水、包埋、切片、脱蜡、苏木精-伊红染色、封片后显微镜拍照分析。

1.7 CCK-8法测定HA-Bi2O3对细胞增殖的影响
取对数生长期SMMC-7721、VSMC和MCF-7细胞，以3 000个/孔接种于96
孔细胞培养板中,每孔加入100 μL培养液，置于37℃、5% CO2饱和湿度培养箱
中培养24 h后，根据实验要求设空白对照组、实验对照组、单纯HA-Bi2O3组。

空白对照组只给予同等体积的培养基，实验对照组只培养相同数量的SMMC-7721、VSMC和MCF-7细胞，单纯HA-Bi2O3组培养相同数量的SMMC-7721、VSMC和MCF-7细胞，同时加入不同浓度(0，12.5，25，50，100，200，400 mg/L)的HA-Bi2O3。

完成处理后继续置于37℃、5% CO2饱和湿度的培养箱中
培养24 h，每孔加入10 μL CCK-8试剂,继续避光孵育4 h后,终止培养,在酶标仪490 nm波长处测定各孔光密度(D)值。

每个浓度设6个平行复孔，实验重复3次。

细胞增殖抑制率=[1-(实验组D值-空白对照组D值)/(实验对照组D值-空白对照
组D值)]×100%
1.8 CCK-8法测定HA-Bi2O3联合照射对细胞增殖的影响
取对数生长期SMMC-7721细胞以3 000个/孔接种于96孔细胞培养板中,每孔加入100 μL培养液，置于37 ℃、5% CO2饱和湿度培养箱中培养24 h后,设空白
对照组、实验对照组、单纯照射组和HA-Bi2O3+照射组。

空白对照组只给予同等体积的培养基，实验对照组只培养相同数量的SMMC-7721细胞，单纯照射组培
养相同数量的SMMC-7721细胞，同时给予不同剂量(0、3、6、9 Gy)的照射，HA-Bi2O3+照射组培养相同数量的SMMC-7721细胞，加入不同浓度(0，25，50，100，200，400 mg/L)的HA-Bi2O3，同时给予不同剂量(0、3、6、9 Gy)
的照射。

完成处理后继续置于37℃、5% CO2饱和湿度的培养箱中培养24 h,每
孔加入10 μL CCK-8试剂,继续避光孵育4 h后,终止培养,在酶标仪490 nm波长
处测定各孔光密度 (D)值。

每个浓度设6个平行复孔，实验重复3次。

1.9 活-死细胞染色观察HA-Bi2O3对细胞凋亡的影响
根据CCK-8法所测定细胞增殖抑制率结果，选用不同浓度梯度(100、200、400 mg/L)的HA-Bi2O3联合6 Gy辐照进行活-死细胞染色。

取对数生长期SMMC-7721，细胞计数活细胞比例需>90%，以4.0×104个/孔接种于6孔细胞培养板中，置于培养箱(37 ℃、5% CO2饱和度)中培养，设对照组、单纯HA-Bi2O3组、单纯照射组和HA-Bi2O3+照射组。

对照组仅种植细胞，不做任何特殊处理。

当细胞铺满6孔板底部80%时，单纯HA-Bi2O3组换用含HA-Bi2O3(400 mg/L)的培养液；单纯照射组仅予以6 Gy照射；HA-Bi2O3+照射组换用含不同浓度梯度(100、200、400 mg/L)的HA-Bi2O3培养液，培养4 h后给予6 Gy剂量照射；所有处理完成后4组继续孵育24 h后，加入FDA和碘化丙啶工作液后于荧光显
微镜下观察存活细胞(绿色)与凋亡细胞(红色)的分布。

1.10 克隆形成实验观察HA-Bi2O3对细胞增殖的影响
根据CCK-8法所测定细胞增殖抑制率结果，选用浓度为200 mg/L的HA-Bi2O3
联合6 Gy照射进行实验。

