人精子表面蛋白P34H重组表达载体的构建及诱导表达

第10卷　第12期中华男科学杂志Vol.10　No.12 2004年12月National Journal of Andrology Dec.2004
·论著·
人精子表面蛋白P34H重组表达载体的构建及诱导表达
夏欣一,黄宇烽,高　云,朱照平
(南京军区南京总医院生殖遗传研究室,江苏南京210002)
摘要:　目的:获得纯化的人精子表面蛋白P34H用于基础和临床研究。

　方法:在克隆到P34H基因编码区全长
的基础上,将P34H基因亚克隆至原核表达载体pQE230中,构建重组表达载体pQE230/P34H。

将pQE230/P34H转化
至大肠埃希菌后,用异丙基2β2D2硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,通过Ni2NT A树脂进行亲和层析纯化上清中可溶性
形式的重组蛋白P34H。

对表达纯化重组蛋白的质粒进行DNA测序,并对重组蛋白P34H行十二烷基硫酸钠2聚丙
烯酰胺凝胶电泳(S DS2PAGE)分析,鉴定其是否为所需目的蛋白。

　结果:经PCR和双酶切鉴定,重组表达载体
pQE230/P34H为正确克隆。

S DS2PAGE和DNA测序证实,所获的重组蛋白确系所需目的蛋白。

　结论:用上述原核
表达的方法可获得纯化的人精子表面蛋白P34H。

关键词:精子蛋白;P34H;pQE230;原核表达;人类
中图分类号:Q51;R321.1 文献标识码:A 文章编号:100923591(2004)1220925203①
Construction of R ecombinant Expression V ector and Prokaryotic Expression of
Human Epididymal Sperm Protein P34H
X ia X inyi,Huang Y u feng,G ao Y un,Zhu Zhaoping
Laboratory o f Reproduction&G enetics,Nanjing G eneral Hospital o f Nanjing Command,P LA,Nanjing,Jiangsu 210002,China(Xia XY,Huang YF,Gao Y,Zhu ZP)
Correspondence to:Huang Yufeng,E2mail:yf huang@
Abstract:　Objective:T o acquire purified recombinant human epididymal sperm protein P34H for basic and clinical studies.　Methods:On the basis of cloning of P34H coding region,P34H fragment was subcloned into the pQE230expression vector.The recombinant expression vector designated pQE230/P34H was trans formed into E.coli to induce the expression of the recombinant protein P34H on the reduction of IPTG.A fter s onication,the recombinant protein P34H was purified from the supernant with Ni2NT A resin under native conditions.It was iden2 tified by S DS2PAGE analysis and DNA sequencing.　Results:Recombinant expression vector pQE230/P34H was correctly constructed,iden2 tified with PCR and double2enzyme digestion.And the results of S DS2PAGE analysis and DNA sequencing showed that the protein was what we had hoped to acquire.　Conclusion:Purified recombinant P34H can be acquired success fully with the above mentioned prokary otic expression method.　Natl J Androl,2004,10(12):9252927
K ey w ords:sperm protein;P34H;pQE230;prokary otic expression system;human
附睾分泌蛋白通过改变精子表面特性而参与其成熟过程,因此附睾及其分泌蛋白近年来倍受男科学研究者的关注[1～4]。

P34H是由人附睾上皮细胞分泌并定位于顶体部位的精子膜蛋白,属于短链脱氢酶/还原酶(S DR)超家族成员。

P34H能够介导精子与透明带结合,可作为附睾精子成熟的标志物,低
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①收稿日期:2004206230;修回日期:2004209220
作者简介:夏欣一(19782),男,江苏东台市人,技师,硕士,从事生殖医学及男科学专业。

通讯作者:黄宇烽,E2mail:y fhuang@
水平的附睾精子蛋白P34H与原发性男性不育显著相关。

因此,精子表面P34H的水平可以作为男性不育的一个辅助诊断指标[5]。

为了建立P34H的免疫学检测方法并探讨其在男性生殖系统中的意义,本文在克隆到P34H基因编码区全长的基础上[6],构建重组表达载体pQE230/P34H,进行诱导表达,并对表达的蛋白进行纯化和鉴定。

1　材料与方法
1.1　仪器和试剂　9600型PCR仪为PE公司产品,
H ofer miniVE垂直电泳系统为Pharmacia公司产品,超声粉碎仪为S onics公司产品。

