脂筏的结构

脂筏的结构，功能及在阿尔茨海默症，朊病毒病中的研究进展北京大学力学与工程科学系生物医学工程专业02级博士钟建学号： 10203829
摘要：脂筏是膜脂双层内含有特殊脂质和蛋白质的微区。

主要由鞘脂，胆固醇及蛋白质组成，脂筏的组分和结构特点有利于蛋白质之间相互作用和构向转化，可以参与信号转导和蛋白质转运。

病原体如病毒，细菌及其毒素等利用脂筏进入宿主细胞，利用细胞表面的GPI－锚固蛋白和筏脂作为主要的或补充的受体，因此，很多的疾病如阿尔茨海默症，朊病毒病等均有可能与脂筏功能紊乱有着密切的关系。

关键词：脂筏，信号转导，蛋白质转运，阿尔茨海默症，朊病毒病
自从1972年S. Single和G. Nicolson提出膜的流动镶嵌模型[1]以来，生物膜的研究有了飞速的发展，大量的科学家进入这一领域，推动了膜生物学的发展。

近几年来，发现大多数哺乳动物细胞质膜中具有富含胆固醇和鞘脂（鞘磷脂和鞘糖脂）的微区（microdomain），称为“脂筏（lipid raft）”[2,3]。

脂筏的组分和结构特点有利于蛋白质之间相互作用和构象转化，脂筏区主要参与信号转导和细胞蛋白转运。

脂筏曾经有过许多的名称，如糖基磷脂酰肌醇脂微区（GPI lipid microdomain），鞘糖脂富含微区(glycosphingolipid-enriched microdomain)，去垢剂不溶的糖脂富含复合物(detergent-insoluble glycolipid-enriched complexes, DIGs)，低浓度Triton不溶复合物(low-density triton-insoluble complex, LDTI)等等。

脂筏的组分和结构特点有利于蛋白质之间相互作用和构象转化，可以参与信号转导(Cellular signaling)和蛋白质转运(Protein trafficking)。

一些感染性疾病，心血管疾病，肿瘤，肌营养不良症，阿尔茨海默症，HIV，朊病毒病等可能与脂筏功能紊乱有着密切的关系[4]。

下面简要介绍一下脂筏的结构，功能以及在疾病研究中的最新进展。

1 脂筏的结构
生物膜膜脂主要分为磷脂，糖脂和固醇类，其中，磷脂根据醇成分的不同分为甘油磷脂和鞘磷脂，糖脂根据醇的成分分为甘油糖脂和鞘糖脂，固醇类主要是指胆固醇。

脂筏是膜脂双层内含有特殊脂质和蛋白质的微区。

富含鞘磷脂，鞘糖脂，胆固醇，GPI-锚固蛋白，Src-kinase等[2-6]（图1）。

脂筏不仅存在于质膜上，而且还存在于高尔基体膜(Golgi membrane)上[7]。

鞘磷脂和鞘糖脂（如神经节苷脂类）的饱和脂肪链紧密聚集，饱和脂肪链之间的空隙填满了作为间隔分子的胆固醇，形成液态有序相（liquid-ordered phase，即脂筏)，直径大约在50nm左右。

