Toll样受体4与脓毒症关系的研究进展

Toll样受体4与脓毒症关系的研究进展
沈婷;白建文
【摘要】Toll like receptors (TLRs) is a family of pattern recognizing receptors, which may lead to the release of inflammatory cytokines by inducing the cellular signal transduction system, and play an important role in recognizing pathogen and initiating inflammatory response. TLR4 is the major receptor recognizing gram-negative bacteria cell wall components including lipopolysaccharide, and the TLR4/CD14 signaling pathway is the most important way in inflammation reaction induced by lipopolysaccharide, which plays a key role in the pathogenesis of sepsis. The genetic polymorphism of TLR4 is associated with the individual susceptibility to sepsis, which provides important reference for the diagnosis and treatment of diseases.%Toll样受体(TLRs)是一类模式识别受体
家族,它能通过介导细胞信号转导系统导致炎症因子的释放,从而在识别病原微生物、启动炎症应答中起重要作用.其中,TLR4是识别革兰阴性菌细胞外壁脂多糖成分的
主要受体,因此在脓毒症的病理生理过程中,TLR4/CD14就成为了脂多糖诱导炎症
反应最主要的通路.此外,TLR4的基因多态性与机体对脓毒症的个体易感性密切相关,这为疾病的诊断和治疗提供了重要的理论依据.
【期刊名称】《上海交通大学学报（医学版）》
【年(卷),期】2011(031)002
【总页数】5页(P243-247)
【关键词】Toll样受体4;脓毒症;内毒素;信号转导
【作者】沈婷;白建文
【作者单位】同济大学附属东方医院危重病科,上海,200120;浙江省余姚市人民医院重症监护科,余姚,315400;同济大学附属东方医院危重病科,上海,200120
【正文语种】中文
【中图分类】R392;R631.2
Toll样受体(Toll like receptors,TLRs)是最近10余年发现的一类固有免疫受体,属于模式识别受体(pattern recognition receptors,PRR)。

它一方面可对病原体相关分子模式(pathogen associated molecular patterns,PAMPs)进行识别,介导固有免疫的跨膜信号转导,从而激活多种促炎症因子如白介素(interleukin,IL)-1β、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor, TNF)-α、IL-6、IL-8参与抗感染的炎症过程;另一方面,TLRs也通过细胞因子、趋化分子、黏附分子等促炎症因子的释放以及上调抗原提呈细胞(antigenpresenting cell,APC)表面共刺激分子(cluster of differentiation,CD)80和CD86的表达,在固有免疫和获得性免疫中起调节作用[1-2]。

1994年,Nomura等[3]发现在哺乳动物中有一种与果蝇Toll蛋白相似的蛋白,该蛋白胞膜外结构域富含亮氨酸的重复序列; 1996年,Lemaitre等[4]发现Toll除了参与调控胚胎果蝇背腹侧极性的形成外,还介导成年果蝇对微生物感染产生固有免疫反应;1997年,Medzhitov等[5]率先报道人类Toll样受体,并克隆出Toll的同源物,即如今的TLR4蛋白。

至今,哺乳动物Toll样受体家族成员至少有13个已被识别[6],人类拥有10种 Toll样受体(T1～T10)[7],它们针对不同的病原体成分诱导精细的抗感染固有免疫。

Toll样受体4(Toll like receptor 4,TLR4)是识别革兰阴性
菌细胞外壁脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)成分的主要受体。

1 TLR4
1.1 TLR4的分布与结构特点
TLR4是人类发现的第一个 TLRs相关蛋白[5],在人体内分布广泛,不仅表达于免疫相关的细胞,如单核巨噬细胞、多形核中性粒细胞(polymorphonuclear neutrophil,PMN)、树突状细胞(dendritic cell,DC)、B淋巴细胞,还大量表达于各种上皮细胞和内皮细胞,如肠道、呼吸道、泌尿生殖道上皮细胞以及血管内皮细胞等。

