性、增加组织修复将起积极作用可能...

植物金属硫蛋白2型在烟草中的表达特性
东北林业大学
硕士学位论文
植物金属硫蛋白2型在烟草中的表达特性
姓名:赵博
申请学位级别:硕士
专业:生药学
指导教师:安志刚
20070601摘要
为研究植物金属硫蛋白的功能及其特点以及在未来生产实践中的应用,本研究利用
从印度芥菜
克隆分离到的金属硫蛋白型基因,
通过载体用农杆菌介导法将基因转入模式植物烟草中进行了多项分子生
物学方面的分析和观察。

在烟草组织培养和基因转化过程中研究了不同激素组合、抗生
素筛选浓度、侵染时间及农杆菌稀释浓度等影响烟草再生及转化诸因素的作用,建立了
模式植物烟草的高效再生及转化体系。

在分子生物学方面:运用和
检测技术确定了目的基因被整合到烟草基因组中并具备表达功能。

本研究通
过
基因工程学方法首次将金属硫蛋白基因连接为双聚体,克隆到原核表达载体中在
大肠杆菌中进行诱导表达并通过氨基酸序列鉴定。

在获得大量高纯度确定的双聚体金属
硫蛋白的基础上制备了多克隆抗体,单一性识别。

为植物金属硫蛋白型在不同物种和组织问的精确鉴定和定位提供了有力的分子生物学工具。

本研究确定:在正常条件下,转基因烟草叶片组织中谷胱甘肽和叶绿素含量与野生
型没有明显差别,但经过胁迫后,两者的含量在转基因植株中均明显高于野生型;在转基因植物细胞膜系统中型酶的活性低于野生型,而.型酶的
活性则表现出明显的升高趋势;转入金属硫蛋白型基因的烟草在植物形态和根部发育
方面相对照于野生型都发生了显著的过渡性状变化。

上述研究和观察结果填补了在同一研究领域迄今为止尚处于空白或忽略的内容。

为
植物金属硫蛋白的更深一步的研究奠定了坚实可靠的前期基础。

关键词金属硫蛋白型;谷胱甘肽;.型酶;印度芥菜;烟草:型酶;,
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.Ⅱ.独创性声明
本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研
究成果。

据我所知,除了文中特别加以标注和致谢的地方外,论文中不包含其他
人已经发表或撰写过的研究成果,也不包含为获得盔韭垫些盘鲎或其他教育
机构的学位或证书而使用过的材料。

与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡
献均己在论文中作了明确的说明并表示谢意。

签字日期:司年月日
学位论文作者签名:
楚荡
学位论文版权使用授权书
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本学位论文作者完全了解壅韭盎些盘鲎
定,有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘,允许论文被查
阅和借阅。

本人授权查韭盐些盘堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有
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保密的学位论文在解密后适用本授权书
瞎忑刚
导师签名:
学位论文作者签名:赵博
签字日期:
签字日期: 刁年月/日司年月沙目
≠位论文作者毕业后去向:
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工作单位:
邮编:
通讯地址:绪论
绪论
.课题背景
金属硫蛋白是一类在生命体中广泛存在的富含半胱氨酸的低分子量蛋白
质,具备在体内螯合重金属和清除自由基的功能卜。

由于金属硫蛋白功能的多样性,
对其的研究一直是生物学领域内的一个研究热点。

植物金属硫蛋白研究相对较晚。

小麦的蛋白是第一个被分离到的植物金属硫蛋
白【,以后在拟南芥中陆续发现的不同等位基因,在对分子量和半胱氨酸残基的
分布序列的研究对比基础上,从豌豆、水稻、番茄和玉米等多种植物中也分离了许多
类似基因。

上述基因的功能研究上目前已取得许多重要的研究结果【~。

由于具有
结合金属离子如十,,等的能力,金属硫蛋白被认为在解除重金属离子
的毒害、维持组织中金属离子的稳定以及调节金属离子向特定组织的运输等方面起到重
要作用¨】。