而不饱和脂肪链围绕在筏区的周围，形成非筏区，非筏区的主要成分是卵磷脂，磷脂酰乙醇胺，磷脂酰丝氨酸等，也含有胆固醇。

因为鞘脂含有长链饱和脂肪链，Tm 较高，所以脂筏区与非筏区相比，流动性差，脂肪链伸展，而且粘稠。

所以出现分相[8]。

脂筏区比非筏区高大约0.4-1nm左右。

质膜内外两层均含有脂筏，脂膜内层的脂筏除了知道需要胆固醇来维持其整体性和缺少鞘脂之外，脂筏的组成还是不清楚的。

到目前为止脂筏中唯一的一种脂膜外层和内层都已经明确的是“质膜微囊（caveolae）” [9]。

图1 含有两种蛋白质的脂筏模型[5]。

其中：液态有序相中的脂（红色），液晶相中的脂（蓝色），胆固醇（桔红色）。

胆固醇主要分布在液态有序相中，外层的脂筏主要富含鞘磷脂和鞘糖脂，对应的内层的脂筏包含有脂肪酸链更偏向于饱和的甘油脂。

GPI-锚固蛋白耦联于质膜外层的脂筏，Src-kinase耦联于质膜内层的脂筏。

Fantini, J. 等[4]提出了一个脂筏中脂组成的基本模型（图2），认为根据分子的两性特征和脂肪链的伸展性，鞘磷脂，鞘糖脂及一部分种类的甘油磷脂可以视为一个倒立的金字塔形，而胆固醇则视为一个小一点正立的金字塔形。

这样胆固醇可以作为间隔分子而与鞘磷脂，鞘糖脂和部分的甘油磷脂形成较紧密的脂质层，称为液态有序相（Liquid-ordered phase）。

其中，鞘糖脂，鞘磷脂和胆固醇形成膜外层的脂筏，而特殊的甘油磷脂则与胆固醇形成膜内层的脂筏。

而大部分种类的甘油磷脂则可以粗略的视为圆柱体形，形成液晶相(liquid-crystalline phase)。

这样，细胞膜可以视为液晶相中插入了一些液态有序相。

图2 脂筏中脂组成的基本模型[4]，其中Lc: 液晶相；Lo phase: 液态有序相；GPLs: 甘油磷脂；SM: 鞘磷脂；GSL: 鞘糖脂。

最近的荧光淬火(fluorescence quenching)研究已经表明胆固醇和鞘脂之间的紧密压缩是脂筏形成的推动力。

低相变温度的卵磷脂和鞘磷脂或者DPPC在33mol%胆固醇存在的情况下会促进脂筏的形成[10]。

高水平胆固醇抑制鞘脂或者二棕榈酰卵磷脂(DPPC)形成明确凝胶相(gel phase)和液晶相。

而形成液态有序相，脂质紧密压缩，如同有序的凝胶相；但存在快速横向扩散，如同液晶相。

模拟膜研究是理解脂筏形成的基本物理性质的钥匙。

研究者们已经在支撑单层膜[11]，支撑双层膜[12-15]，非支撑双层膜[16]和模型膜脂质体[17,3]中模拟了脂筏。

Rinia, H. A. 等[12]将二油酰卵磷脂和鞘磷脂等摩尔比，而胆固醇浓度选择从0到50mol%，制备成小单层脂质体(small unilamellar vesicles, SUV)，然后铺展在云母上，孵育，冲洗。

然后利用原子力显微镜观察，利用截面来测定观察区域的高度，利用高度的分布来量化脂筏区域的多少。

结果表明胆固醇含量低于或等于15mol%的支撑脂双层和胆固醇含量为0时的情况基本相同，只是存在有一些大的区域(500nm)。

而胆固醇含量为25mol%时显示此时脂筏的形状有规则一些，大小也增大了(1um), 脂筏区域与非脂筏区域的高度差为0.8nm，脂筏区域占有观察区域的41％。

当胆固醇含量为30mol%时显示此时的脂筏区域分散，但又彼此相连。

大小变得更大。

此时脂筏区域与非脂筏区域的高度差为0.6nm。

脂筏区域占有观察区域的58％。

当胆固醇含量为50mol%时显示此时的脂筏区域连成一片。

大小变得更大脂筏区域占有观察区域超过了50％。

此时脂筏区域与非脂筏区域的高度差为0.4nm。

表明利用原子力显微镜来观察脂筏是能够做到的。

2 脂筏的功能
脂筏的组分和结构特点有利于蛋白质之间相互作用和构象转化，可以参与信号转导和蛋白质（包括细菌和毒素）转运。

2.1 信号转导
除了鞘脂和胆固醇之外，一些专一性的蛋白能够短暂的偶联到脂筏上，或者作为脂筏的组成部分，如质膜微囊中的质膜微囊素。

含有蛋白质的脂筏能够参与信号转导过程并在其中扮演十分重要的角色。

这些蛋白质包括[2,4]（1）：通过GPI锚结合在质膜外层上的外层蛋白（如朊病毒蛋白PrP）；（2）：转膜蛋白（如IgE受体FcεRI）; （3）结合在质膜内层的Src 家族的酰化蛋白质酪氨酸激酶。