1997年,Medzhitov等[5]首次在人体细胞中发现TLR4并阐明其基因结构。

TLR4属于Ⅰ型跨膜受体,分子结构由胞外区、跨膜区和胞内区组成,其中胞外区富含的亮氨酸重复序列(leucine-rich repeat, LRR)结构域可与CD14分子中的LRR结合,从而介导信号传递,识别病原体成分的特异性[8]。

胞内区存在着大约有 200个氨基酸残基组成的高度保守区,与IL-1受体胞内区保守序列有高度同源性,被称为TLRs/IL-1受体同源结构域(Toll/IL-1 recep tor domains,TIR)[9]。

TIR是TLR4与其下游相关信号转导分子作用的关键部位,包括髓样分化蛋白88(myeloid differentiation primary response protein 88,MyD88)、TIR结构域的衔接蛋白(TIR-domain-containing adapterinducing interferon-β,Trif)、Trif的相关接头分子(Trif-related adaptor molecule,TRAM)、IL-1相关蛋白激酶(interleukin-1 receptor-associated kinase,IRAK)、肿瘤坏死因子受体活化因子6(tumor necrosis factor recep tor-associated factor 6,TRAF6)等[10]。

1.2 TLR4生物学功能与胞内信号转导
不同的TLRs亚型识别相应的PAMPs,介导固有免疫的跨膜信号转导,并激活特异性免疫应答。

1998年,Poltorak等[11]研究表明：C3 H/HeJ小鼠由于TLR4基因第3个外显子发生点突变致其编码的多肽链的第 712位脯氨酸被组氨酸所取代,而
C57 BL/ 10ScCr小鼠因包含TLR4的基因染色体缺失,导致对细菌内毒素耐受,表明革兰阴性菌细胞外膜内毒素的主要成分LPS的免疫应答主要通过TLR4介导。

此外,TLR4还识别类脂质A、热休克蛋白(heat shock proteins,HSP)60、HSP70以及紫杉醇等。

1.2.1 TLR4对LPS的识别革兰阴性菌细胞外膜的LPS释放后,在血液中被LPS结合蛋白(LPS-binding protein,LBP)捕获后将LPS传递给巨噬细胞和单核细胞膜表面的CD14[12]。

CD14通过糖基磷脂酰肌醇(glycosyl-phosphatidyl inositol,GPI)锚定于细胞膜并结合LPS,然后与TLR4结合激活细胞内的信号级联反应。

TLR4的协同受体髓样分化蛋白2(myeloid differentiation-2,MD-2)是一个可溶性蛋白分子,通过与TLR4结合来提高TLR4对LPS的敏感性,并可增加 TLR4受体的稳定性[13-14]。

1.2.2 TLR4的胞内信号转导 TLR4的胞内信号转导可分为MyD88依赖性和非依赖性反应通路(依赖Trif途径),其中MyD88依赖性反应通路是TLR 4主要的胞内信号转导通路[10,15]。

①MyD88依赖性反应通路：MyD88包含氨基端的一个死亡结构域和羧基端的TIR结构域,TIR结构域能够与TLRs的TIR结构域相结合。

当受到配体激活后,MyD88的氨基端死亡结构域与IRAK4的死亡结构域相互作用,使IRAK4介导IRAK-1磷酸化。

磷酸化的IRAK-1与TRAF6结合,介导两条不同的信号转导途径。

一条信号转导途径通过激活丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)活化转录因子激活蛋白1(activating protein-1,AP-1);另一条信号转导途径则通过活化转化生长因子β激酶1(transforming growth factor-β-activated protein kinase 1,TAK1)提高核因子抑制蛋白激酶(inhibitor of NF-кB kinase, IKK)复合物的活性,一旦IKK复合物被激活,核因子抑制蛋白(inhibitor of NF-Кb,IкB)便被磷酸化、泛素化而降解,从而活化核因子-
кB(nuclear factorкB, NF-кB)[10]。

研究[16]结果表明：缺乏 MyD88的小鼠在受
LPS刺激时不能产生IL-12p40亚单位(the p40 subunit of IL-12,IL-12p40)和TNF-α等炎症因子。

