高铜日粮对肉鸡肝抗氧化功能和肝细胞凋亡的影响

高铜日粮对肉鸡肝抗氧化功能和肝细胞凋亡的影响
任常宝;胡锴;颜诚;苏荣胜;郭剑英;潘家强;唐兆新
【摘要】选用200只1日龄健康商品代AA肉鸡,随机分成4组,使用硫酸铜作为铜源,饲喂玉米一豆粕型基础日粮,对照组饲料铜含量为11mg/kg,3个高铜试验组饲料铜含量分别为110、330和550mg/kg,试验至50日龄结束,探讨高铜日粮对肉鸡肝抗氧化功能和肝细胞凋亡的影响.结果显示,3个高铜试验组超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性先呈代偿性升高,后表现降低,丙二醛(MDA)表现为代偿性升高.随着饲养周期的延长和日粮铜含量的增加,高铜组肉鸡肝细胞凋亡率升高并逐渐出现比较明显的DNA断裂条带.结果表明,日粮铜含量为330 mg/kg及其以上可引起肝脏抗氧化功能受损,肝细胞凋亡率升高.%200 one-day-old commercial generation A A broilers were randomly divided into four groups. In addition to the control groupCCu 11 mg/kg),three experimental groups were set up,they were groups of 110,330 and 550 mg/kg respectively. All of the experimental broilers were fed with corn-soybean meal for 50 days, and effect of high-copper diets on liver antioxidant function and liver cell apoptosis of broilers were assayed. The results showed that 3 high copper group of SOD and GSH-Px increased compensatorily, consequently, a performance of decline) and MDA compensatory increased. With time prolonging and the content of copper increasing, liver cell apoptosis rate rise and DNA fracture strip obviously appeared. It showed that daily ration of copper content 330 mg/kg or more could cause liver antioxidant function was impaired, liver cell apoptosis rate increased.
【期刊名称】《中国畜牧兽医》
【年(卷),期】2011(038)011
【总页数】5页(P18-22)
【关键词】高铜;肉鸡;肝脏;抗氧化;细胞凋亡
【作者】任常宝;胡锴;颜诚;苏荣胜;郭剑英;潘家强;唐兆新
【作者单位】华南农业大学兽医学院,广东广州510642;华南农业大学兽医学院,广
东广州510642;华南农业大学兽医学院,广东广州510642;华南农业大学兽医学院,
广东广州510642;华南农业大学兽医学院,广东广州510642;华南农业大学兽医学院,广东广州510642;华南农业大学兽医学院,广东广州510642;广东省兽用生物制
品技术研究与应用企业重点实验室,广东新兴527400
【正文语种】中文
【中图分类】S816
细胞凋亡（apoptosis）是指生物机体为了维持内环境稳定，通过自身基因调控，使生理上不需要的细胞进行自动有序消亡的过程，是不同于细胞坏死的细胞死亡方式（Hansson等，1996；Kerr等，1972）。

铜是动物必需的微量元素之一。

自1945年Braude首次发现生长猪饲料中添加250mg／kg铜能显著提高其生产性
能后，日粮中高铜的添加一直是研究热点，但这些研究主要限于高铜的促生长作用。

目前高铜对动物肝抗氧化功能的影响及肝氧化状态与细胞凋亡关系的报道较少。

本试验选用1日龄商品代AA肉鸡为研究对象，喂以梯度剂量的高铜日粮，观察高铜日粮对肝抗氧化功能和肝细胞凋亡的影响，为研究高铜对机体健康影响的机理提供
基础性研究资料。

1 材料与方法
1.1 试验动物及分组 200只1日龄商品代AA肉鸡（购于某种鸡场，常规免疫，
自由采食和饮水，24h光照），随机分为4组，每组50只，雌雄各半。

选用硫酸铜为试验铜源，肉鸡基础日粮根据NRC（1994）家禽营养需要配制玉米―豆饼型
基础日粮。

基础日粮对照组（Ⅰ组）铜含量为Feedstuff推荐的11mg／kg，高
铜试验组（Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组）为此标准的10倍、30倍和50倍，即110、330和550mg／kg。