另外,金属硫蛋白在植物生长发育过程中表现出的程序表达和组织特异性被
认为是受到生长和组织分化的调控刖。

虽然目前对植物基因的表达特征、组织
器官特异性及其基因组的结构,如启动子、内含子在染色体上的定位等有了一定的了解
慨?,但对其功能的研究仍然处于起步状态。

在水平上对于植物与重金属和氧胁迫相关的分析表明:金属硫
蛋白型广泛存在于不同的植物品系,其基因的表达受到环境因子的影响【。

研究证
明,拟南芥基因的表达与铜胁迫相关并具有铜亲和性的特点】。

植物与抗
逆反应、胚胎发育、果实成熟、衰老等过程有关,并在不同情况下通过不同的机制发挥
清除自由基及抗氧化作用,增强细胞活性瑚。

在植物和哺乳动物减缓重金属胁迫
过程中的抗逆作用和组织细胞损伤修复过程中具有显著功削坞”。

谷胱甘肽在植物体内具有和金属硫蛋白类似的抗重金属和氧胁迫的功能。

由于功能的相似性,目前本研究领域对两者在特异性方面的研究已作了大量的
工作瞄’。

然而,对于转基因烟草中的变化以及在受到铜胁迫时的应答关
系目前尚无报道。

本研究对功能相似的异源基因的表达与内源的合成作了比较分析。

对于转基因植物在形态学上的差异在拟南芥中有过报道】,但在烟草根系和形态学上的变化目前尚没有详细的论述。

另外,本研究对转基因烟草中和型酶的活性变化作了实验观察。

本论文就上述目前尚未涉及的研究内容,基于实验结果,对转基因烟草中包含的部分研究结果进行阐述。

东北转业大学颤士学位论文
..金属硫蛋白定义
典型的具有如下特点:
低分子量,一般只有~个氨基酸残基。

高金属含量,一般每分子含有~个金属离子,且由金属配位键结合。

独特的氨基酸组成和排列顺序,其中半觥氨酸含量可高达~%,而且不含芳香族氨基酸和组氨酸,没有二硫键:同时有大量及.?.表示除
了半胱氨酸以外的其它氨基酸残基序列的存在。

存在着独特金属硫四面体的络合结构,故具有特征吸收光谱,如在
附近有吸收峰,.在附近有吸收峰。

具有两个金属一簇状结构,即两个结构域。

..金属硫蛋白的结构
金属硫蛋白所具有的多种功能是由其特殊的氨基酸组成及其空间结构所决定的。

现
已经得到的动物金属硫蛋白的晶体结构分析表明,三级结构以两个结构域为特征,即氨基端的~个残基形成结构域,羧基端的~残基形
成结构域,两个结构域相对独立并呈球状,中间通过第,和位氨基酸残基连接使整个分子呈哑铃型如图.。

其结构域含有个,可螯合个/
或个,.结构域含有个,可螯合个/丑或
~个。

体外金属离子重组实验表明,和首先与结构域
结合,然后才与结构域结合,而则正好相反。

金属离子与结合时呈
现协同效应,即一个金属离子的结合可促进后续离子的结合。

因此,金属离子与各
结构域间的结合总是全部结合。

金属离子与所有的巯基结合,因此,天然的分子不含二硫键,也没有自由的巯基存在,在每个区每个二价金属离子与个巯基配位
结合可形成非典型的四面体结构。

但并不是所有的都具有和两个结构域,在低
等动物如甲壳类的蟹中,仅具有个结构域,而结构域则出现于较高等的动物
中。

果蝇是动物基因家族唯一与其他成员没有同源性的例子,只有~个结构域。

某些真核微生物中的也只含有单一的与金属结合的结构域。

绪论
.哺乳动物三维结构模型:.利用计算机软件所推测的植物金属硫蛋白型的三维结构模
型,由于肽链中半胱氪酸的分布类似于典型的金属硫蛋白,其两者的三维结构极具相似性
.
:.
图?空间结构模型
.?
..植物金属硫蛋白
...植物金属硫蛋白的分类
参照已有的的分类方法,根据推测的植物蛋白中残基的位置及排列方
卅。