②MyD88非依赖性反应通路：由TLR3和TLR4启动,引起Ⅰ型干扰素(interferons,IFNs)激活,主要通过接头蛋白TRAM、Trif引起NF-кB迟发激活和干扰素调节因子3(interferon regulate factor 3,IRF-3)激活,从而诱导IFN-β、诱导型氮氧化物合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)、干扰素诱导蛋
白-10(interferon induced protein-10,IP-10)、糖皮质激素衰减反应基因-
16(glucocorticoid attenuated response gene 16, GARG-16)、干扰素调节基因-1(IFN-regulated gene 1,IRG-1)表达和DC成熟[10]。

两条途径的激活最终导致多种前炎症细胞因子如TNF-α、IL-6、IL-12及IFNs等的表达。

1.2.3 联系固有免疫和获得性免疫通过TLR4的信号转导通路,表达于巨噬细胞或DC表面的TLR4被配体激活后通过MyD88依赖性或非依赖性反应通路启动炎症
介质及辅助刺激因子 CD40、CD80和CD86表达;在辅助刺激因子帮助下,初始 T
细胞在巨噬细胞通过噬菌作用完成抗原呈递后分化为T辅助淋巴细胞(T helper cell,Th)1和Th2,Th1通过分泌IFN-γ促进细胞免疫,Th2通过分泌IL-4、IL-5、
IL-10和 IL-13促进体液免疫[17]。

2 TLR4与脓毒症
2.1 TLR4与脓毒症炎性反应的调控
严重脓毒症患者的病死率仍在 20%～50%[18],超过半数的脓毒症为革兰阴性菌导致[19]。

在对革兰阴性菌及其产物的识别中TLR 4起着关键作用,同时是联系固有
免疫和获得性免疫的桥梁。

动物实验[20]表明：TLR4表达量的多少与前炎症因子
释放量直接相关,且通过调控其信号转导通路调节炎性免疫反应,影响脓毒症的发展。

Hoshino等[21]关于TLR4基因敲除鼠的研究表明TLR4有助于防御内毒素血症;但Weiss等[22]的研究表明TLR4基因突变鼠对革兰阴性菌脓毒症的易感性增加,这是由于激活的TLR4一方面可以激活机体对感染的保护性免疫,同时也介导了全身炎
症反应。

LPS激活TLR4介导的信号通路激活NF-кB, NF-кB进入胞核调控一系列炎症介质的基因表达, TNF-α、IL-1等原发性炎症介质增加,进一步作用于巨噬细胞或DC,从而产生大量的IL-6、IL-8等继发性细胞因子和炎症介质及 CD80、CD86等辅助刺激因子,这些细胞因子和炎症介质不但诱导适应性免疫,还可以进一步激活NF-кB,形成正反馈的级联放大效应,产生过度的炎症反应,严重时产生全身炎症反应综合征(systemic inflammatory response synd rome, SIRS),最终导致脓毒症及多脏器功能障碍综合征(multip le organ dysfunction syndrome,MODS)。

为了避免过度的炎症反应,机体还存在炎症反应的负性调控,这种现象早在 50年前已被报道[23],但当时相关的机制尚不明确。

目前,这种负性调控在TLRs信号通路中已有广泛的研究,TLRs信号转导的负性调节分子已经超过 10种,可分为胞内和胞外两大类[24]。

根据作用方式可分为 5种负性调节机制：①可溶性TLRs竞争相应的配体;②通过跨膜负性调节分子调控;③利用细胞内的负性调节分子调控;④下调TLRs的表达;⑤诱导TLRs信号过强细胞的凋亡。

研究表明,在TLR4信号通路的负性调节分子主要包括：可溶性TLR4,可以阻碍TLR4与MD2的相互作用;IRAK-M 通过抑制IRAK 1的磷酸化抑制TLR4的信号转导[25];Toll作用蛋白(Toll-interacting protein,Tollip)也是通过抑制IRAK 1的磷酸化抑制TLR4的信号转导[26];肿瘤发生抑制物2(suppressor of tumorigenicity,ST2)属于TIR家族,可通过分离MyD88和Mal/TIRAP抑制TLR4和其他IL-1受体[27];防辐射
105(radioprotective 105,RP105)也属于TIR家族的单免疫球蛋白IL-1受体相关分子(single immunoglobulin interleukin-1 receptor-related
molecule,SIGIRR),通过干扰TLR4的TIR功能域竞争TLR4配体[28];MyD88剪接子(MyD88 splicing, MyD88s),抑制MyD88/IRAK复合体,抑制MyD88依赖性反应通路[29];抑制性锌指蛋白(E3-ubiquitin ligase TLR-ubiquitinating enzyme
3A,Triad3A)通过促进TLR4的蛋白降解抑制TLR4的信号转导[30];细胞因子信号
抑制物1(suppressor of cytokine signaling 1, SOCS1)下调TLR4信号通路,但具体机制尚不明确[31]。