精确计算称量所需硫酸铜的量，然后与适量玉米粉混匀，配制各试
验日粮，不同日粮相同条件下饲养50d，并于第10、20、30、40和50日龄分别取样5次进行相关试验。

用戊巴比妥（50mg／kg）麻醉鸡后，快速取出肝脏组织，吸取粘附血液。

1.2 肝抗氧化指标的检测准确称量1g肝脏放入烧杯，取预冷的0.9%生理盐水
9mL于烧杯中，用眼科小剪尽快将组织剪碎，再将其倒入玻璃匀浆管中，用电动
匀浆机上下研磨，将肝脏组织磨成组织匀浆，并入离心管内，整个过程在冰水中进行。

用低温高速冰冻离心机以1000r／min离心10min，吸取上清液用于检测超
氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH－Px）活性和丙二醛（MDA）含量。

试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。

1.3 肝细胞凋亡的检测
1.3.1 DNA Ladder法 DNA提取按下面步骤操作：取冰冻的鸡肝脏0.1g，尽量剪碎，置于玻璃匀浆器中，加入1mL细胞裂解缓冲液匀浆至不见组织块，然后加入RNAse至终浓度为20μg／mL，转入1.5mL离心管中，加入蛋白酶 K（20mg／mL）5 μL，混匀。

在65℃恒温水浴锅中水浴30min，于台式离心机以12000r／min离心5min，取上清液至另一离心管中；加2倍体积异丙醇，倒转混匀后，可以看见丝状物，用100μL吸头挑出，凉干，用200μL TE重新溶解；加等量的酚∶
氯仿∶异戊醇（25∶24∶1），振荡混匀，12000r／min离心5min；取上层溶液至另一管，加入等体积的氯仿∶异戊醇（24∶1），振荡混匀，12000r／min离心5min；取上层溶液至另一管，加入1／2体积的7.5mol／L乙酸氨和2倍体积的
无水乙醇，混匀后室温沉淀2min，12000 r／min离心10min；倒掉上清液，将离心管倒置于吸水纸上，将附于管壁的残余液滴除掉；用1mL 70%乙醇洗涤沉淀物1次，12000r／min离心5min；倒掉上清液，将离心管倒置于吸水纸上，将
附于管壁的残余液滴除掉，室温干燥。

加200μL TE重新溶解沉淀物，然后置于4℃或－20℃保存备用。

结果通过琼脂糖凝胶电泳观察。

1.3.2 dUTP缺口末端标记法（TUNEL法）按照南京凯基生物科技发展有限公司TUNEL试剂盒说明书操作。

取肝脏1～2块，10%福尔马林固定，石蜡包埋切片，然后按下列步骤操作：石蜡切片常规脱蜡，再水化；PBS漂洗3×5min后加入蛋
白酶K工作液，37℃消化30min；PBS漂洗3×5min，加入H2O2―甲醇液室温
封闭10min；PBS漂洗3×5min，加入TUNEL反应液，加盖玻片于37℃湿润避
光反应60 min；PBS漂洗3×5min，加入Streptavidin－HRP工作液，加盖玻片于37℃避光湿润反应60min；PBS漂洗3×5min，加入DAB工作液置室温
10min进行显色；PBS漂洗3×5min后复染，封片，镜检。

光镜观察及凋亡细胞计数：在光镜下以高倍镜视野下随机选取5个视野，计数凋
亡细胞数和细胞总数，胞核中有棕褐色颗粒的为凋亡细胞。

结果取平均数，计算凋亡细胞百分率（apoptotic index，AI）。

1.4 数据处理应用SPSS统计分析软件计算各组平均值和标准误，结果以平均值±标准误表示，采用Ducans新复极差检验法（DMRT法）比较各组间的差异。

2 结果与分析
2.1 肉鸡肝脏组织SOD活性的变化由表1可知，10日龄时，各组间SOD活性差
异不显著（P＞0.05）；20日龄时，各组SOD活性均有所上升，其中Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组显著高于Ⅳ组（P＜0.05）；30日龄开始，Ⅱ组肝脏组织SOD活性显著高于其他3个组（P＜0.05），Ⅲ组、Ⅳ组与Ⅰ组相比SOD活性较低，两组与Ⅰ组出现显著差异（P＜0.05），Ⅲ组与Ⅳ组之间差异不显著（P＞0.05）。

