幼丹顶鹤感染血孢子虫的PCR鉴定

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确 诊 病 原 ,本 实 验 利 用 C t,C ,1Sr N yb O I 8 R A及 线 粒 体
20 0 5@ 1 3 c m 6 . o

鹤 类 感 染 血 孢 子 虫 的 报 道 很 少 ,仅 发 现 有 H e ort s am po u e
第 一作 者 简 介 :贾 婷 ,女 ,2 7岁 ,硕 士 研 究 生 :主 要 从 事 野 生 动物 寄 生虫 研 究 工 作 。 E—m i it g al ai :j n 通 讯 作 者 :张 金 国 ,E—ma :zagnu0 1 eh nt i h nj gc0 @y a. e l i
Re — r wn d Cr n e igZo d—co e a ei B in o n j
JaT n i ig ・ Z a gC e gi L u Xin o g Ya gM ig a Ha i h n h n l n i a y n n nhi oL l i
p rst a eemi e o b mb ro i s e is h u h t ee we e mop o o ia i e e c sb t e n i fc e a a i a a i W d tr n d t e a me e ft s p ce ,t o g h r r r h lg c l f r n e e w e n e t d p r st e s h df e
pi e lf d DNA r g ns we e c o d a d s qu n e n o tuce yo e tc te t h b ih d DNA e e c s o i fa me t r lne n e e c d a d c nsr t d a ph lg nei r e wih t e pu ls e s qu n e f Pls di a mo um p s .,L u o y o o n s an e c c tz o p. d Hae pr tu p. i mo oe s s n Gen nk, b ot r EGA 0. DNA s q e e c mp rs n Ba y s fwa e M 4. e u nc o a io i diae h tte hih s e u n e ho lg n c t d t a h g e ts q e c moo y,98 % wa t e h l n d Cyb g n nd t to a mo i m elt sbewe n t e c o e t e e a ha fPls d u r t um o t e c s h
mtcodil ee ep r i : y c rm ee(C t ) y crm xds (C ) 1 Sr N eeadtea — i hnr nst aa t ct ho ebgn o ag h se o yb ,Ct ho eoiae1 o O 1 , 8 A gn n l R h n
表 l 扩 增血 孢子 虫 C t,C y b O I,1 Sr N 以及 线 粒 体 非 编 码 区 部 分 序 列 的 引 物 8 A R
所有 P R反 应 均 在 2 1 系 中进 行 ,包 含 1 C 5 体 0×
P R b fr2 5 l 种 d T C u e . ,4 f N P各 12 M ( aa , 大 .5m Tkr a
连) ,Mg 13 0 mM,上 下 游 引 物 各0 6 m ,0 5 U Am. C . . M .
( .北京动物 园,北京 ,104 ;2 1 0 0 4 .中国农 业大学动物 医学院 ,北京 ,10 9 ) 0 13
摘 要 :20 20 06~ 0 8年 ,北 京 动 物 园繁 殖 的 1 7只 15~ . . 3 5月 龄 丹 顶 鹤 幼 鹤 出现 厌 食 、精 神 倦 怠 、 呼 吸 困 难 等 症 状 。 采 用 P R方 法 鉴 定 病 原 ,使 用 特异 性 引 物 对 线 粒 体 细 胞 色 素 b 细胞 色 素 氧 化 酶 I 1Sr N 及 线 粒 体 部 分 非 编 码 C 、 、 8 R A 区基 因进 行 扩 增 、克 隆 、测 序 ,结 合 G n a k中 已 知 疟 原 虫序 列 ,经 D A A 软 件 处 理 分 析 ,并 对 C t 序 列 用软 eB n N M N yb
ce ecct ongu 等 4种 血 孢 子 虫 , 目前 尚未 有 a ,Luo o o rs yz i 丹 顶鹤 感 染残 疟 原 虫 的 报 道 。 北 京 动 物 园 有 包 括 丹 项 鹤 ( rsaoes ) 自 鹤 Gu j nni 、 p s
( rsluo ea u ) 在 内 的 多 种 鹤 繁 殖 。 自 1 8 G u eeg rn s 9 7年 以
P a cu u Ti n h n S iT a y a h u n u n Xi a h a aM o u
L oYi u
Ya e c a nW n h o
W u Xi s a uh n
S 0Xu Z a gJn u u n h n i g o
(. ei o , e n 104 ,C i 2 P rsooyL brt y C lg 1 Bin Z o B i g, 0 0 4 h a; . aail a o o , oeeo jg n t g ar l f
中 电泳 , 一 胶 成 像 仪 观 察 结 果 。 凝
使 用 D es l d& Ts e 剂 盒 ( i e ,V l — N ayBo o iu 试 s Qa n a n g e
