斑点叉尾!病毒“自杀性”DNA疫苗的构建及其体外表达检测

１ ． １ 材料 １ ． １ ． １ 质粒、 细胞、 菌株和引物 含 Ｃ Ｃ ＶＯ Ｒ Ｆ ６质 粒ｐ Ｇ Ｅ Ｍ－ Ｔ Ｏ Ｒ Ｆ ６由本实验室刘玉林博士构建（ 黄 ２ ０ １ ０ ） 。人胚肾细胞（ ２ ９ ３ Ｔ ） 购自武汉大学 锋涛等， 保藏中心， 常规 Ｄ Ｎ Ａ疫苗载体 ｐ ｃ Ｄ Ｎ Ａ ３ ． １ （＋ ） 由本 实验室保存， “ 自杀性” Ｄ Ｎ Ａ疫苗载体 ｐ Ｓ Ｆ Ｖ由华中 农业大学 动 物 医 学 院 肖 少 波 博 士 惠 赠， 大肠杆菌
ｐ ｃ ｄ ２５ ′ － Ｔ Ａ ＣＧ Ａ ＡＴ Ｔ ＣＴ Ｃ ＡＧ Ａ ＣＣ Ｃ ＧＧ Ａ ＴＣ Ｔ ＣＣ Ｇ ＣＴ Ｔ Ｃ－ ３ ′
１ ． １ ． ２ 主要试剂 各种限制性内切酶、 Ｄ Ｎ ＡＭ ａ ｒ ｋ ｅ ｒ 、 Ｔ ４Ｄ Ｎ Ａ连接酶等工具酶均为大连宝生物公司产 ａ ｑＤ Ｎ Ａ 聚合酶、 ｄ Ｎ Ｔ Ｐ 、 Ｄ Ｎ Ａ回收试剂盒及质 品。Ｔ 粒提取试剂盒购自鼎国生物技术有限公司。脂质体 转染 试 剂 盒 Ｌ ｉ ｐ ｆ ｅ ｃ ｔ ｉ ｎ ２ ０ ０ ０为 Ｉ ｎ ｖ ｉ ｔ ｒ ｏ ｇ ｅ ｎ公 司 产 品。 Ｃ ＶＯ Ｒ Ｆ ６多克隆 其它试剂均为国产分析纯。兔抗 Ｃ 抗体由本实验室制备。 １ ． ２ 实验方法 １ ． ２ ． １ Ｃ Ｃ Ｖ “ 自杀性” Ｄ Ｎ Ａ疫苗及常规 Ｄ Ｎ Ａ疫苗 的构建 １ ． ２ ． １ ． １ Ｃ Ｃ ＶＯ Ｒ Ｆ ６扩增 以 ｐ Ｇ Ｅ Ｍ －Ｔ Ｏ Ｒ Ｆ ６为 模板， 分别以 ２对引物 ｓ ｆ ｖ １ ／ ｓ ｆ ｖ ２和 ｐ ｃ ｄ １ ／ ｐ ｃ ｄ ２扩增 Ｃ Ｃ ＶＯ Ｒ Ｆ ６ 。Ｐ Ｃ Ｒ 反 应 体 系 为： １ ０×ｂ ｕ ｆ ｆ ｅ ｒ２ μ Ｌ ， Ｍ ｇ Ｃ ｌ Ｌ ， ｄ Ｎ Ｔ Ｐ ｓ ０ ． ３μ Ｌ ， 上下游引物各 ０ ． ４μ Ｌ ， ２ ２μ 模板 Ｄ Ｎ Ａ３μ Ｌ ， Ｔ ａ ｑ Ｄ Ｎ Ａ聚合酶 ０ ． ２μ Ｌ ， 加水至 ２ ０ Ｌ 。反应程序为 ９ ４℃预变性 ４ ｍ ｉ ｎ ， ９ ４ ℃、 ３ ０～ ４ ５ ｓ ， μ ５ ５～ ６ ０ ℃、 ６ ０ ｓ ， ７ ２ ℃、 ６ ０ｓ ， 共２ ５～ ３ ０个循环， ７ ２ ℃延 伸 ７ｍ ｉ ｎ 。Ｐ Ｃ Ｒ产物按 Ｄ Ｎ Ａ回收试剂盒说明书进行 回收。 １ ． ２ ． １ ． ２ 酶切及连接 “ 自杀性” Ｄ Ｎ Ａ疫苗表达载 Ｓ Ｆ Ｖ用 Ｂ ａ ｍ ＨＩ 酶切， 为防止 ｐ Ｓ Ｆ Ｖ载体酶切后 体ｐ 自连， 用去磷酸化酶将其去磷酸化； 以ｓ ｆ ｖ １ ／ ｓ ｆ ｖ ２为 引物扩增的 Ｐ Ｃ Ｒ产物用 Ｂ ｇ ｌ 将二者的回收 Ⅱ 酶切， 产物用 Ｔ ４Ｄ Ｎ Ａ连接酶连接。