表1 肝脏组织SOD活性（n＝5，U／mg）注：同列数据肩标相同字母表示差异不显著（P＞0.05），肩标不同字母表示差异显著（P＜0.05）。

下同。

组别 10日龄 20日龄 30日龄 40日龄 50日龄Ⅰ组10.57±0.79a 11.71±1.12a
12.53±1.21a 11.68±1.03a 11.23±0.72aⅡ组11.21±0.89a 12.87±0.78a
15.11±1.03b 13.94±0.95b 13.41±0.91bⅢ组10.14±0.94a 11.06±1.07a 10.25±0.83c 9.12±1.22c 7.68±1.09cⅣ组8.71±0.87a 9.47±1.19b 8.76±1.11c 8.27±1.13c 6.95±0.83c
2.2 肉鸡肝脏组织MDA含量的变化由表2可知，肝脏组织MDA含量变化与日粮铜添加水平呈正相关，随着随着饲养日龄的延长和日粮中铜含量的升高，MDA出现不同程度的增加。

10日龄时，Ⅱ组与Ⅰ组差异不显著（P＞0.05），Ⅲ、Ⅳ组显著高于Ⅰ组（P＜0.05），20、30和40日龄时，各高铜试验组均显著高于Ⅰ组（P＜0.05），其中Ⅳ组显著高于Ⅱ、Ⅲ组（P＜0.05），至50日龄试验结束时，Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组肝脏组织 MDA含量均显著高于Ⅰ组（P＜0.05），其中Ⅳ组MDA 含量最高，其次为Ⅲ组，3个高铜试验组间均差异显著（P＜0.05）。

表2 肝脏组织 MDA含量（n＝5，U／mg）组别 10日龄 20日龄 30日龄 40日龄 50日龄Ⅰ组0.55±0.19a 0.58±0.36a 0.66±0.43a 0.81±0.37a 0.89±0.47aⅡ组0.71±0.24a 0.98±0.44b 1.03±0.69b 1.09±0.22b 1.02±0.29bⅢ组
0.96±0.22b 1.22±0.53b 1.33±0.39b 1.41±0.49b 1.59±0.71cⅣ组1.17±0.39b
1.47±0.67c 1.58±0.51c 1.78±0.69c 1.96±0.83d
2.3 肉鸡肝脏组织GSH－Px活性的变化由表3可知，Ⅱ组肝脏组织GSH－Px活
性逐渐增强，20日龄后，显著高于其他各组（P＜0.05）；30日龄后，Ⅲ组、Ⅳ
组GSH－Px活性降低，与Ⅰ组相比差异显著（P＜0.05），Ⅲ组与Ⅳ组之间差异
不显著（P＞0.05）。

表3 肝脏组织GSH－Px活性（n＝5，U／mg）组别 10日龄 20日龄 30日龄 40日龄 50日龄Ⅰ组23.47±0.73a 25.62±0.72a 26.53±1.11a 25.68±0.92a
28.23±0.86aⅡ组25.31±1.09a 28.87±0.68b 29.72±0.93b 31.92±0.85b
34.54±0.61bⅢ组24.24±0.84a 26.46±0.97a 23.25±0.86c 20.62±1.03c
18.98±1.19cⅣ组25.61±0.97a 24.87±1.09a 21.79±1.02c 19.27±1.15c
16.95±1.23c
2.4 高铜对肉鸡肝细胞DNA断裂的影响DNA断裂是细胞凋亡的最晚期生化特征。

正常活细胞基因组条带由于分子质量大，迁移距离短，所以停留在加样孔附近。

坏死细胞由于其DNA的不规则降解显现一条连续的膜状条带；而只有发生凋亡的细胞才会出现梯状条带。

试验样品DNA Ladder法琼脂糖凝胶检测结果显示，饲养
周期为10、20d时，对照组与各试验组均未见明显的变化（图1、2），随着饲养周期的延长和日粮中铜含量的增加，逐渐出现明显的梯度裂解的特征（图3、4、5）。