c ,Clo i U A) N i a f na S 。D A提 取后 用 1 a ir %琼 脂糖 凝胶 电
34 2
要 婷等:幼丹顶鹤感染血孢子虫的P R鉴定 C 泳检测浓度和质量 ,储存于 一 0C 2  ̄ 条件下备 用。
13 P R 引物 设 计 及 扩 增 . C
6 期
部 分 非编 码 基 因等 不 同 基 因序 列 的 血 孢 子 虫 目和 各 属 特 异 性 引物 ,进 行 病 原 P R检 测 ,并 进 行 序 列 分 析 以及 系 C 统进化分析。
a d h e o e a mo u r l tm n h rd. n t e r p f d Pls di m ei u i t e wo l l c K e o ds: Re —c o yw r d r wne r n d c a e;Ha mo poi i n:PCR e hnqu e s rd a tc i e:Pls d u rlc u a mo i m eit m
件 ME A4 0建 N 树 。序列分析表 明丹顶鹤血 孢子虫靶 序列与 乌疟原虫序 列相似性 达到 9 % 以上 ,进化关 系分析 G . J 8 表明与残疟原 虫各株属 同一个种群 ,证 明该病病原 为残 疟原虫。但该血孢子虫与残疟原虫 已报道各株形 态有一定 差
异 ,可 能 为 寄 生 于 丹 顶 鹤 的一 个 新 基 因型 。
( l m du 。国外 有很 多 鸟 类 感 染 残 疟 原 虫 的 报 Pa oim) s
道 ,国 内也 有 一 些 研 究 ] ,但 相 对 较 少 。世 界 上
来 ,每年 7~ 9月 间,幼丹顶鹤易发生血孢子虫感染 ,感 染 幼鹤发 病突然 ,死亡率极 高 ,用药治 疗效果 不佳。为
野 生动物 C i s Ju ao Wile 00 3 6 : 2 — 2 h e r l f li 2 1 , 1() 33 36 n e o n df
幼 丹 顶 鹤 感 染 血 孢 子 虫 的 P R鉴 定 C
贾 婷 张成林 刘 贤勇 杨 明海 郝力力 罗 毅 , 勋 张金 国 阎文朝 普天春 石 团员。 夏茂华 吴秀 山 索
ห้องสมุดไป่ตู้
血 孢 子 虫 由 吸 血 蚊 虫 传 播 , 呈全 球 性 分 布 ,对 野 生 鸟类 的生 存 构 成 严 重 威 胁 。 残 疟 原 虫 属 于 顶 复 合 器
a t o i , Ha mo r tu g Ui u a n i ns g e p o e s a n l e, Ha mo r tu b la i e p o e s a e r—
关 键 词 :丹 顶 鹤 ;血 孢 子 虫 ;P R;残 疟 原 虫 C 中 图分 类 号 :¥5 8 文 献 标 识 码 :A 文 章 编 号 :10 0 2 (0 0 6— 2 0 0 0— 17 2 1 )0 3 3— 5
P CR t r n to fHa mo p rd a r st s n e tn u e i De e mi a i n o e s o i i n Pa a ie ,i f c i g J v n l e
12 基 因 组 D . NA的提 取
基 因组 D A4 N 0~10 n ,加 灭菌双 蒸水至总体 积2 。 0 g 5
在 P R仪 ( C T—Gai t i e a 中按 循 环 程 序 ( r e ,Bo t ) dn m r 表
2 )进行扩增。之后取5t C l R产物在 15 xP . %琼脂糖凝胶
本 研 究利 用 已报 道 的 1 0对 引 物 ¨ ( 1 进 行 ’ ’ 表 )
P R扩增。引物合成 由北京奥科生物公司完成。 C
1 材料 与方 法
1 1 血 孢 子 虫样 品采 集 . 20 20 0 6~ 0 8年 ,采 集感 染 血 孢 子 虫 的 幼 丹 顶 鹤 外 周 血 ,用 E T K D A— 2抗 凝 ,病 死 鹤 采 集 病 变 组 织 ,血 液 及
Vt i r dc e C i g i l rlU i r t , e i 1 0 9 C ia ) e r yMe i n , hn A r u ua n e i B r g, 0 1 3 h en a i a ct v sy n I n
A s a t i a e v nl rd—co n d ca e G u jp nn i) i B in o a i n s d b C mpict n o b t c :D s sdj e i r e u ee rw e r s( rs a o s n e s n e ig Z o w sda o e y P R a l a o f j g i f i
门 ( io pea) 、 孢 子 虫 纲 ( p rza 、 球 虫 亚 纲 Apc m lx S ooo )
( oc i ) 真 球 虫 目 ( u oc a 、 血 孢 子 虫 亚 目 C ci a 、 d E cci ) d ( am soi ) 疟 原 虫 科 ( l m dia ) 疟 原 虫 属 H e opr a 、 n Pa oi e 、 s d
pia odD A pl e s A p e i yt s n. l qG l N o m r e( p ldBo s m c )和 T y a i s e I
组织样品共计 1 7只 9 份。采集 未感染血 孢子虫丹 顶鹤 1
的外 周血 及 组 织 作 为 对 照 样 品 ,共 计 2只 7份 。所 有 样 品分 装 后 于 一 O 保 存 备 用 。 7℃
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