2.2 TLR4的基因多态性与脓毒症易感性
基因多态性与脓毒症有密切关系,不同个体对脓毒症的易感性存在个体差异,临床表
现和预后可能均不相同[32]。

TLR4的胞外配体识别区域存在多种基因多态性,影响机体对脓毒症的易感性及预后,其中研究最广泛的是TLR4的Asp299Gly(299位的天冬氨酸被甘氨酸取代)和Thr399Ile(399位的苏氨酸被异亮氨酸取代)基因多态性。

最初Arbour等[33]发现：人TLR4基因的Asp299Gly多态性与吸入LPS后低应
答相关,上皮细胞对 LPS的刺激免疫应答能力减弱。

但是其后的相关研究[34]在TLR4的Asp299Gly基因多态性和革兰阴性菌易感性的关系上却得出了矛盾的结论。

产生这种截然不同的结果的原因主要是大部分关于 TLR4基因多态性的研究将Asp299Gly基因多态性和Thr399Ile基因多态性单独考虑,而忽略了TLR4的这两
种基因多态性存在共分离现象[35],使得 TLR4存在 4种单倍体组合形式(野生型/野生型、Asp299Gly/野生型、Thr399Ile/野生型和Asp299Gly/Thr399Ile)。

Ferwerda等[36]研究显示：只有Asp299Gly/野生型与LPS诱导的前炎症因子TNF-α的释放增加有关,而Asp299Gly/Thr399Ile与野生型/野生型在LPS诱导的前炎症因子TNF-α的释放中无显著差异。

由于人群中Thr399Ile/野生型的TLR4
基因多态性非常罕见,目前尚无关于此型在革兰阴性菌易感性方面的研究结论。

关
于 TLR4基因多态性的研究与不同种族人群对感染性疾病易感性的遗传学研究也密切相关。

种群研究[35]显示：TLR4基因多态性存在特定的人种分布,黑人中
Asp299Gly/野生型的概率比其他人种高 10～20倍,白种人中Asp299Gly/野生型
非常罕见,Asp299Gly/ Thr399Ile突变的概率较大,而黄种人TLR4以野生型/野生
型为主。

在TLR4Asp299Gly/Thr399Ile的遗传学关联研究中,目前比较大规模的
研究支持Asp299Gly/Thr399Ile与疾病的易感性无明显关联[37]。

在
Asp299Gly/野生型研究中,由于将Asp299Gly/野生型单独分离比较困难,因此相关的研究都选择了在Asp299Gly/野生型较集中的黑人中进行,但遗憾的是目前尚无关于TLR4与其配体易感性的相关研究结论。

进一步研究及探索两者的关系及参与因素有重要的理论及临床价值。

3 问题与展望
TLR4的信号转导与调节在脓毒症的病理生理发展过程中具有重要地位,因此对TLR4的研究越来越受到国内外学者的重视。

近几年来,研究各种阻断或抑制TLR4信号通路上各个节点药物也是目前医学研究领域研究的热点。

目前,已有 E5564[38]及TAK-242[39]两种TLR4阻滞剂进入临床研究阶段,其中临床 2期随机对照研究表明大剂量 E5564(105 mg/d)治疗可降低脓毒症病死率[40],相关的大型临床 3期双盲随机对照研究也正在进行中。

而如何提高药物的特异性和选择性,能否开发更具特异性的药物,将是今后研究的重点。

基因多态性的研究也将为危重易感人群的早期诊断、预后分析以及基因治疗开辟新的途径。

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