常规 Ｄ Ｎ Ａ疫苗表达 载体 ｐ ｃ Ｄ Ｎ Ａ ３ ． １ （＋ ） 和以 ｐ ｃ ｄ １ ／ ｐ ｃ ｄ ２为引物扩增的 Ｐ Ｃ Ｒ产物分别用 Ｈ ｉ ｎ ｄⅢ 和 Ｅ ｃ ｏ ＲⅠ 双酶切， 将二者 的回收产物用 Ｔ ４Ｄ Ｎ Ａ连接酶连接。 １ ． ２ ． １ ． ３ 转化 取 － ８ ０ ℃ 冻存的感受态细胞 Ｅ ． ｃ ｏ ｌ ｉ Ｄ Ｈ ５ 分装于 ２个 无 菌 的 １ ． ５ α于冰上融化后， ｍ ＬＥ Ｐ管中， 加入连接产物（ 约 ５μ Ｌ ） ， 混匀， 冰上放 置３ ０ｍ ｉ ｎ ， ４ ２ ℃水浴热击 ９ ０ｓ ， 放回冰上 ３～ ５ｍ ｉ ｎ ， ０ ０μ ＬＬ Ｂ液体培养基， 于恒温摇床 ３ ７ ℃、 １ ８ ０ 加入 ２ ｒ ／ ｍ ｉ ｎ 培养 ４ ５ｍ ｉ ｎ ， 各取 １ ０ ０μ Ｌ菌液涂布 ２个平板，
（ 华中农业大学水产学院 农业动物遗传育种与繁殖教育部重点实验室， 湖北 武汉 ４ ３ ０ ０ ７ ０ ） 摘要： 根据 Ｃ Ｃ ＶＯ Ｒ Ｆ ６基因序列， 设计合适的引物， 扩增 Ｏ Ｒ Ｆ ６基因， 分别将其克隆到“ 自杀性” Ｄ Ｎ Ａ疫苗载体 ｐ Ｓ Ｆ Ｖ与常规 Ｄ Ｎ Ａ疫苗载体 ｐ ｃ Ｄ Ｎ Ａ ３ ． １ （＋ ） 中， 转化感受态细胞 Ｄ Ｈ ５ 构建斑点叉尾（ Ｉ ｃ ｔ ａ ｌ ｕ ｒ ｕ ｓ ｐ ｕ ｎ ｃ α后提取质粒， ｔ ａ ｔ ｕ ｓ ）“ 自杀性” Ｄ Ｎ Ａ疫苗 ｐ ｓ － Ｏ Ｒ Ｆ ６与常规 Ｄ Ｎ Ａ疫苗 ｐ ｃ ｄ － Ｏ Ｒ Ｆ ６ ， 利用转化后的大肠杆菌菌液为模板进行 Ｐ Ｃ Ｒ 扩增、 提取质粒酶切鉴定以及序列测定等方法证实重组质粒构建正确。将重组质粒转染人胚肾细胞（ ２ ９ ３ Ｔ ） ， 间 接免疫荧光试验表明 Ｏ Ｒ Ｆ ６均获得表达， 但“ 自杀性” Ｄ Ｎ Ａ疫苗的表达效果不如常规 Ｄ Ｎ Ａ疫苗， 该研究为这 ２种 疫苗进一步的鱼体试验奠定了基础。 关键词：斑点叉尾病毒； “ 自杀性” Ｄ Ｎ Ａ疫苗； 构建； 表达 中图分类号： Ｑ ３ ４ ３ ． １ 文献标志码： Ａ 文章编号： １ ６ ７ ４－ ３ ０ ７ ５ （ ２ ０ １ １ ） ０ １－ ０ ０ ８ ４－ ０ ５
第３ ２ 卷第１ 期 ２ ０ １ １ 年 １ 月
水生态学杂志 Ｊ ｏ ｕ ｒ ｎ ａ ｌ ｏ ｆ Ｈ ｙ ｄ ｒ ｏ ｅ ｃ ｏ ｌ ｏ ｇ ｙ