式,植物多数被称为类【】,但习惯上也称为植物
:由个表示另外一种氨基酸基团平均分布于两个结构域中,
两个结构域中间被个氨基酸间隔,其中包括芳香族氨基酸。

来自于各种十字花科植物的具有很多特点,比如两结构域间距离较短,并有额外的半胱氨
酸残基。

】
:由两个富含半胱氨酸的结构域组成,中间由个氨基酸残基分开,但是第一对半胱氨酸以.基团位于氨基酸序列的第三到第四个氨基酸之间,一个
末
基团出现于末端的半胱氨酸富集区。

整体上看,
端具有高度保守的序列,末端含有三个.基团。

比较来讲,在不同植物种类之间中间区域的变化较大。

:蛋白末端含有四个半胱氨酸,前三个排布为.,第四
个不是以成对的半胱氨酸出现,而是高度保守序列...中
的一部分,末端半胱氨酸以.基团出现,与和相似,
两个结构域之问以近个氨基酸分隔开。

:
具有三个半胱氨酸富集区,每个区有~个半胱氨酸,之间由~个氨基
酸连接,大多数半胱氨酸以基团出现,尽管还有大量的没有被证实,与那些单子叶植物相比,来自双子叶植物的.在末端第一个半
胱氨酸之前多出~个氨基科。

与植物螫合素结构相似。

..植物金属硫蛋白的结构
植物金属硫蛋白发现较晚,虽然从小麦胚芽中纯化出蛋兰
,从拟南芥中纯化出金属硫蛋白、和等蛋白,但是还没有得到植物金属
硫蛋白的晶体,所以只能对其可能的金属结合模型进行推测。

有关植物金属硫蛋白的高
级结构,,等人【”将豌豆的金属硫蛋白基因在大肠杆菌中表达后,在没有提纯到完
整的的情况下,认为其较长的间隔序列会帮助高度保守的半胱氨酸富含区,区在空间上互相靠近,通过金属离子维系在一起后间隔区被降解,于是
提出了植物金属硫蛋白的端和端依靠巯基金属键维系在一起的金属离子结
构模
型,认为植物金属硫蛋白两端富含的区域在中间区的作用下相互接近,和金属离子
结合形成一个结构域。

计算机对
的金属硫蛋白的结构分析,得到两个
富含的区域由于中间区的折叠而相互靠近的模型如图所示
图植物金属硫蛋白半胱氨酸的分布结构特点
.注:阴影部分为保守的残基
..植物金属硫蛋白主要功能
植物金属硫蛋白在自由基清除中的作用
年,和发现金属硫蛋白有较强的清除自由基尤其是清除?
的作用。

目前关于金属硫蛋白清除自由基的机制有如下看法:等提出,金
属硫蛋白清除自由基功能主要与.有关,金属硫蛋白中的半胱氨酸残基上的?均处
于还原状态,在与?反应过程中,.被氧化成一...十?一?
,并将金属离子释放使?还原降解。

有学者认为,金属硫蛋白中的可通
过抑制摄入,抑制细胞色素还原酶和增加活性而起抗氧化作用。

?
等认为金属硫蛋白释放所结合的金属离子,然后再与等金属离子结合,使这些金属离子不易参与特定反应,从而阻断生成?。

等认为金属硫绪论
蛋白可以提供一个氢原子给邻近受自由基损伤成分,以使其恢复到未损伤状态。

为
百余种酶所必需,也是维持活性所必需,金属硫蛋白释放的对增强细胞活
性、增加组织修复将起积极作用,可能在不同情况下金属硫蛋白通过不同的机制发挥清。

除自由基及抗氧化作用【。

植物金属硫蛋白清除重金属的作用
重金属解毒的一个基本依据是具有很强的金属结合特性。

研究证明能
与多种金属离子结合,如、、矿和等。

不同植物类型的与金属离子
处
的亲和力不同,等将水稻悬浮培养细胞经各种金属处理后,发现经
理
后的水平升高,而的、、、”和
的舢”处理对的的水平没有明显的影响【】。