将处于对数生长期的SMMC-7721细胞，进行台盼蓝染色活细胞计数(活细胞比例需>90%)以1 000个/孔接种于6孔细胞培养板中，37 ℃、5% CO2饱和度的培养箱中培养24 h。

设立对照组、单纯照射组、单纯HA-Bi2O3组、HA-Bi2O3+照射组。

对照组不做任何特殊处理；单纯HA-Bi2O3组换用含HA-Bi2O3(200 mg/L)的培养液；单纯照射组仅予以6 Gy照射；HA-Bi2O3+照射组换用含HA-Bi2O3(200 mg/L)的培养液，培养4 h后给予6 Gy剂量照射；所有处理完成后4组继续置于37 ℃、 5% CO2饱和湿度的培养箱中培养14 d，定期观察，适时换液；当发现6孔板中出现肉眼可见的细胞克隆时，则4组同期终止培养，弃培养液后用4%低聚甲醛4 ℃冰箱中固定15 min，PBS贴壁清洗至少3次，洗净低聚甲醛，注意保持细胞克隆完整性，0.1%结晶紫染色30 min，PBS贴壁清洗至清澈透明，显微镜下计数(≥50个细胞的克隆数)。

克隆接种率=(克隆形成平均数/接种细胞数)×100%；存活分数=实验组克隆数/(接种细胞数×克隆接种率)。

1.11 统计学分析
应用SPSS 18.0软件进行数据分析，每组实验均重复3次，实验数据用均数±标准差表示，采用单因素方差分析进行多组比较，进一步两两比较采用SNK-q 检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2.1 HA-Bi2O3的理化特性表征
成功构建 HA-Bi2O3纳米颗粒。

TEM观察(图1)显示，HA-Bi2O3水溶性好，大小均匀，形态规则，为圆形，部分颗粒间存在粘连。

NanoDLS高敏度粒径分析仪分析结果(图2)显示，HA-Bi2O3粒径均一，为(45±0.6) nm。

X射线衍射图谱(图3)提示，HA-Bi2O3分别在3.60°、2.73°、1.93°和1.65°等处有多处衍射峰，表明其内部晶体结构较差，符合Bi2O3(JCPDS 2004 06-0312)的特征，物相结构无定形。

2.2 HA-Bi2O3对3种细胞株增殖的影响
如图4所示，在不同浓度(0、12.5、25、50、100、200、400 mg/L)HA-Bi2O3作用下，3种细胞株增殖与HA-Bi2O3浓度不呈线性关系，但抑制率均<10%，各浓度间差异无统计学意义(P>0.05)。

表明HA-Bi2O3对SMMC-7721、VSMC和MCF-7细胞的增殖无明显影响。

2.3 HA-Bi2O3对小鼠的组织相容性
ICP-MS仪测定结果显示，HA-Bi2O3主要分布在肝脏，其次为肾脏(图5)。

为了
验证HA-Bi2O3对组织是否存在潜在的毒性影响，利用HE染色观察各器官是否
有病理变化。

结果表明，与对照组相比，实验组小鼠的重要脏器(心、肝、脾、肺、肾)未见炎症反应及结构损伤。

证明HA-Bi2O3无潜在毒性，生物相容性良好。

见图6。

2.4 HA-Bi2O3对SMMC-7721细胞的放疗增敏作用
CCK-8法检测结果表明，随着HA-Bi2O3浓度的提高或者放射剂量的增加，SMMC-7721细胞的增殖抑制率显著升高，尤其是400 mg/L的HA-Bi2O3联合
9 Gy的X射线照射对SMMC-7721细胞的增殖抑制率达到了62.3%(图7)。

活-死细胞染色结果显示，相较于对照组、单纯HA-Bi2O3组和单纯照射组，HA-Bi2O3+照射组中FDA染色(绿色)的存活细胞明显减少，并随着HA-Bi2O3浓度
的增加而减少，PI染色(红色)的凋亡细胞明显增多，并随着HA-Bi2O3浓度的增
加而增多(图8)。