Ｖ ｏ ｌ ． ３ ２ ， Ｎ ｏ ． １ ， ２ ０ １ １ Ｊ ａ ｎ ．
斑点叉尾 病毒“ 自杀性” Ｄ Ｎ Ａ疫苗的构建及其体外表达检测
熊海林， 尹殿卯， 王卫民， 王 敏， 李莉娟， 刘玉林， 刘学芹， 吴 兵， 黄锋涛
我国于 ２ ０世纪 ８ ０年代从美国引进斑点叉尾 （ Ｉ ｃ ｔ ａ ｌ ｕ ｒ ｕ ｓ ｐ ｕ ｎ ｃ ｔ ａ ｔ ｕ ｓ ） ， 随后其养殖规模在不断扩大 ２ ０ ０ ６ ） 。尽管目前尚无斑点叉尾 病毒 （ 刘玉林等， （ ｃ ｈ ａ ｎ ｎ ｅ ｌ ｃ ａ ｔ ｆ ｉ ｓ ｈｖ ｉ ｒ ｕ ｓ ，Ｃ Ｃ Ｖ ） 的正式报道， 但近年来， 国内已有疑似病例的报道（ 耿毅和汪开毓， ２ ０ ０ ５ ） 。 Ｃ Ｃ Ｖ是 Ｆ ｉ ｊ ａ ｎ （ １ ９ ６ ８ ） 发现的一种线性双链 Ｄ Ｎ Ａ病 毒， 是鱼类中最先发现的疱疹病毒； 该病毒主要感染 斑点叉尾鱼苗， 引起严重的急性出血性疾病， 并可 导致 ４ ０ ％～ ９ ０ ％的鱼苗死亡（ Ｋ ｅ ｎ ｎ ｅ ｔ ｈｅ ｔ ａ ｌ ， ２ ０ ０ ２ ） ； 此病毒虽然对成鱼的致病力较弱， 但成鱼仍可隐性 感染， 并成为传染源（ Ｇ ｒ ａ ｙｅ ｔ ａ ｌ ， １ ９ ９ ９ ） 。因此， 开展 Ｃ Ｃ Ｖ疫苗研究， 对于该病的预防和控制具有重要意 义。 鱼类疾病免疫预防技术研究已经深入到分子生 物学水平， Ｄ Ｎ Ａ疫苗的研究发展迅速。 Ｈ ａ ｎ ｓ ｅ ｎ等 （ １ ９ ９ １ ） 首先报道了外源基因能够在鲤肌肉组织中 表达； Ａ ｎ ｄ ｅ ｒ ｓ ｏ ｎ 等（ ２ ０ ０ ０ ） 报告了带有 Ｉ Ｈ Ｎ Ｖ 糖蛋白 基因的质粒能够在虹鳟中表达， 并使受免疫鱼对该 病毒具有一定的免疫力。在虹鳟 Ｄ Ｎ Ａ疫苗的攻毒 实验中， Ｌ ｏ ｒ ｅ ｎ ｚ ｅ ｎ等（ １ ９ ９ ９ ； ２ ０ ０ １ ； ２ ０ ０ ２ ） 等构建了带 Ｈ Ｎ Ｖ病 毒 Ｇ蛋 白 基 因 的 Ｄ Ｎ Ａ疫 苗 能 够 诱 导 有Ｉ
７ ５ ％的虹 鳟 产 生 较 高 水 平 的 免 疫 保 护； Ｔ ｏ ｍ ｏ ｋ ａ ｚ ｕ （ ２ ０ ０ ４ ） 在杆状病毒糖蛋白基因的质粒 Ｄ Ｎ Ａ免疫后 ４ｄ后， 注 的日本比目鱼的攻毒实验中发现， 攻毒 １ 射Ｄ Ｎ Ａ含量为 １μ ｇ组， 死亡率达到 ２ ８ ． ８ ％， 而１ ０ ． ８ ％， 对照组则全部死亡， 表现 ｍ ｇ组的死亡率为 ８ 出了一定的免疫效果。