拟南芥中的对铜敏感,而
不受铬元素与锌元素的诱导,动物体内的与重金属、、的亲和力大小
处理后,的表达量升高,舭的
为:。

拟南芥幼苗经
变化不大,仅在处理的第天有轻微的升高。

原位杂交显示,诱导
在韧皮部维管束的表达,诱导在子叶中表达。

由于,在叶毛状体中
的表达量很高,经处理后毛状体中的表达量观察不到明显的变化,,在
根中的表达不受的影响。

.等”对油菜衰老
叶片中的分析也表明,有两种基因在衰老叶片中大量表达,认为可能
对金属离子具有解毒和运输的作用。

参与基因的表达调控
】在大肠杆菌中进行了拟南芥的表达,发现具有结合的
能力。

认为在植物中可能同样具有结合的能力,通过与其它蛋白竞争植物组织内的而调节依赖型蛋白,如依赖的聚合酶、聚合酶、转录因
子等的活性,进而在基因的表达调控中起作用。

和对面包小麦
基因的研究发现,其在花粉胚发育过程中特异性地表达,且与的增加呈正相关,用合成抑制剂处理后,不仅抑制了的积累,而且基因
的表达也受到抑制,同时使小孢子失去了形成胚状体的能力,添加外源后
基因的表达恢复正常,花粉胚又开始发育。

以上结果表明:胚胎发生过程中必需有持续
的合成和基因的表达,认为受调控的基因可能至少部分介导了
小麦花粉胚的形成,在胚胎发生过程中可能参与结合,或通过夺取依赖
的、聚合酶及锌指蛋白中的,从而调控相关基因的表达。

.。

植物对重金属的解毒
植物适应重金属元素胁迫的机制包括阻止和控制重金属的吸收、体内螯合解毒、体
内区室化分隔以及代谢平衡等。

菌根、根系分泌物以及细胞膜是控制重金属进入
植物根系细胞的主要生理单元。

外生菌根能显著提高寄主植物的重金属耐性,根系分泌
物通过改变根际、改变金属物质的氧化还原状态和形成络合物等机理减少植物对重东北林业大学硕上学位论文
金属的吸收。

目前,控制菌根和根系分泌物重金属抗性的分子机理还不清楚。

但细胞膜
跨膜转运器已得到深入研究,相关金属离子转运器被鉴定和分离,一些控制基因如铁锌
类
控制运转相关蛋白类、自然抵抗相关巨噬细胞蛋白类、.
基因已被发现和克隆。