图1 DNA Ladder法结果（10d）注：M，DL2000DNA Marker；1，Ⅰ组；2，Ⅱ组；3，Ⅲ组；4，Ⅳ组。

下同。

图2 DNA Ladder法结果（20d）
2.5 高铜对肉鸡肝细胞凋亡指数的影响TUNEL染色后，正常肝细胞核为圆形或椭
圆形，被染成蓝色（图6A）；各试验组肝脏均出现数量不等的细胞核被染成黄褐色的凋亡细胞，凋亡细胞的体积缩小，致密染色质凝集并断裂成核碎片，形成由完整细胞膜包裹的凋亡小体（图6B、C、D）。

高铜Ⅱ组肝细胞凋亡指数与对照Ⅰ组差异不显著（P＞0.05）；高铜Ⅲ、Ⅳ组与对照组差异显著（P＜0.05），各高铜
试验组相比，细胞凋亡指数Ⅳ组＞Ⅲ组＞Ⅱ组，且差异均显著（P＜0.05）（表4）。

图3 DNA Ladder法结果（30d）
图4 DNA Ladder法结果（40d）
图5 DNA Ladder法结果（50d）
图6 TUNEL法检测肝细胞凋亡（400×）注：A，Ⅰ组；B，Ⅱ组；C，Ⅲ组；D，Ⅳ组。

表4 肝细胞凋亡指数比较组别凋亡指数（%）Ⅰ组1.72±0.25aⅡ组
1.91±0.46aⅢ组3.28±0.38bⅣ组4.67±0.52c
3 讨论
3.1 高铜对肉鸡肝脏SOD活性的影响 SOD是机体内主要的自由基清除酶（Douglas等，2005），能有效清除生物氧化产生的超氧阴离子自由基，并能终止自由基连锁反应，保护细胞免受损伤。

机体内主要有3种SOD，一种是以铜离
子和锌离子为活性中心，存在于胞浆中的CuZn－SOD，一种是以锰离子为活性中心存在于线粒体中的Mn－SOD，还有一种是以铁离子为活性中心的Fe－SOD。

3种SOD的功能相同，都可催化歧化反应。

本试验发现，不同浓度高铜日粮饲养
肉鸡，SOD活性呈先升高后下降的趋势，这可能与Cu是CuZn－SOD辅基有关。

在一定的生理范围内，铜的浓度越高，SOD活性越强，如日粮含铜量为110mg／kg时。

超过生理范围达到中毒程度时，即使Cu很高，SOD活性依然降低，如日粮铜含量为330mg／kg及以上时。

CuZn－SOD可以清除体内的O2－，避免发生细胞凋亡。

当铜过量时，会导致CuZn－SOD清除自由基能力下降，表现为肝
细胞凋亡率升高，这与TUNEL法的结果是一致的。

3.2 高铜对肉鸡肝脏 MDA含量的影响 MDA是脂质过氧化降解的主要产物，反映了体内脂质过氧化的氧化程度及细胞受自由基攻击的程度（李成梅等，2009）。

研究结果表明，MDA对线粒体呼吸功能、丙酮酸脱氢酶、α－酮戊二酸脱氢酶等
具有显著的抑制作用（龙建纲等，2005），它还可与DNA交联影响DNA的复制，从而影响蛋白质的合成。

测定MDA的含量可反映机体内脂质过氧化作用强弱，间接反映机体氧化损伤的程度。

本试验结果表明，肝脏组织中MDA含量随日粮铜添加量的增加而升高，这与肝脏组织SOD、GSH－Px活性变化规律相吻合。

高铜使肝脏组织内的SOD、GSH－Px活性降低，使机体对MDA等脂质过氧化产物的清除能力降低，导致线粒体损伤，启动细胞凋亡的物质外流，引起细胞凋亡的增加，造成肝脏的损伤。

3.3 高铜对肉鸡肝脏 GSH－Px活性的影响GSH－Px是机体内广泛存在的一种重
要的催化过氧化物分解的酶类。

同时GSH－Px是一种含硒蛋白，硒水平直接影响GSH－Px的活力（张在香等，2000；Lei等，1998），GSH－Px在GSH的参与下可清除过氧化氢和脂质过氧化物，抑制自由基的生成。