克隆形成实验结果提示，单纯HA-Bi2O3组和对照组的SMMC-7721细胞克隆形成无明显差别，HA-Bi2O3+照射组的克隆形成抑制率明显高于单纯照射组
(q=3.32，P<0.05)。

见图9。

以上结果均证明HA-Bi2O3具有放疗增敏能力。

纳米技术由于其优秀的肿瘤靶向药物运输和定位功能在肿瘤的诊断和治疗领域受到广泛的关注[16-18]。

因为具有康普顿散射效应及高X射线光子捕获截面等特点，
重金属(高原子序数Z)纳米粒子(如Au, Pt, Bi, Ta, Gd, Lu等[19-20])所提供的剂量增强效应可提高细胞中DNA等敏感靶分子的放射损伤以达到放射增敏作用[5]。

铋元素是高原子序数(原子序数Z=83)，在千伏或兆伏级的光子能量照射下，可在肿瘤细胞中释放二次电子，杀伤肿瘤细胞，达到对放射治疗的放大效果[21]。

而在实体肿瘤中，病变导致相应部位的淋巴引流系统及脉管系统损伤，组织内皮间隙增大，合适大小的纳米颗粒更易进入组织并在肿瘤部位聚集，产生实体瘤高通透性和滞留效应，促进了纳米颗粒在肿瘤的诊断和相应治疗中发挥作用。

本实验制备的HA-Bi2O3纳米颗粒大小为(45±0.6)nm，具有合适的大小，所产生的滞留效应较强[22]，在肿瘤部位容易聚集；利用透明质酸包裹修饰后，HA-Bi2O3的稳定性、水溶性及生物相容性良好；不同浓度的HA-Bi2O3对SMMC-7721、VSMC和MCF-7细胞的增殖抑制率均无明显影响；经尾静脉注射HA-Bi2O3后，在体内主要被肝脏及肾脏代谢吸收，并对小鼠脏器不造成明显病理改变。

放疗是临床上用于治疗恶性肿瘤的重要手段之一，但由于肿瘤的异质性及各种原因所引起的辐射抗性，单独放疗的治愈率却不高，鉴于手术治疗对人体的严重损伤及化疗所产生的各种毒副作用，研发一种具有优秀生物相容性及显著放疗增敏效果的放疗增敏剂已经成为国际上研究的热点。

本研究显示，辐照结合HA-Bi2O3能对SMMC-7721细胞的增殖能力及克隆形成能力产生明显的抑制效果，放疗增敏作用显著，因此HA-Bi2O3有望成为优秀的放疗增敏剂，具有潜在的基础研究和临床应用前景。

