转基因深加工产品DNA提取方法比较

转基因深加工产品DNA提取方法比较1
张明辉，高学军*，敖金霞，秦君
东北农业大学生命科学与生物技术研究中心 210 室(150030)
E-mail：zhangminghui2001@
摘 要：转基因农产品检测主要是检测样品中转基因 DNA。纯化的 DNA 是用来进行 PCR 检 测最基本材料。成功的样品制备技术是判断随后采用的分析技术是否合理的关键。对于一般 的分析来说，好的制备技术应该是简便、安全、廉价，并且能保证 DNA 质量和数量。用于 检测分析的 DNA 应具备一定的浓度、纯度、完整性。材料和提取技术都可能对这些参数受 到影响，反过来，这些参数也可能影响分析技术是否合理。样品制备的关键步骤包括：均质、 预处理、提取、纯化以及恰当的分析方法。所用实验方法必须使分析材料达到最高产量、抑 制物最少、污染最小，根据 DNA 的特点选择最恰当、合理的样品制备方法。 关键词：深加工产品；DNA 提取
以转基因生物为直接原料的深加工品和普通深加工品一样，都要经过若干道加工程序， 理化性质发生很大变化，营养成分重新搭配并分割很细，这无疑在很大程度上增加了其中转 基因成分检测的难度。由于深度加工使原料DNA在加工过程中遭到严重破坏，加工中出现 的某些物理、化学或酶因子也会影响DNA质量，例如罐装制品在加工过程中导致DNA降解；
表 3 PCR 抑制物和可能的去除方法
抑制物来源
抑制物名称
去除方法
样品材料
蛋白质 多糖 脂肪
SDS,CTAB 或胍盐缓冲液，蛋白酶 K 去聚合酶（淀粉酶），CTAB 缓冲液和氯仿抽提
脂肪酶或正己烷处理，氯仿抽提
提取过程
酚醛塑料 盐类 酸 盐
EDTA 有机溶剂残留物
异丙醇
PVP,PVP/醋酸铵 洗涤样品材料，硅胶或 DEAE 吸附，
dna提取步骤评价步骤安全性难易程度应用ctab刺激残留物可能会对pcr反应产生抑制作用结合其它纯化步骤能够适用于成分复杂加工食品如植物材料和含多糖材料sds刺激残留物可能会对pcr反应产生抑制作用结合deae能够去除蛋白质污染刺激残留物可能会对pcr反应产生抑制作用结合ctab和氯仿使用适用于复杂加工食危险花费时间残留物可能会对pcr反应产生抑制作用氯仿危险花费时间残留物可能会对pcr反应产生抑制作用硅胶安全离心柱简单快速可提取指定片断大小的dna含有脂肪成分的食品需要脂肪酶或正己烷作用后使用异丙醇易燃花费时间残留物可能会对pcr反应产生抑制作用适用于最终的纯化和浓缩deae安全简单不会对pcr产生抑制作纯度高不能与sds缓冲液同时使用安全简单但磁珠容易造成污染根据产品介绍磁珠适用于加工食品中小dna片断的高效提取326dna提取结果合理性提取结果的阴性结果可能是假阴性阴性结果只能说明某种检测方法的结果不含有转基因dna或蛋白质但却不能说明最初样品中不含转基因成分
以上概括的预处理和纯化方法用来优化不同类型的农产品或食品的 DNA 提取。不同的 酶裂解不同的材料，一些纯化步骤也可以省略，但必须要兼顾 DNA 的质量、纯度和产量。
提取缓冲液
CTAB
CTAB±蛋白酶 K, ±SDS ±Rnase Promega Wizard
表 4 DNA 提取和纯化的操作步骤
纯化步骤－1 纯化步骤－2 纯化步骤－3
3.2.2 裂解
这一步是破坏细胞壁使DNA从细胞膜中释放出来。用SDS（十二烷基硫酸钠）表面活性 剂缓冲溶液和高浓度的EDTA溶液[11]65℃作用不少于 30 分钟，裂解细胞破坏细胞壁；蛋白 酶K、α-淀粉酶、RNAase 分别用来裂解蛋白质、淀粉、和RNA。
3.2.3 提取和纯化
裂解后，用酚和/或氯仿去除液相中的有活性的核酸酶和PCR抑制因子，如亲脂类分子、 多糖、蛋白质。尽管酚有毒，但还是经常用来进行有机分离。然而，常用的DNA提取方法 如CTAB[12]、PVP[13]和硅胶吸附。裂解步骤中，蛋白质和多糖结合CTAB和/或PVP从溶解DNA 的液相中分离出来，硅胶吸附也可用来协助DNA的提取和纯化，这些硅胶包括试剂盒提取 的产物如Wizard试剂盒 （Promega Corp., Madison, WI） Dneasy （Qiagen, Crawley, UK）。 DNA结合盐酸胍－氢氧化物离液剂中的硅胶颗粒而沉淀，沉淀用异丙醇洗涤。最后，沉淀 用低浓度盐溶液溶解[14]。其它方法（包括DEAE 的DNA吸收）概括如表 2。
1 本课题得到东北农业大学黑龙江省农业生物基因检测中心专项科研基金（黑计投（2002）1041 号）资助。