金属硫蛋白、植物螫合素、有机酸及氨基酸等是植物体内主要的螯合物质,它们通过螯合作用固定金属离子,降低其生物毒性或改变其移动
性。

与合成相关的基因已经被克隆,合成必需的植物螯合素合酶
,即.二肽转肽酶.自编码基已经被克隆。

细胞膜
重金属进入植物根系细胞必需跨过根系细胞的细胞膜,细胞膜的吸收或抑制吸收成为
植物适应重金属胁迫的重要机制之一。

近年来,利用分子生物学手段研究植物细胞膜吸
收金属离子已取得了显著的进展,相关金属离子转运器陆续被鉴定分离。

.
是一种通过水解进行跨膜运输的运转蛋白,根据其底物特异性
是与多种重金属离子如“、、和知”等
可以分为类,其中
,。

几种
跨膜运输有关的运转器,它也被称作重金属酶
不同的基因最近相继被报道,其中拟南芥中克隆的是”和的高亲
合转运体,被证明是植物向体外排出的控制单元之一【。

与的体内平衡
以及耐性有关,同时它通过向胞外主动排出过量的重金属离子提高
、和的耐性。

研究表明其结合和运输重金属离子的能力与末端的氨基酸
残基和末端的氨基酸延长结构有关。

谷胱甘肽
许多金属离子是植物必需的微量养分,它们参与植物体内众多的生理代谢过程。

如
果含量过高,尤其是具有氧化还原活性的金属,会对植物产生毒害作用,这种毒害作用
很可能是由于自由基的形成造成的。

含巯基,具有很强的氧化还原特性,可有效地
清除活性氧等自由基,因此在植物抗逆境胁迫中起重要作用。

为三肽,结构通式为?,合成主要通过两步依赖于的反应完成,丫合成酶和
合成酶是其中的关键酶。

合成酶由编码,合成酶由编码,与
在拟南芥基因组中均以单拷贝的形式存在。

正常条件下,的合成依赖于半胱氨酸的活性,同时存在明显的反馈抑制现象, 表明由合成酶催化的反应是整个合成的限速步骤。

重金属胁迫条件下,重金属离
子激活植物螯合素的合成,消除了的反馈抑制作用,由合成酶催化的反应也成为限速步骤,此时如果加强的表达,则既可增加植物螯合素的合成又能避免
的耗竭,从而缓解重金属胁迫。

植物螫合索
植物对重金属胁迫的重要适应机制之一是产生植物螯合素。

植物螯合素是一系列通
过谷胱甘肽,生物合成的具有,多为~
结构的多肽‘“。

植物螯合素在很多高等植物以及真菌、藻类中都有发现。

在植物中,绪论
还存在以其它氨基酸为.末端的分子,包括似一砧,...
和似.等形【。

在植物重金属耐性中的作用如抗性、重金属解毒
以及维持体内金属离子平衡等已经有较为详尽的报道【,】
金属硫蛋白
金属硫蛋白能够通过巯基与金属离子结合,从而降低重金属离子的毒性,它对于
和的解毒效果尤为明显。

等证实诱导拟南芥表达,而且表
达强度与不同基因型抗胁迫的能力密切相关;等【】的研究结果也证实的耐性植物
耐胁迫的特性与的表达紧密联系。

王剑虹等【在重金
属耐性植物紫羊茅草
中克隆到的全长,此基因编码个氨
基酸,含有个残基。

在端和端分别含有个结构,将此基
因转入到酵母基因缺失突变株中发现,的表达增加了酵母细胞对、和
的抗性。

在拟南芥和蚕豆中,主要在毛状体中表达,而等许多有毒重金
属离子也在毛状体中累积,暗示和重金属累积有某种联系。

.植物基因工程的研究方法
基因工程是人们利用掌握的相关基因知识和技术,按照人类的设计进行生物改良,
利用转基因、定向突变等方法,培育抗逆、高产、优质、高效等特殊用途的生物新品种
的一项技术。