铜可通过微量元素间的吸收颉颃作用间接影响GSH－Px活性（贾宜昌等，2001）。

本试验结果表明，当
日粮铜含量为110mg／kg时，能增强肝GSH－Px活性，当日粮铜含量为
330mg／kg及以上时，肝GSH－Px活性下降。

其机理为一定剂量的铜能诱导肝GSH－Px活性增强，表现出较强的抗氧化作用，当铜毒性作用直接损害肝脏组织时，自由基和脂质过氧化产物含量增加，从而导致肝GSH－Px活性降低，清除自由基能力下降。

3.4 高铜对肉鸡肝细胞凋亡的影响细胞凋亡（apoptosis）是指机体在生理条件下受到刺激后，经过多种途径的信号传递导致细胞产生一系列形态和生化方面的改变而引起细胞自杀性死亡的过程，又叫程序性细胞死亡（programmed cell death，PCD）（Kerr等，1972）。

细胞凋亡的一个普遍而显著的特征就是细胞染色质的降解，产生约为180～200bp整倍数的DNA片段，这种DNA的有控降解是一种内源性核酸内切酶在核小体连接部位切断染色体DNA的结果，在琼脂糖凝胶电泳
上呈现特征的阶梯状条带（DNA Ladder）图谱，而坏死细胞DNA降解的断裂点为无特征的杂乱片段，在琼脂糖凝胶电泳上呈弥漫的连续图谱。

因此DNA Ladder的形成可作为判断细胞凋亡的重要标准。

目前国内外最为常用的凋亡定量检测方法是检测DNA断裂点的TUNEL法。

本试验采用 DNA Ladder法和TUNEL法两种方法检测高铜日粮下肉鸡肝细胞凋亡的情况，琼脂糖凝胶电泳结果显示饲养周期为10 d时，各试验组与对照组肝细胞DNA结构都没有发生明显的断裂呈DNA Ladder，表明细胞未发生凋亡；随着饲养周期的延长，逐渐呈现出比较明显的梯度裂解特征，饲养周期为40、50d时，高铜Ⅲ、Ⅳ组均出现有断裂呈DNA Ladder，表明此期细胞发生了凋亡。

而TUNEL法结果显示，随着日粮中铜含量的增加和饲养周期的延长，肝细胞凋亡率显著升高（P＜0.05）。

这与DNA Ladder所显示的结果基本一致。

参考文献
1 王劼，陈俊鹏，陈鹏，等.日粮添加荷叶提取物对黄羽肉鸡抗氧化功能及肌肉品质的影响［J］.中国畜牧兽医，2011，38（2）：17～20.
2 龙建纲，王学敏，高宏翔，等.丙二醛对大鼠肝线粒体呼吸功能及相关脱氢酶活性影响［J］.第二军医大学学报，2005，26（10）：1131～1135.
3 张在香，杨晓光，田园，等.大鼠谷胱甘肽过氧化物酶发挥最佳活性所需的最低饲料硒水平［J］.营养学报，2000，22（1）：47～51.
4 李成梅，苏荣胜，曹华斌，等.高铜对肉鸡肾脏线粒体抗氧化功能的影响［J］.中国兽医杂志，2009，45（3）：9～10.
5 贾宜昌，钟才云，王颖明，等.长期摄铝对大鼠海马铝、铁、锌含量和脂质过氧化的影响［J］.卫生研究，2001，33（3）：132～134.
6 Braude R.Some observations on the need for copper in the diet of fattening pigs［J］.Journal of Agriculture Science，1945，35：163～617.
7 Douglas J E，Johannes H P，Ann H，et al.Improving pharmacokinetic－pharmacodynamic models of muscle relaxants using potentiation modelling［J］.Pharmacokinetics Pharmacodynamics，2005，32（1）：143～154.
8 Hansson M，Asea A，Ersson U，et al.Induction of apoptosis in NK cells by monocyte－derived reactive oxygen metabolites［J］.Immunol，1996，156（1）：42～47.
9 Kerr J F，Wyllie A H，Currie A R.Apoptosis：a basic biological phenomenon with wide－raging implications in tissue kinetics［J］.Br Cancer，1972，26（4）：239.
10 Lei X G，Dann X G，Ross D A，et al.Dietary selenium supplementation is required to support full expression of three selenium－dependent glutathione perxiase in various tissues of weaning pigs［J］.Nutr，1998，128（1）：130～135.。