由于脂筏分散在质膜上，而且能够侧向漂移，因此脂筏能够将活化的受体和信号转换分子聚到一起，从而引起信号传导。

一些信号转导单元能够在脂筏中预组装，在CD4+ T细胞中，T细胞受体信号启动器（例如T细胞受体－CD3复合物, ck ZAP-70激酶和CD4共受体）的主要组成成分存在于脂筏中[18]。

2.2 蛋白质转运
越来越多的试验证明脂筏是蛋白质、特别是病原体进入细胞的入口。

质膜微囊内包含许多的受体蛋白，质膜微囊利用不同的途径运送这些受体蛋白进入细胞。

病原体如病毒，细菌及其毒素等将利用脂筏进入宿主细胞作为其感染策略。

利用细胞表面的GPI－锚固蛋白和筏脂作为主要的或补充的受体。

例如霍乱毒素结合GM1，志贺毒素结合中性糖脂Gb3，分支杆菌结合胆固醇，这些病原体通过与脂筏中筏脂结合，并发生构象转换，增加其与受体蛋白的亲和性。

提出了病原体进入细胞的双受体模型[4]，脂筏在病原体进入细胞中的作用有：（1）脂筏提供大量的低亲和性的受体来稳定在细胞表面的入侵者――病原体。

（2）然后脂筏通过漂移传递这些病原体至亲和性足够高的的受体上。

（3）脂筏中某些专一性的脂可能作为分子伴侣而诱导接近高亲和性受体的病原体构象转换。

这个模型符合许多病原体入侵细胞的过程，如HIV-1，破伤风毒素，肉毒杆菌毒素等等。

3 脂筏与疾病
病原体如病毒，细菌及其毒素等利用脂筏进入宿主细胞，利用细胞表面的GPI－锚固蛋白和筏脂作为主要的或补充的受体。

因此有必要研究脂筏在疾病中的作用，以便了解疾病的机理。

3.1 脂筏与阿尔茨海默症
阿尔茨海默症是一种大脑神经退行性疾病，其病理学特征有细胞外的淀粉样斑，细胞内的非正常tau蛋白螺旋丝形成的神经纤维缠结，神经元的缺失和多种神经递质系统的改变。

其中最显著的特征是细胞外大量的弥散性老年斑，淀粉样斑由多种蛋白质组成，其主要成分是Aβ，研究发现可溶性的，非毒性的Aβ转换为聚集的毒性的富含β-片层结构是阿尔茨海默症发生的关键步骤。

Aβ是由前体蛋白APP剪切而来的分子质量为4KD的多肽，一般由39－42个氨基酸组成[4]，具有两亲性，N端亲水，C端疏水。

Aβ包括Aβ40和Aβ42，其中Aβ42是APP在内质网上被蛋白酶切产生的，在反式高尔基体网络中产生Aβ40，也有人认为都是在质膜表面蛋白酶切产生的[4,7]。

APP经过两个连续的蛋白酶切过程产生Aβ的，涉及二个酶:β-分泌酶和γ-分泌酶，β-分泌酶将APP剪切为可溶的sAPPβ和C端片断CTFβ,然后CTFβ被 γ-分泌酶酶切掉形成Aβ。

因为APP，β-分泌酶和γ-分泌酶都是存在于脂筏中。

因此Aβ的产生和聚集主要发生在脂筏中。

Cordy, J. M. 等[19]为了研究脂筏在APP酶切过程中的作用，将只存在于脂筏中的GPI锚取代β-分泌酶的C端和跨膜区，结果发现，与野生型的β-分泌酶表达的SH-SY5Y细胞系相比，GPI-β-分泌酶表达的细胞系上调了sAPPβ和Aβ的分泌量。