年,等首次用限制性内切酶实现了病毒和噬
菌体的重组,成为了实现重组的第一人。

年,等人通过
体外重组,实现了细菌阃性状的转移,因此成为基因工程的创始人。

随着基因工
程技术的不断成熟,它逐步走向了实际生产,尤其是给农业和林业生产带来了曙光。

年代末、年代初,人们发现根癌土壤农杆菌
在侵染植物后
能将其质粒上的一段插入到被侵染细胞的基因组,并能遗传给后代。

这
一发现,开拓了植物遗传转化技术的新阶段。

年首先报导了外源基因在植物体的遗传,年,又首创了叶盘法转化烟草,获得了转基因烟草,这些研究进展标
志着植物基因工程技术的不断成熟。

植物基因工程包含许多重要的技术环节:植物基因的分离、基因工程载体的组建、
细胞的基因转化、转化细胞的组织培养和植株再生、外源基因表达的检测等方面郴】。

其
中制约其发展应用的两大因素是植株再生系统的建立和基因转化方法。

.。

植物转基因技术
目前用于遗传转化的方法和技术很多,归纳起来主要有两大类:一类是利用自然界
原有的土壤农杆菌转化系统,以质粒或确质粒为载体,通过农杆菌将目的基因导入
植物细胞,统称为农杆菌介导法:另一类是通过人工的方法物理或化学法将目的基因
送入植物细胞,称为直接导入法主要包括化学物质诱导法、电穿孔法、脂质体法、微
注射法、基因枪法和花粉管通道法等’。

...农杆菌介导法农杆菌介导的遗传转化是外源进入植物细胞最成功和应用最为广泛的方法,
为有效将具有特殊性状的基因引入有价值的植物提供了机会,展示了广阔的应用前景。

农杆菌属细菌是一种天然的基因转化系统,有个种;发根农杆菌
、根癌农杆菌似和葡萄农杆菌叫.,
均为革兰氏阴性菌。

农杆菌是天然的遗传工程师,在改良植物的遗传性状方面发挥着重
要作用。

用于遗传转化的农杆菌有根癌农杆菌和发根农杆菌两种即,根癌农杆菌携带的
根癌农杆菌质粒可诱发植物产生冠瘿瘤,因而称之为质粒
;发根农杆菌携带发根农杆菌质粒可浸染植物产生毛状根瘤
,故称之为硒质粒
~。

在质粒和融质粒中除了复
制起始位点外,有最重要的两个区是区和区。

.区上的可整合
进植物基因组中,而且侵染植物后,使植物产生~种正常植物不能合成的特殊氨基酸~
冠瘘碱,而区是的反式作用因子,与的加工与转移有关。

咐是
通过区反式作用迸入宿主细胞内整合表达而起作用的。

由于能够进行高频率转移,而且质粒上可插入大到的外源,因此可以利用这种天然的遗传转化体系,以质粒为载体将外源转移到植物细胞,并利用植物细胞的全能
性,经过细胞或组织培养,由一个转化细胞再生成完整的转基因植物。

利用农杆菌转移外源基因的过程一般是:将目的基因导入中间载体。

将带有目的基因的中间载体导入农杆菌。

利用上述菌液感染寄主受体植物细胞。

诱导
筛选检测再生植株。

农杆菌介导的转化方法属于一种纯生物学方法,其精巧的转基因系统使其与其它理
化方法相比,具有明显优点:转化频率高链在转移过程中受蛋白质,
的保护及定向作用,使得免受核酸酶的降解,而完整地进入细胞核,转
化率较高。

导入植物细胞的片段确切,且能导入大片段的,质粒上位于两个边界序列间的外源基因均会转移到植物细胞,可避免其它理化方法那样将非目的基因片
段导入植物细胞而造成潜在的遗传物质扩散的危险。

导入基因拷贝数低,表达效果
好,而大量拷贝数会导致基因沉默。

在用农杆菌介导进行基因转移时发现植物的基因型、外植体的年龄和来源,转化时
农杆菌液的浓度、浸染时间、共培养的时间都会对转化频率产生较大影响咒?。

...直接导入法
虽然农杆菌导入法在植物转化中被广泛应用,但该方法也具有一定的局限性。

首先
是宿主范围的限制,一些植物种类不能被感染。

另外,能够被农杆菌感染的细胞不一定
是能够再生的细胞。

为了克服农杆菌介导法的局限性,八十年代以来,相继建立和发展
了一些不依赖农杆菌的遗传转化技术,包括:基因枪法、法、电击法、脂质体法、
微注射法、激光微束法、花粉管通道法、超声波法、碳化硅纤维法、病毒介导法等脚~。

绪论
..转化植株的筛选及检测方法
转基因植物的检测是植物基因工程中重要的环节,在植物基因工程技术的发展中起。