【相关文献】
[ 1 ] Huang Y, Luo Y, Zheng W, et al.Rational design of cancer-targeted BSA protein nanoparticles as radiosensitizer to overcome cancer radioresistance[J]. ACS Appl Mater Interfaces，2014，6(21): 19217-19228.
[ 2 ] Lord CJ, Ashworth A. The DNA damage response and cancer therapy[J]. Nature，2012，481(7381): 287-294.
[ 3 ] Fan W, Shen B, Bu W, et al. Rattle-structured multifunctional nanotheranostics for synergetic chemo-/radiotherapy and simultaneous magnetic/luminescent dual-mode imaging[J]. J Am Chem Soc，2013，135(17): 6494-6503.
[ 4 ] Pan Y, Zhang Q,Atsaves V,et al.Suppression of Jab1/CSN5 induces radio- and chemo-sensitivity in nasopharyngeal carcinoma through changes to the DNA damage and repair pathways[J]. Oncogene，2013,32(22): 2756-2766.
[ 5 ] Xing H, Zheng X, Ren Q, et al. Computed tomography imaging-guided radiotherapy by targeting upconversion nanocubes with significant imaging and radiosensitization enhancements[J]. Sci Rep,2013,3: 1751.
[ 6 ] Ge R, Chen Z, Zhou Q. The actions of bismuth in the treatment of Helicobacter pylori infections: an update[J]. Metallomics , 2012, 4(3):239-243.
[ 7 ] Chen J, Yang XQ, Qin MY, et al. Hybrid nanoprobes of bismuth sulfide nanoparticles and CdSe/ZnS quantum dots for mouse computed tomography/fluorescence dual mode imaging[J]. J Nanobiotechnology,2015,13: 76.
[ 8 ] Chen J, Yang XQ, Meng YZ, et al. In vitro and in vivo CT imaging using bismuth sulfide modified with a highly biocompatible Pluronic F127[J]. Nanotechnology， 2014，25(29): 295103.
[ 9 ] Li Z, Hu Y, Howard KA, et al. Multifunctional bismuth selenide nanocomposites for antitumor thermo-chemotherapy and imaging[J]. ACS Nano， 2016，10(1): 984-997. [10] Rivera EJ, Tran LA, Hernández-Rivera M, et al. Bismuth@US-tubes as a potential contrast agent for X-ray imaging applications[J]. J Mater Chem B Mater Biol Med,2013，1(37):4792-4800.
[11] Yao MH, Ma M, Chen Y, et al. Multifunctional Bi2S3/PLGA nanocapsule for combined HIFU/radiation therapy[J]. Biomaterials，2014，35(28): 8197-8205.
[12] Preihs C, Arambula JF, Lynch VM, et al. Bismuth- and lead-texaphyrin complexes: towards potential α-core emitters for radiotherapy[J]. Chem Commun (Camb)，2010，46(42): 7900-7902.
[13] Grigas J, Talik E, Lazauskas V. X-ray photoelectron spectra and electronic structure of Bi2S3 crystals[J].Physica Status Solidi(b), 2002，232(2):220-230.
[14] RM Petoral Jr, Klasson A, Suska A, et al. Synthesis and characterization of Tb3+-doped Gd2O3 nanocrystals: a bifunctional material with combined fluorescent labeling and MRI contrast agent properties[J].J Phys Chem C，2009，113(17): 6913-6920 [15] Du F, Zhang L, Zhang L, et al. Engineered gadolinium-doped carbon dots for magnetic resonance imaging-guided radiotherapy of tumors[J].Biomaterials，2017，
3(121):109-120.
[16] Luo Z, Ding X,Hu Y,et al. Engineering a hollow nanocontainer platform with multifunctional molecular machines for tumor-targeted therapy in vitro and in vivo[J]. ACS Nano，2013，7(11): 10271-10284.
[17] Kakuta T, Takashima Y, Nakahata M, et al.Preorganized hydrogel: self-healing properties of supramolecular hydrogels formed by polymerization of host-guest-monomers that contain cyclodextrins and hydrophobic guest groups[J]. Adv Mater，2013，25(20): 2849-2853.
[18] Peng L, Peng X, Liu B, et al. Ultrathin two-dimensional MnO2/graphene hybrid nanostructures for high-performance, flexible planar supercapacitors[J]. Nano Lett， 2013，13(5): 2151-2157.
[19] Ma M, Huang Y, Chen H, et al. Bi2S3-embedded mesoporous silica nanoparticles for efficient drug delivery and interstitial radiotherapy sensitization[J]. Biomaterials，2015，37: 447-455.
[20] Zhang M, Ju H, Zhang L, et al. Engineering iodine-doped carbon dots as dual-modal probes for fluorescence and X-ray CT imaging[J]. Int J Nanomedicine， 2015，10: 6943-6953.
[21] Alqathami M, Blencowe A, Yeo UJ，et al.Enhancement of radiation effects by bismuth oxide nanoparticles for kilovoltage x-ray beams: A dosimetric study using a novel multi-compartment 3D radiochromic dosimeter[J]. J Phy，2013，444(1):012025.DOI:
10.1088/1742-6596/444/1/012025.
[22] Liu YJ, Zhang N. Gadolinium loaded nanoparticles in theranostic magnetic resonance imaging[J]. Biomaterials, 2012, 33(21): 5363-5375.。