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番茄果汁制造时采用低pH,促使DNA发生化学修饰和降解；在延长新鲜食品贮藏期时，核酸 酶也可能会降解DNA;深加工品中常含有阳离子（如Ca2+，Fe2+）、微量重金属、碳水化合物、 单宁酸、酚类、盐分、亚硝酸盐等物质均能抑制PCR检测反应，这些抑制剂也常因食品种类 不同而差异很大，因此需要依据深加工品的种类和其中可能存在的PCR反应抑制剂采取不同 的DNA提取方法，以降低或消除这些抑制剂的存在，提高检测的灵敏度和准确性。由此可 见，在基于DNA扩增的转基因检测技术中，DNA提取技术尤其是深加工品中DNA提取是其 转基因检测体系建立的重要制约因素，也是后续转基因检测成功与否的关键所在。样品提取 的主要目的是：使分离的DNA具有符合特定浓度、数量和完整性的要求，为随后的分析作 准备[8]。研制适用于各种深加工转基因产品的DNA提取技术将使转基因检测技术上一个新台 阶，为检验机构特别是出入境检验机构提供极大方便，也有利于检测方法的标准化，为更多 的深加工产品市场标识提供技术保障[9]。
3.2.4 去除抑制因子
确定 DNA 提取和纯化方法时应考虑该方法在随后的分析过程中的 DNA 质量带来的影
响。提取过程中的沉淀剂、溶剂和吸附物不应该引入任何核酸酶或 PCR 抑制物，也不应引
入竞争物质或 PCR 所要扩增目的基因的同源序列。潜在的 PCR 抑制物是成分复杂的食品中
所特有的问题。表 3 列出常见的能够抑制 PCR 的抑制物，分别列出了食品类型，提取方式，
析才能去除这些物质。因此，提取过程的最后步骤应该是沉淀DNA并用乙醇洗涤去除残留 的化学试剂（如氯仿和酚）。但是，当所提取的DNA是加工食品中的降解的DNA，应该考 虑用乙醇来沉淀小分子DNA（<200bp）[15]。加入MgCl2（10mMol/L）或糖原（10µg/ml）可 以提高沉淀质量。
3.2.5 方法优化及其它
应用范围
氯仿
异丙醇沉淀 +70％乙醇
氯仿 硅胶吸附+乙醇
异丙醇沉淀 +70％乙醇
适用于植物：马铃薯叶子和组织， 大豆，番茄加工产品，玉米，小麦，
大麦 增加溶解和消化作用适用于：马铃 薯，番茄，大豆，玉米，水稻，煮
熟和罐装作物制品 广泛应用于农产品和乳制品。也可
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目前，国际上还没有统一的针对深加工转基因产品的标准化检测方法。综合各国的检测 方法，主要有两类技术：基于特异性DNA片断的PCR检测技术和基于特异性蛋白质的免疫 学检测技术（ELISA法和试纸条法）[2]。前者所采用的特异性DNA片段包括外源启动子、终 止子、报告基因和目的基因；后者特异性蛋白质主要是外源目的基因和一些报告基因所表达 的蛋白质。两种方法的出发点不同，适用的检测范围也不同，各有利弊。PCR法包括定性法 和定量法，由于该方法是建立在DNA水平上，所以即使DNA在高温高压等严峻环境下发生 降解，但仍能进行检测，所以此法适用于各种初加工和深加工品，同时PCR法可将深加工产 品中残存的DNA增幅到 100 万倍以上，检出的灵敏度大大提高。而免疫学方法不适用于经 深度加工后使蛋白质变性的产品，灵敏度较低，此法只适用于原材料的快速检测，且仍需要 PCR法进行最后的确证检验[3]。
胍盐
适合与硅胶结合使用
应用广泛
药品危险，残留酚抑制
酚
降解核酸酶和细胞
PCR 反应
氯仿
与 CTAB 结合使用
除蛋白质和脂肪
危险
硅胶
Qiagen Dneasy
不适合用于深加工产品
无毒
成本高，产生 PCR 抑制 因子
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Qiagen Qiaex Ⅱ
Wizard Nucleon
异丙醇沉淀 DEAE 磁珠
提取缓冲液+盐酸 胍+蛋白酶 K
洗涤
增加去除抑制因子的步骤
Qiagen Dneasy-Qiashredder
和去除 DNA 样品中的抑制物的提取和纯化步骤。
表 2 DNA 的提取与纯化步骤
方法
应用
优点
缺点
CTAB 裂解 纯化
适用于酚、氯仿或氯仿抽 应用广泛，CTAB 能够结
提，并用异丙醇沉淀
合多糖和蛋白质
影响 260nm 吸光值
SDS
不能与 DEAE 同时使用
提高裂解率
产生
PVP