“ 自杀性” Ｄ Ｎ Ａ 疫苗（ ｓ ｕ ｉ ｃ ｉ ｄ ）是基于常规 Ｄ Ｎ Ａ 疫苗和“ 自主复 ａ ｌ Ｄ Ｎ Ａｖ ａ ｃ ｃ ｉ ｎ ｅ 制型” Ｒ Ｎ Ａ 疫苗（ ｓ ｅ ｌ ｆ －ｒ ｅ ｐ ｌ ｉ ｃ ａ ｔ ｉ ｎ ｇＲ Ｎ Ａｖ ａ ｃ ｃ ｉ ｎ ｅ ）基 Ｎ Ａ 础上发展起来的一种新型疫苗， 不仅具有常规 Ｄ 疫苗 易 制 备、 运 输、 保 存 等 方 面 的 优 点， 而且还有 Ｒ Ｎ Ａ疫苗的安全性与有效性， 是比常 “ 自主复制型” 规Ｄ Ｎ Ａ疫苗更加安全、 免疫效力更强的一种新型基 ２ ０ ０ ４ ； 孙世琪等， ２ ０ ０ ７ ； 向 因疫苗（ 许信刚和张彦明， ２ ０ ０ ７ ） 。Ｋ ｅ ｎ ｎ ｅ ｔ ｈ等 （ ２ ０ ０ ２ ）以 Ｃ Ｃ ＶＯ Ｒ Ｆ ６ 、 菁等， Ｏ Ｒ Ｆ ７ 、 Ｏ Ｒ Ｆ ５ ３和 Ｏ Ｒ Ｆ ５ ９等多个基因制备常规 Ｄ Ｎ Ａ 疫苗， 免疫实验发现 Ｏ Ｒ Ｆ ６和 Ｏ Ｒ Ｆ ５ ９的 抗 原 性 较 好。本实验根据现有研究基础， 选择 Ｃ Ｃ ＶＯ Ｒ Ｆ ６基 因构建“ 自杀性” Ｄ Ｎ Ａ疫苗和常规 Ｄ Ｎ Ａ疫苗， 并在 细胞水平验证和比较二者表达外源基因的效果， 为 进一步的鱼体实验奠定ine是基于常规dna疫苗和自主复制型rna疫苗selfreplicatingrnavaccine础上发展起来的一种新型疫苗不仅具有常规dna疫苗易制备运输保存等方面的优点而且还有自主复制型rna疫苗的安全性与有效性是比常规dna疫苗更加安全免疫效力更强的一种新型基ccvorf6orf7orf53和orf59等多个基因制备常规dna疫苗免疫实验发现orf6orf59的抗原性较本实验根据现有研究基础选择ccvorf6因构建自杀性dna疫苗和常规dna疫苗并在细胞水平验证和比较二者表达外源基因的效果为进一步的鱼体实验奠定基础
２ ０ １ １年第 １期 熊海林等， 斑点叉尾病毒“ 自杀性” Ｄ Ｎ Ａ疫苗的构建及其体外表达检测
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Ｄ Ｈ ５ α购自武汉凯胜生物技术有限公司。 本研究共 设 计 了 ２对 引 物 （ 表１ ） ， 引物 ｓ ｆ ｖ １ ／ ｓ ｆ ｖ ２两端加入了 Ｂ ａ ｍＨＩ 酶切位点， 引物 ｐ ｃ ｄ １ ／ ｐ ｃ ｄ ２ 两端分别加入了 Ｈ ｉ ｎ ｄＩ Ｉ Ｉ 和Ｅ ｃ ｏ ＲＩ 酶切位点， 引物 ｎ ｖ ｉ ｔ ｒ ｏ ｇ ｅ ｎ 公司合成。 由Ｉ
