五味子多糖对人结肠癌HT-29细胞体外增殖及侵袭能力的抑制作用

五味子多糖对人结肠癌HT-29细胞体外增殖及侵袭能力的抑
制作用
黄晓东;路倩;沈楠;王艳春
【摘要】目的:探讨五味子多糖(ASPS)对人结肠癌HT-29细胞增殖和侵袭活性的影响,阐明ASPS的抗肿瘤作用.方法:40只Wistar大鼠随机分为对照组(给予生理盐水)和100、200、400 mg.kg-1 ASPS组,每组10只,取各组大鼠血清,HT-29细胞体外培养,以各组大鼠血清进行预处理,采用MTT法和Transwell小室检测各组HT-29细胞的增殖抑制率和侵袭活性抑制率;Western blotting法检测各组细胞上清液中bcl-2、bax和Caspase-3蛋白表达水平.结果:与对照组和100 mg.kg-1 ASPS组比较,200和400 mg.kg-1 ASPS组HT-29细胞增殖抑制率和侵袭活性抑制率均升高(P＜0.05,P＜0.01).400 mg· kg-1 ASPS组HT-29细胞上清液中bcl-2蛋白表达水平低于其他组(P＜0.05,P＜0.01),bax和Caspase-3蛋白的表达水平高于对照组(P＜0.05,P＜0.01).结论:ASPS能显著抑制细胞的体外增殖和侵袭能力,其机制可能与下调HT-29细胞的bcl-2基因表达,上调bax和Caspase-3基因表达,激活细胞凋亡通道有关联.
【期刊名称】《吉林大学学报（医学版）》
【年(卷),期】2015(041)002
【总页数】4页(P287-290)
【关键词】结直肠肿瘤;五味子多糖;侵袭活性;细胞凋亡
【作者】黄晓东;路倩;沈楠;王艳春
【作者单位】吉林医药学院药理学教研室,吉林吉林132013;吉林医药学院药理学教研室,吉林吉林132013;吉林医药学院机能实验中心,吉林吉林132013;吉林医药学院药理学教研室,吉林吉林132013
【正文语种】中文
【中图分类】R730.52;R735.3
直肠癌患者死亡的主要原因是肿瘤的复发和转移，控制恶性肿瘤侵袭和转移非常重要。

五味子多糖(Alkaline S. chinensis polysaccharides，ASPS)为中药北五味子中的主要成分，含有多种果糖、多聚糖、氨基酸和10余种微量元素[1-2]。

大量研究[3-5]表明：ASPS可以抗肿瘤，诱导肿瘤细胞凋亡。

但是其抑制肿瘤转移及其机制均未见报道。

本研究采用ASPS含药血清对人结肠癌HT-29细胞进行预处理，观察ASPS对HT-29细胞增殖和侵袭活性的抑制作用，并对其作用机制进行初步探讨。

1.1 细胞及主要试剂人结肠癌细胞株HT-29由吉林大学基础医学院提供；40只Wistar大鼠，SPF级，雌雄各半，体质量(180±20)g，购于吉林大学实验动物中心(动物合格证号：SCXK吉-2012-0104)。

ASPS由吉林大学药学院药物分析教研室自提，纯度为91.4%；bax鼠抗人单克隆抗体、bcl-2鼠抗人单克隆抗体、FITC-羊抗鼠单克隆抗体、兔抗人β-肌动蛋白多克隆抗体和鼠抗人Caspase-3单克隆抗体购于北京中杉公司；Transwell小室购于美国Corning公司；蛋白Marker和PVDF膜购于凯基生物科技发展有限公司。

1.2 ASPS血清的制备40只Wistar大鼠随机分为对照组和100、200、400 mg·kg-1ASPS组，每组10只。

各ASPS组大鼠给予灌胃ASPS，每天2次，对照组大鼠灌胃生理盐水，连续7 d。

麻醉大鼠后，腹主动脉取血，离心分离血清，56℃水浴中，灭活30 min后，用0.22 μm微孔滤膜过滤除菌，-20℃保存。

1.3 MTT法检测HT-29细胞增殖抑制率用RPMI-1640培养基配制HT-29细胞悬液接种于96孔板中，每孔加200 μL，培养24 h；取出孔板弃去上清，加入10% ASPS血清200 μL，培养72 h；再弃上清，加入200 μL MTT(0.5 g·L-1)，作用4 h后，吸去上清，加入200 μL DMSO，摇床混匀10 min，于酶标仪570 nm波长处测定吸光度(A)值，重复3次。

细胞增殖抑制率=(对照组A值-实验组A 值)/对照组A值×100%。

1.4 Transwell小室法检测HT-29细胞的侵袭活性抑制率取HT-29细胞
1×105 mL-1，接种于Transwell板的上室，每孔160 μL，再加入20% ASPS血清40 μL，将800 μL RPMI-1640培养基加入下室，培养24 h。

倒置上室，甲醇固定20 min，PBS漂洗×2，染色5 min，蒸馏水漂洗，1%盐酸酒精浸泡10 s，再用蒸馏水漂洗，淡氨水浸泡5 min，漂洗，依次放入体积分数为90% 和100%的酒精脱水，剪下滤膜，正置载玻片上，计数。