适合与 SDS 结合使用 节省时间，DNA 质量高
程会使DNA和蛋白质降解或修饰，加工过程可能包括：加热的延长时间使得DNA性、在酸
性条件下（如醋）增加DNA的脱嘌呤和水解作用、核酸酶和蛋白酶等的修饰和降解作用。
食品中可能只是某种材料需要检测，应当将其分离出来，如：去除面包或蛋糕中的奶油以便
较少脂类污染。焙烤程度低的食品的DNA降解程度也低，反之亦然。样品制备之前也要去
混合均匀
易污染
摇动/震荡
液态材料
无污染
只适用于液 体样本
预处理
NaOH 处理
中和酸性材料
适用于豆酱，番茄酱或 果酱
正己烷处理
去除脂类使样品溶于液相中
适用于脂类，油和含有 脂肪的样本
步骤繁琐
Teramyl 处理
分解淀粉使样品溶于液相中 适用于汉淀粉的样本
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提取前用 NaOH 中和 硅胶或 DEAE 吸附，70％乙醇洗涤
DEAE 纯化 70％乙醇洗涤 干燥后重悬
SDS/CTAB/胍盐
硅胶或 DEAE 吸附，70％乙醇洗涤
一些化学方法和酶的作用可以用来去除或减少抑制物质（如蛋白、多糖、脂肪、酚醛塑料和
盐类等）的存在，操作过程中引入的 PCR 抑制物包括 CTAB、SDS 和酚，需要仔细分
制备样品之前要熟悉实验材料特性及所要采取的分析方法（如定量检测或定性检测）。 从而选择恰当的 DNA 提取方法。因此应该考虑提取方法是否适用于所要研究的深加工产品。 以下将讨论不同 DNA 提取方法的操作步骤特点。步骤概括如表 1、2，详细说明如下。
3. 方法总结
3.1 实验材料的准备
大多的深加工产品都会经过不同程度的加工处理，包括物理、化学及酶处理，这些过
除一些辅料，如：盐类、香料、糖、果酱等。对深加工产品的均质也很重要，用来进行分析
的样品必须有代表性，在成分相对均一的食品如农产品或成分单一的食品。整个样品都具有
相同的特点。成分复杂的食品，可能含有几种转基因成分，如比萨。尤其是在定量分析实验
中，均质是尤为重要的，它能保证样品的具有代表性。液态样品均质用震荡方法就可以[7]；
固态材料在提取之前也需均质，均质方法总结如表 1。尽管研磨方法很有效，但这种方法易
污染，要尽量避免使用。捣碎机方法污染小，但不能充分混合某些实验材料，如大豆，谷物
等。
表 1 DNA 提取前材料均质和预处理
步骤
方法
应用/结果
优点缺点均质捣碎机粉末状材料，蛋白粉，豆腐，豆 面酱
无污染
研磨
粒状材料如大豆，玉米，谷子
2. 深加工产品中转基因成分检测存在的问题
所以，核酸已经成为食品分析中的重要工具[4，5]，而且转基因和非转基因食品的辨别最 好能从DNA水平来证明插入基因是否存在。在分析之前必须从材料中应将DNA提取出来。 但是目前为止，DNA或RNA很少用在食品分析中，所以关于加工食品的核酸知识了解很少。 所以，尽管已知很多DNA提取方法，但仍然满足不了需要[6]。
1. 引 言
近几年，很多国家已经批准使用转基因农作物和农产品，而要获得真正安全的有足够营 养价值的食品，高质量的原材料是必不可少的条件。在欧盟，食品的来源、质量和安全性以 变得非常重要。因此，转基因食品的标识问题已经成为食品安全方面讨论的主要议题。这种 新兴的生物技术食品引起了很高的重视，由于各种压力的存在，已经有很多国家实行了对食 品中的转基因成分进行了标识[1]。同时食品厂家也需要了解原材料是否存在转基因成分。

缓冲液与酶结合使用效 果最佳
广泛适用 适合植物基因组 DNA 提
取
与氯仿结合使用
适用于胍和氯仿提取 没有应用于研究的实例
高通量、自动
盐及其它有机成分了结 合会使 DNA 损失
去除 EDTA 的抑制作用
不适合用于脂肪含量高 的材料（能够与脂肪酶结
合）
不需要 SDS 裂解缓冲液
3.2 DNA 提取和纯化的方法
制备样品之前需要了解要检测的食品的特点，分析样品的数量、提取的速度，操作步骤 都会影响提取和纯化的结果尤其是试剂盒或较传统的有机试剂的应用。
3.2.1 预处理
含有酸，脂肪，淀粉的食品的预处理有助于DNA的提取，也能提高细胞裂解的效率。 （表 1）含酸的食品需用pH7.0±1.00 的 2 Mol/L NaOH溶液[8]。含脂肪的食品不能在裂解缓 冲液中很好的溶解，需在提取之前用正己烷处理去除脂肪[9]。含淀粉的样品可以在裂解缓冲 液中膨胀，可以加L型高温淀粉酶Termamyl 65oC水浴 30 分钟[10]，使其更好的溶解在溶液中。