当脂筏被胆固醇水平损耗而引起脂筏紊乱后，这种影响得已逆转。

结果也表明APP酶切为Aβ的过程主要发生在脂筏中，而且β-分泌酶是该过程的限速酶。

脂筏特别是质膜外层的脂筏容易与Aβ多肽发生相互作用，并是细胞功能紊乱和神经退化发生的原因之一[20]。

两种筏脂（胆固醇和GM1）与Aβ的结合可能促进纤维化的形成[21,22]。

Kakio, A.等[21-23]提出了Aβ与膜相互作用的模型（图3），认为首先是Aβ专一性的识别神经节苷脂簇，胆固醇的存在有利于神经节苷脂簇的形成，然后Aβ在神经节苷脂簇的帮助下，蛋白质密度增加到一定高的程度后，Aβ构象发生转换，从α-螺旋构象转换为β-片层构象，β-片层构象的Aβ作为淀粉样纤维形成的种子在与膜结合之后立刻寡聚化，同时与之竞争发生的是与膜结合的β-片层构象的Aβ作为一种膜活化的物质，转位至与可溶性Aβ没有亲和性的膜区即非脂筏区。

包含神经节苷脂簇的脂筏可能作为一个构象催化剂或者分子伴侣来辅助产生具有成熟能力的Aβ膜活化形式。

图3 Aβ与膜相互作用模型[23]，其中 SM: 鞘磷脂； PC: 卵磷脂。

3.2 脂筏与朊病毒病
朊病毒病是一种由朊病毒引起的神经退行性疾病。

包括人克雅氏综合症，羊瘙痒症和牛海绵样脑病，猫海绵状脑病等。

朊病毒本质上是具有感染性的蛋白质。

朊病毒病主要的特点是脑内朊蛋白（PrP c）的异常形式（PrP Sc）的聚集。

PrP Sc是由正常的PrP c构象转换而成，两者有同样的氨基酸序列，只是构象不同而已。

PrP c发生构象转换PrP Sc是由α螺旋转换为β片层结构。

两者相比，PrP Sc溶解度低，且抗蛋白酶K酶切。

PrP c是结合在细胞膜外层，带有GPI锚结构的糖蛋白，主要存在于脂筏中[24]，胆固醇损耗降低了PrP Sc的产生量，而鞘脂损耗增加了PrP Sc的产生量[25,26]。

发现感染性的朊病毒里存在有两种鞘脂，GalCer和鞘磷脂[27]。

所有这些证据都表明脂筏可能在PrP c构象转换中起着关键的作用。

Fantini, J. 等[4]提出了一种基于脂筏的PrP Sc繁殖的可能机制（图4）：（1）感染的朊病毒（或者是单个的PrP Sc分子，或者是富含PrP Sc的小单层脂质体）从感染细胞上脱落下来，PrP Sc插入未感染细胞的质膜。

（2）内源的PrP c和感染的PrP Sc蛋白都可能存在于一个脂筏中，脂筏彼此靠近，使得PrP c和PrP Sc紧密连接。

（3）在脂筏中发生PrP c向PrP Sc的构象转换。

(4)产生的PrP Sc继续去感染其他的PrP c，从而引起PrP Sc大量的产生。

图4 基于脂筏的PrP Sc繁殖的可能机制[4]
结语与展望
自从1997年Kai Simons[2]首次提出脂筏的概念以后,越来越多的试验证实脂筏的存在及其重要性，但是脂筏在信号转导和蛋白质转运中的功能是如何实现的，在功能实现的过程
当中组分和结构的变化又是什么样？必须要在单分子水平上对脂筏内生物分子行为（包括构象变化、相互识别、相互作用等）进行实时﹑动态检测 ，籍此深入阐明在脂筏的功能实现过程当中的构效、构性关系等变化。

因此要采用灵敏的单分子研究仪器来准确而有较为直观的研究脂筏的结构特性，形成，运动与内在化机制等。

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