观察中央和上下左右各5个视野的侵入滤膜细胞数，取均值。

侵袭活性抑制率=(对照组侵入滤膜细胞数-ASPS组侵入滤膜细胞数)/对照组侵入滤膜细胞数×100%。

1.5 Western blotting法测定HT-29细胞上清液中bcl-2、bax和Caspase-3蛋白表达水平取HT-29细胞1×105个，培养24 h，加入不同浓度ASPS组血清，处理48 h后，收集细胞。

bradford法提取蛋白，将20 μg蛋白加入缓冲液进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，转至PVDF膜，5%脱脂奶粉室温封闭1 h，室温下PBS-T洗膜3次，分别加入1∶200稀释一抗4℃孵育过夜，再分别加入1∶1 000稀释的相应二抗，室温孵育1 h，室温PBS-T洗3次，DAB显色。

Imagel 凝胶成像系统采集图像，目的条带净灰度值与内参照β-actin测定值的比值即蛋白表达水平。

实验重复3次。

1.6 统计学分析采用SPSS 13.0统计软件进行数据分析。

HT-29细胞增殖抑制率、侵袭活性抑制率和HT-29细胞上清液中bcl-2、bax、Caspase-3蛋白表达
水平以±s表示，组间比较采用t检验。

2.1 各组HT-29细胞增殖抑制率和侵袭活性抑制率MTT检测：不同浓度ASPS 含药血清培育72 h后，HT-29细胞株均表现为抑制，200和400 mg·kg-1ASPS 组HT-29细胞增殖抑制率均高于对照组和100 mg·kg-1ASPS组(P<0.05或
P<0.01)。

200和400 mg·kg-1 ASPS组HT-29细胞侵袭活性抑制率均高于对照
组和100 mg·kg-1ASPS组(P<0.05)。

见表1。

2.2 HT-29细胞上清液中bcl-2、bax和 Caspase-3蛋白的表达免疫印迹法检测：与对照组比较，400 mg·kg-1ASPS组HT-29细胞上清液中bcl-2蛋白表达
水平降低(P<0.01)，200和400 mg·kg-1ASPS组HT-29细胞上清液中bax蛋白表达水平升高(P<0.05)。

Caspase-3条带随ASPS浓度的增大而明显变深，与对
照组比较，200和400 mg·kg-1ASPS 组HT-29细胞上清液中Caspase-3蛋白表达水平明显升高(P<0.05)。

见图1和表2。

结直肠癌是消化系统常见的恶性肿瘤，行切除术后的患者有一半以上会出现复发和远端转移，有50%～60%结直肠癌患者表现为进行性肝转移[6]。

除手术治疗外，化疗所用的常用药物在杀灭结肠癌细胞同时，也会损害正常细胞，所以对患者伤害较大。

ASPS在提高机体的非特异性免疫功能的同时，还可以升高外周血白细胞数，增强机体非特异性免疫功能和体液免疫功能，提高机体的抗癌能力[7]。

本实验观
察了含ASPS血清对HT29细胞的抑制作用，结果显示：ASPS血清可以明显抑制人结肠癌HT-29细胞株的增殖，200、400 mg·kg-1 ASPS组细胞增殖抑制率分
别为10.52%±5.2%、13.75%±3.4%，说明ASPS可以抑制结肠癌HT-29细胞的增殖。

恶性肿瘤的最主要标志是侵袭和转移[8]。

脱离原发灶的肿瘤细胞，在黏连蛋白等
表面黏附分子的特异性黏附作用下黏附于器官表面，并穿入细胞间隙释放基质蛋白水解酶，降解局部基质，穿过基底膜后，向周围间质侵润性生长，大量增殖成新的
肿瘤[9]。

肿瘤细胞侵袭转移最先到达的就是细胞基底膜。

Transwell小室模型中，肿瘤细胞穿过基质凝胶，到达另一侧，计算其数量，可反映其侵袭活性[10-11]。

本实验采用Transwell小室做为模型，观察ASPS含药血清对HT-29细胞体外侵袭活性的抑制作用，结果表明：ASPS含药血清可以明显抑制HT-29体外侵袭基底膜Matrigel成分，其抑制率高于对照组，说明ASPS对结直肠癌HT-29细胞的转移有抑制作用。

bcl-2基因家族主要作用于细胞线粒体[12]，其中bcl-2抑制细胞凋亡，bax促进细胞凋亡，两者功能相反却共同参与着细胞凋亡，bcl-2/bax比值是影响细胞凋亡的关键因素[13]。

bcl-2家族蛋白与蛋白酪氨酸磷酸酶结合，开放线粒体膜转运孔通道，释放大量细胞色素C，结合细胞凋亡激活因子Apaf-1，使Caspase-9前体活化，促使Caspase-3激活，引发Caspases 级联反应，从而诱发细胞凋亡[14-15]。

本研究中Western blotting结果表明：HT-29细胞在ASPS含药血清处理下，上清中bcl-2蛋白表达条带变窄、变浅，bax蛋白表达条带明显变宽、变深，说明bax基因的表达产物随ASPS浓度的升高而表达增加，bcl-2基因的表达产物水平随之降低。

同时，Caspase-3蛋白表达水平也随着ASPS浓度升高而升高。

说明ASPS可能通过调节HT-29细胞凋亡相关基因，使bax基因的表达上调，bcl-2表达下调，激活Caspase凋亡通路，而诱导肿瘤细胞凋亡。

综上所述，ASPS对肿瘤细胞的侵袭转移有明显的抑制作用，并可诱导细胞凋亡，这为临床开发新的抗肿瘤药物提供了理论依据，其具体机制有待于进一步研究。

【相关文献】
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