宿主菌大肠埃希菌DH5α及测序载体p GE M2T/P34H均为本室保存,M15 (pREP4)宿主菌与pQE230质粒均为南京师范大学生化与生物制品研究所吴一凡博士惠赠。

限制性内切酶Bam H I、Hin dⅢ、T4DNA连接酶、DNA纯化试剂盒以及异丙基2β2D2硫代半乳糖苷(IPTG)均购自Promega公司,DNA和蛋白质相对分子质量(M r)参照物分别购自T aK aRa公司和上海东风生化试剂厂, Ni2NT A His2Bind树脂购自Novagen公司。

其他试剂均为分析纯。

1.2　重组表达载体pQE230/P34H的构建与鉴定　分别对测序载体p GE M2T/P34H和表达载体pQE230用Bam H I和Hin dⅢ进行双酶切,反应体系为:10×bu ffer5μl,质粒20μl,Bam H I1μl,Hin dⅢ1μl,补水至50μl。

0.8%的琼脂糖电泳酶切产物,用DNA 纯化试剂盒按说明书操作进行切胶回收,分别回收750bp目的基因P34H和线性化的pQE230,将得到的DNA片段分别溶于30μl双蒸水中。

将纯化的目的基因P34H和线性化的pQE230用T4连接酶进行连接反应,反应条件为:目的基因P34H3μl,线性化的pQE1μl,T4DNA连接酶0.5μl,连接酶缓冲液5μl,加水至10μl,16℃反应过夜。

转化大肠埃希菌DH5α(感受态细菌),用氨苄抗性筛选重组子,提取重组质粒DNA,进行PCR和Bam H I和Hin dⅢ双酶切鉴定。

1.3　重组蛋白P34H的诱导表达与纯化
1.3.1　重组蛋白P34H的诱导表达　重组质粒pQE230/P34H转化的大肠埃希菌M15(pREP4),接种于5ml含氨卞青霉素和卡那霉素的LB液体培养液中,37℃活化过夜后,按2%(V/V)接种于含氨卞青霉素和卡那霉素的新鲜LB培养液中,培养2～3h 至A600为0.4～0.6(对数生长期中后期),加IPTG至终浓度为0.5mm ol/L诱导表达重组蛋白,于20℃下继续培养8h,收集菌体,重悬于0.01m ol/L P BS(pH 7.4)中,-20℃冻融3次,超声裂解细菌,行15%的十二烷基硫酸钠2聚丙烯酰胺凝胶电泳(S DS2 PAGE)。

1.3.2　重组蛋白P34H的纯化　由于包涵体中的重组蛋白需要在变性条件下纯化,而且纯化的蛋白较难复性,所以本实验仅在非变性条件下纯化了上清中可溶性形式的目的蛋白。

应用Ni2NT A His2Bind 树脂纯化可溶性形式P34H蛋白,按照Novagen公司的操作手册进行。

Brad ford法[7]测定蛋白浓度。

1.3.3　重组蛋白P34H的鉴定　通过对重组表达载体pQE230/P34H进行DNA测序以及对纯化的重组蛋白进行S DS2PAGE分析,鉴定获得的重组蛋白是否为所需要的目的蛋白。

2　结果
2.1　重组表达载体pQE230/P34H的构建与鉴定　随机挑取10个氨苄抗性菌落,提取质粒后进行PCR 扩增,均为阳性。

为了确证外源基因的存在,用Bam H I和Hin dⅢ进行双酶切鉴定,在750bp处可见目的条带(图1)。

图1　重组质粒pQE230/P34H的双酶切鉴定
1:DNA M r参照物;2:重组表达载体pQE230/P34H;3:Bam H I和Hin d III双酶切重组表达载体
Figure1.Identification of pQE/P34H by digestion with Bam H I and Hin d III
1:DNA marker(D L2000);2:pQE230/P34H;3:pQE230/P34H digested with Bam H I and Hin d III
2.2　重组蛋白P34H的诱导表达与纯化　在低温、低诱导剂浓度条件下培养重组菌,使重组蛋白尽量以可溶性形式表达,菌体破碎后用镍离子金属螯合层析纯化。

纯化后蛋白用15%S DS2PAGE电泳,可见M r27000左右的目的条带(图2)。

Brad ford法测定蛋白浓度为2.0g/L。

2.3　重组蛋白P34H的鉴定　对重组表达载体pQE230/P34H进行DNA测序的结果与测序载体
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图2　重组蛋白P34H纯化的S DS2PAGE分析
1:蛋白质M r参照物;2:未被诱导的重组菌;3:诱导的重组菌;4:纯化的重组蛋白
Figure2.S DS2PAGE analysis of recombinant protein P34H purifica2 tion
1:protein m olecular weight markers;2:non2induced recombinant vector/
M15;3:induced recombinant vector/M15;4:purified recombinant protein P34H
p GE M2T/P34H的测序结果完全一致。