３ ７ ℃培养至单菌落出现。 １ ． ２ ． １ ． ４ 阳性克隆鉴定 挑取单菌落于装有 ３ｍ Ｌ 液体 Ｌ Ｂ （ 含氨苄青霉素 １ ０ ０μ ｇ ／ ｍ Ｌ ） 细菌瓶， 置于恒 ７ ℃、 １ ８ ０ ｒ ／ ｍ ｉ ｎ 培养过夜。通过菌液 Ｐ Ｃ Ｒ 温摇床内 ３ 扩增和质粒酶切鉴定等方法挑选阳性克隆， 并送至 Ｉ ｎ ｖ ｉ ｔ ｒ ｏ ｇ ｅ ｎ 公司进行测序。 １ ． ２ ． ２ Ｃ Ｃ Ｖ “ 自杀性” Ｄ Ｎ Ａ疫苗及常规 Ｄ Ｎ Ａ疫苗 体外表达检测 １ ． ２ ． ２ ． １ 转染 将测序正确的重组质粒在脂质体 介导下转染 ２ ９ ３ Ｔ细胞， 转染步骤按试剂盒说明书进 行。 １ ． ２ ． ２ ． ２ 间接免疫荧光试验（ Ｉ Ｆ Ａ ） 转染 ４ ８ｈ 后， Ｂ Ｓ洗涤 ３次， １ ０ ０ ％ 甲醇室温固 将待检测细胞用 Ｐ 定１ ０ｍ ｉ ｎ ， Ｐ Ｂ Ｓ洗涤 ３次， 用含 １ ０ ％ 牛血清的 Ｐ Ｂ Ｓ 封闭 ３ ０ｍ ｉ ｎ ， 然后依次分别与兔抗 Ｃ Ｃ ＶＯ Ｒ Ｆ ６多抗 为一抗， Ｆ Ｉ Ｔ Ｃ标记的羊抗兔 Ｉ ｇ Ｇ为二抗， ３ ７ ℃ 作用 ３ ０ｍ ｉ ｎ ， 其间用 Ｐ Ｂ Ｓ洗涤， 与二抗反应后再用 Ｐ Ｂ Ｓ 洗涤 ３次， 于倒置荧光显微镜（ Ｏ ｌ ｙ ｍ ｐ ｕ ｓＩ Ｘ ７ ０ ） 下观 察转染细胞的荧光情况并照相。
表１ 寡核苷酸引物序列 Ｔ ａ ｂ ． １ Ｏ ｌ ｉ ｏ ｇ ｎ ｕ ｃ ｌ ｅ ｏ ｔ ｉ ｄ ｅＰ ｒ ｉ ｍｅ ｒ ｓ
引物 ｓ ｆ ｖ １ ｓ ｆ ｖ ２ ｐ ｃ ｄ １ 序 列 ５ ′－ Ｔ Ｃ ＧＡ Ｇ ＡＴ Ｃ ＴＡ Ｔ ＧＡ Ａ ＣＴ Ｃ ＴＣ Ｔ ＣＡ Ｃ ＴＡ Ｔ Ｃ－ ３ ′ ５ ′－ Ｔ Ｔ ＴＡ Ｇ ＡＴ Ｃ ＴＴ Ｃ ＡＧ Ａ ＣＣ Ｃ ＧＧ Ａ ＴＣ Ｔ ＣＣ Ｇ Ｃ－ ３ ′ ５ ′－ Ｇ Ｃ ＧＡ Ａ ＧＣ Ｔ ＴＡ Ｔ ＧＡ Ａ ＣＴ Ｃ ＴＣ Ｔ ＣＡ Ｃ ＴＡ Ｔ Ｃ－ ３ ′
１ 材料和方法
收稿日期： ２ ０ １ ０－ ０ ７－ １ ２ 基金项目： 国家自然科学基金（ ３ ０ ９ ０ １ １ １ ８ ） ； 教育部新教师基金 （ ２ ０ ０ ７ ０ ５ ０ ４ ０ ４ ７ ） ； 湖北省自然科学基金（ ２ ０ ０ ８ Ｃ Ｂ Ｂ ０ ９ ９ ） ； 华中农业大学 教师启动基金 （ ２ ０ ０ ６ Ｘ Ｒ Ｃ ０ ４ ７ ） 。 通讯作者： 刘学芹， １ ９ ７ ５年生， 女， 副教授， 博士， 主要从事动物 病毒学研究。Ｅ ｍ ａ ｉ ｌ ： ｘ ｕ ｅ ｑ ｉ ｎ ｌ ｉ ｕ ＠ｍ ａ ｉ ｌ ． ｈ ｚ ａ ｕ ． ｅ ｄ ｕ ． ｃ ｎ 作者简介： 熊海林， １ ９ ８ ０年生， 男， 讲师， 主要从事鱼类病毒学研 究。Ｅ ｍ ａ ｉ ｌ ： ｘ ｈ ｌ ＠ｍ ａ ｉ ｌ ． ｈ ｚ ａ ｕ ． ｅ ｄ ｕ ． ｃ ｎ