对纯化的重组蛋白行S DS2PAGE分析,显示1条M r为27000左右的单一条带,与理论值一致。

因此,所获的重组蛋白确系所需目的蛋白。

3　讨论
pQE表达系统是一种操作方便的高效原核表达系统。

pQE230表达载体属于PDS质粒家族,是一种低拷贝质粒,由噬菌体T5启动子和两个乳糖操纵子序列构成最适启动子2操纵子成分,有合成核糖体的结合位点以确保高转录效率,有转录终止密码子以保证转录的及时终止。

同时它含有6×His编码序列,这对重组蛋白的纯化相当重要,它使重组蛋白的N端产生6×His,通过金属离子的螯合作用,带6×His的重组蛋白就可以连接到Ni2NT A琼脂柱上,经过洗涤和洗脱获得高纯度的重组蛋白。

而且6×His 短肽的抗原性极弱,不影响目的蛋白的抗原性。

M15宿主菌中带有pREP质粒,提供了lac操纵子的反式调控元件,能够持续表达大量lac阻遏蛋白以有效调节pQE230表达载体中外源蛋白的表达,并且该质粒含p15A复制起始点,能够与使用C olE1的质粒共存,所以pQE表达系统能够使目的基因无基础水平表达,有效消除了毒性基因产物引起的质粒不稳定性。

另外,pREP质粒还提供卡那霉素抗性,有利于阳性克隆的抗性筛选。

本实验应用分子克隆的方法成功地构建了pQE230/P34H重组表达质粒,并获得了高效表达。

经过Ni2NT A柱后,重组蛋白的6
×His标记与Ni2ΝΤΑ柱上的Ni2+特异性结合,洗脱后S DS2PAGE结果显示1条M r为27000左右的单一条带,说明重组P34H蛋白已被高度纯化。

由于P34H是新发现的蛋白,对该蛋白的研究刚刚起步,其确切的生物学活性尚不清楚,因此,无法对其生物学活性作鉴定。

而且,目前市场上还无法购买到抗P34H的特异性抗体,所以也无法对表达的蛋白作Western印迹分析。

因此,本研究对重组表达载体DNA测序以及对纯化的重组蛋白进行S DS2PAGE分析,鉴定获得的重组蛋白是否为所需要的目的蛋白。

P34H cDNA全长为912bp,其中包含732bp的开放阅读框架(ORF)。

天然状态下P34H 的M r为34000,含有3个N2型糖基化位点。

而由于本实验应用的是原核表达系统,不能对重组蛋白进行糖基化等翻译后加工修饰,故表达产物(6×His)的M r约为27000。

P34H是由人附睾上皮细胞分泌并定位于精子顶体部位的精子表面蛋白,体外实验表明,P34H的抗体能够抑制精子与透明带的结合,而不影响精子的运动能力、顶体反应及精卵融合等。

P34H能够介导精子2透明带结合,可作为附睾精子成熟的标志物,低水平的附睾精子蛋白P34H与原发性男性不育显著相关。

因此,精子表面P34H的水平可以作为男性不育的一个辅助诊断指标。

另外,有文献报道,附睾精子蛋白P34H和人肾脏的双羰基/L2木酮糖还原酶(DCXR)可能是同一个蛋白[8],提示该蛋白可能与一些肾脏疾病有关。

本实验通过基因工程技术获得了大量重组P34H蛋白,为下一步制备特异性抗体,建立P34H的检测方法,进行后续的基础和临床研究打下了基础。

参考文献
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[5]　夏欣一,黄宇烽,许晓风.附睾精子蛋白P34H与男性生殖
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[6]　夏欣一,许晓风,高　云,等.人精子表面蛋白P34H的基因克
隆及其在睾丸和附睾中表达分析[J].中华男科学,2003,9
(1):24227.
[7]　汪家政,范　明主编.蛋白质技术手册[M].北京:科学出版
社,2000.42246.
[8]　Nakagawa J,Ishikura S,Asamij,et al.M olecular characterization of
mammalian dicarbonyl/L2xylulose reductase and its localization in
kidney[J].J Biol Chem,2002,277(20):178********.
(王书奎　编发)
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